Name: 扩展轴突转运体内成像工具包 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解利用转基因荧光小鼠在体坐骨神经中实时成像信号内体和线粒体轴突转运的方法。该技术可评估药物治疗和基因疗法对运动与感觉神经元轴突运输的影响，为研究神经退行性疾病机制提供重要工具。

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我们感谢伦敦大学学院惠康信托神经病学研究所的 Robert M. Brownstone 分享了 ChAT-eGFP、ChAT.Cre 和 Rosa26.tdTomato 小鼠，以及同一研究所的 Pietro Fratta 分享了 HB9.GFP 小鼠。我们感谢伦敦大学学院惠康信托神经病学研究所的 Elena R.&#160;Rhymes、Charlotte J.P. Kremers 和 Qiuhan Lang 对手稿的审阅。本研究得到了英国运动神经元疾病协会（Motor Neuron Disease Association）青年非临床研究员项目（Tosolini/Oct20/973-799）（APT）、惠康信托资深研究员奖（107116/Z/15/Z 和 223022/Z/21/Z）（GS）、英国痴呆症研究中心基础项目（GS）以及英国医学研究理事会职业发展奖（MR/S006990/1）（JNS）的资助。

所有小鼠操作和实验均按照《动物（科学程序）法案》（1986年）进行，并已获得伦敦大学学院-女王广场神经病学研究所伦理委员会的批准。
1. 动物
<ol>
	<li>将所有动物饲养于温度和湿度可控环境中的独立通风笼具内，并保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件，同时提供 随意摄取 食物和水的获取</li>
	<li>使用以下转基因品系的雄性和雌性小鼠：1）杂合型 Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd 小鼠，简称 ChAT.eGFP 小鼠；2）杂合型 B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J 小鼠，简称 HB9.GFP 小鼠；以及 3）杂合型 B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J 小鼠，简称 Mito.CFP 小鼠。</li>
	<li>通过将纯合的 B6;129S6-ChAT.tdTomato 小鼠与相应品系小鼠杂交来获得 ChAT.tdTomato 小鼠聊天tm2(cre)Lowl/J，称为ChAT.Cre小鼠，与纯合的B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J，称为 Rosa26.tdTomato 小鼠。</li>
	<li>通过将杂合的 ChAT.tdTomato 小鼠与杂合的 Mito.CFP 小鼠杂交，获得 ChAT.tdTomato::Mito.CFP 小鼠。</li>
</ol>
2. 荧光 HCT 的肌内注射
<ol>
	<li>术前准备
	<ol>
		<li>表达 HCT（HCT441，残基875-1315）在细菌中以谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的形式，与一种改良的富含半胱氨酸标签融合表达，方法如下 45. 标记 HCT 与 AlexaFluor555 C2 马来酰亚胺31，将其在预冷的透析缓冲液（10 mM HEPES-NaOH，100 mM NaCl，pH 7.4）中透析，用液氮速冻，并于 -80 °C 保存。在进行之前 体内 实验，首先测试 HCT 体外 在初级神经元中实现成功摄取和运输。</li>
		<li>稀释荧光HCT（例如，HCT-555) 加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，最终配制成浓度为 2.5 至 10 µg/µL 的实验一致浓度，总体积置于 0.2 mL 离心管中。在此步骤中，可向 H 中添加其他化合物/因子C必要时添加T溶液（例如，脑源性神经营养因子）。 
		注意：最终体积必须适合目标肌肉的大小。例如，胫骨前肌（TA）肌肉的注射体积为 3–4 µL，较小的比目鱼肌则为约 1 µL。保持 H 的工作浓度CT 在 2.5 至 10 µg/µL 之间，与最终体积无关。</li>
		<li>混合 HC用移液器或涡旋振荡器混匀T溶液，然后使用台式离心机低速短暂离心，以收集液体并去除大气泡。保护HC避光并冰上运输。</li>
		<li>使用拉制的玻璃微量移液管对较小肌肉（如比目鱼肌）进行肌内注射，或用于坐骨神经内注射。根据 46手术前 
		&#8203;注意：为便于移液并防止液体从微量移液器后端溢出，在解剖显微镜下使用精细镊子小心折断尖端锋利处的一小段。请务必妥善处理折下的尖端，弃置于指定废弃物容器中。</li>
		<li>使用前对所有外科手术器械进行灭菌和清洁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术—肌肉内注射
	<ol>
		<li>在设定为37°C的加热垫上固定无菌手术巾，以准备手术。调整并聚焦手术显微镜。开始手术前，将预先灭菌的手术器械、手术胶带、无菌棉签、70%（v/v）乙醇水溶液、无菌生理盐水、缝线以及Hamilton针或拉制的玻璃微量移液管置于手术巾上。</li>
		<li>确保麻醉机在手术过程中有充足的氧气和异氟烷。将麻醉气体流向导至诱导室，并打开麻醉机。
		<ol>
			<li>首先，使用1-2 L/min的氧气流速和5%异氟烷。将小鼠放入诱导室以开始麻醉。当翻正反射消失时，将麻醉浓度降至2-3%异氟烷，将麻醉气流导向口鼻罩，并将小鼠转移至手术区域另一位置的口鼻罩处。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>确保角膜和足底回缩反射均消失后，再剃除拟注射肌肉区域的毛发。操作完成后，使用手术胶带的黏性面尽可能去除小鼠身上的剃除毛发，并将小鼠置于电子天平上记录术前体重。</li>
		<li>使用棉签小心涂抹眼药膏，然后将小鼠和咬嘴转移至手术区域。 
		注意：尽量减少被剃除的毛发转移到手术区域。使用手术胶带将小鼠头部固定在咬嘴上，以防小鼠滑脱。另取一根棉签，将乙醇涂抹于剃毛区域，以消毒并减少毛发污染。</li>
		<li>根据需要注射的肌肉调整小鼠体位。例如，注射胫骨前肌（TA）时，将小鼠仰卧放置，并将后肢从中线向外伸展约10°。若注射比目鱼肌（soleus），则将小鼠侧卧，后肢从中线向外伸展约45°。当后肢处于正确位置后，用手术胶带固定足部，以防止手术过程中发生不必要的移动。 
		&#8203;注意：TA、腓肠肌和比目鱼肌的注射操作步骤此前已有详细描述32.</li>
		<li>在进行切口前，通过测试足部回缩反射确认麻醉是否充分。在整个手术过程中持续监测麻醉状态，并定期评估呼吸和回缩反射，以维持适当的麻醉深度。</li>
		<li>此时，吸取工作液 HC将T溶液注入Hamilton注射器或拉制的玻璃微量移液管中。</li>
		<li>在与运动终板区域相对应的感兴趣肌肉部位做一小切口46,47,48. 穿透肌肉的外部筋膜，缓慢注射 HCT 如下所述 32将注射器/微量移液器保持在原位5-10秒，然后缓慢抽出。</li>
		<li>用1-2针缝合切口，并将小鼠转移至独立的恢复笼中。术后至少监测小鼠30分钟，然后将其放回饲养笼。当小鼠成功恢复且术后监测完成后，将笼子恢复至正常饲养条件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 体内轴突运输
<ol>
	<li>暴露坐骨神经
	<ol>
		<li>在成像前至少1小时，将显微镜环境培养室设置为37 °C。</li>
		<li>准备暴露坐骨神经，将手术巾、器械、胶带、无菌棉签、70%乙醇和无菌生理盐水置于手术区域周围。确保麻醉机为每只小鼠提供长达2小时的充足氧气和异氟烷供应。将Parafilm或透明胶带裁剪成带斜尖的窄长方形（例如，较大鼠只约为1 cm宽），制成楔形物，置于暴露的坐骨神经下方，以辅助成像过程。将诱导室放置在加热垫上，并调节至体温水平。 
		注意：4 小时已足够完成 HCT 已从注射部位被摄取并逆行运输至坐骨神经；因此，单只小鼠在此时间后即可准备再次麻醉。</li>
		<li>将麻醉气体导入诱导室，开启麻醉机，调节氧气流速为1-2 L/min，异氟烷浓度为3-4%，将小鼠放入诱导室以开始麻醉。 
		注意：由于 体内 轴突运输实验为终末性操作，无需润滑眼睛。</li>
		<li>当翻正反射消失后，将麻醉剂异氟烷浓度降低至2-3%，将麻醉气流导向面罩，并将小鼠转移至面罩处。使用手术胶带将头部固定于面罩上，将目标后肢从身体中线向外展开约45°，并用手术胶带固定足部以维持该体位。 
		注意：此时减少麻醉剂量是有利的，因为可以限制成像过程中呼吸伪影的影响。</li>
		<li>确保角膜和足底回缩反射消失，然后用剪刀剪除坐骨神经表面的皮肤32 即.，范围较大的区域，从脊髓中央延伸至后肢中下部）。去除覆盖在上面的股二头肌，以及靠近坐骨神经的其他肌肉和结缔组织。操作时应避免损伤坐骨神经及其周围的血管，尤其是位于髌骨外侧/腓肠肌外侧头近端附近的血管。</li>
		<li>当坐骨神经充分暴露后，将预热的无菌生理盐水滴加至坐骨神经周围，以防止组织干燥。使用弯头镊子分离深层结缔组织，并将预先制备好的Parafilm“楔形片”置于神经下方。操作完成后，用生理盐水浸湿的棉球覆盖暴露区域，将小鼠移入位于加热垫（设定为37 °C）上方的诱导室，诱导室内应仍充满异氟烷与氧气混合气体2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体内 轴突成像
	<ol>
		<li>将一块 22 × 64 mm 的盖玻片置于定制的显微镜载物台上，并用胶带固定其位置。选择合适的物镜并滴加浸油，然后将显微镜载物台连接至倒置显微镜。缓慢升高浸油物镜，直至浸油与盖玻片接触。 
		注意：可使用40倍、数值孔径（NA）1.3的DIC Plan-Apochromat油浸物镜或63倍、数值孔径（NA）1.4的DIC Plan-Apochromat油浸物镜进行成像 体内 坐骨神经中的运输</li>
		<li>将麻醉面罩移至显微镜载物台上，并用胶带固定麻醉管路，以防干扰麻醉过程。移除坐骨神经周围的棉球，将小鼠从诱导室转移至面罩，使暴露的神经面向盖玻片。使用手术胶带固定小鼠头部，确保其稳定，并维持最低有效麻醉水平。轻轻抓住小鼠尾巴将其提起，在暴露的坐骨神经附近的盖玻片上滴加无菌生理盐水，以防止干燥并利于成像。 
		注意：关闭环境室的所有门，以确保内部区域保持在体温水平。</li>
		<li>使用目镜定位坐骨神经，确定最佳焦平面，并选择含有可移动轴突细胞器的兴趣区域。 
		注意：该过程的详细说明此前已有描述32.</li>
		<li>单击以切换到计算机软件 采集 按钮（或等效控件），并选择感兴趣的区域。使用数字变焦，以获得总共 &#62;80倍放大并旋转选定区域，以水平方向观察轴突（例如，从右向左移动的逆行运输货物和从左向右移动的顺行运输货物）。 
		注意：方向性参数由用户决定，但在整个实验过程中必须保持一致。</li>
		<li>通过调整参数（如信号强度）来优化 激光强度（0.2 - 1%），针孔孔径（1 AU - 最大），增益（主控）（700 - 1000），数字偏移（-50 - 0），以及 数字增益（1.0 - 4.0）. 为减少光毒性潜在影响，应维持 激光强度不超过1% 在可能的情况下，使用 最大激光强度 的 2%在调整激光强度以获得最佳信号检测之前，先设置好所有其他参数。</li>
		<li>点击 区域 方框（或等效工具），选择一个矩形兴趣区域，然后在 采集模式 （或等效物），设置 帧大小 至少 1024 x 1024 像素，开始采集100-1,000帧的时间序列图像。 
		注意：所需的帧采集速率取决于用户需求（例如，可通过每0.1至6秒一帧的帧率评估运输过程），并可通过软件参数进行调整，例如 感兴趣区域，扫描速度时间，采集平均，以及 激光方向性例如，要获得较慢的帧速率，可增大兴趣区域的高度/宽度，降低扫描速度，增加采集平均次数，并使用单向激光扫描。 反之亦然 以实现更快的帧率。该 帧采集速率 在可比数据集之间必须保持一致，因为在不同频率下成像可能导致不一致。&#160;快速的运输载体（如信号内体）需要更高的帧率（例如 0.1–3 秒），而较慢的细胞器（如线粒体）则可采用较低的帧率（例如 2.5–6 秒）进行分析。</li>
		<li>每只小鼠至少从三条轴突中捕获不少于10个运动性货物。 
		注意：根据双样本、双侧检验效能计算（标准效能为 0.8 (1−β)，Ⅰ类错误率 5% (α)），每组 6–8 个样本足以识别野生型与疾病模型之间的轴突运输差异35,43.</li>
		<li>成像完成后，实施安乐死&#160;小鼠在麻醉状态下立即处死（例如，颈椎脱臼法）。死后组织，如肌肉和坐骨神经，也可采集用于进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无利益冲突。

本方案详细说明了评估的步骤 体内 小鼠坐骨神经完整轴突中信号内体和线粒体的轴突运输。事实上，本文提供了一种实验装置，使用户能够 1）区分运动神经元与感觉神经元 体内，原位，以及 离体 通过使用在运动神经元中选择性表达荧光报告蛋白的小鼠；2）评估 体内 利用三种不同的转基因小鼠特异性研究运动神经元轴突中信号内体的轴突运输；3）研究 体内 运动神经元轴突中线粒体的轴突运输；以及4）同时评估 体内 同一轴突内信号内体与线粒体的运输动态。该方法在基础条件下研究轴突运输方面具有广阔的应用前景，并可用于评估影响周围运动神经和感觉神经的不同疾病中的病理扰动。
以既往实验范式为基础31,32，本文详细阐述了利用转基因报告小鼠区分运动神经元与感觉神经元中轴突运输的新型、稳健方法。通过使用 Mito.CFP 小鼠，该方法进一步优化，可在避免对坐骨神经注射 TMRE36 的情况下评估&#160;体内线粒体运输。这避免了因神经内注射探针可能造成的神经损伤及轴突运输干扰。此外，本方案可实现对支配具有不同生理特性的肌肉的运动轴突中多种细胞器轴突运输的可视化（例如，快缩易疲劳肌肉与慢缩抗疲劳肌肉）。因此，可在不同亚群的 α-运动神经元中评估信号内体和/或线粒体的轴突运输动态44。此外，通过与不同神经退行性疾病小鼠模型杂交，也可在病理条件下评估这些细胞器的轴突运输1,2,3。
轴突运输工具包正在不断扩展28,29，已有研究开发出离体（ex vivo）实验方案，用于评估培养的小鼠腹角组织块49或分离的小鼠神经-肌肉标本50中的运输动力学。此外，针对诱导性人多能干细胞（hiPSC）来源的皮层神经元51或hiPSC来源的脊髓运动神经元52中轴突运输的检测方案也已建立，使得研究人员能够探究携带致病突变的人类神经元。这些在小鼠组织和人类细胞中应用的前沿技术方案，可为神经元功能提供关键见解，有助于在神经退行性疾病模型中发现新的病理机制，并可用于测试治疗性分子和干预策略。
若干 关键步骤 需要遵循若干关键步骤才能成功实施这些技术，方案部分已提供一些重要注意事项。活体成像的主要要求包括配备定制化载物台插件的倒置共聚焦显微镜，以及用于维持麻醉和最佳温度的设备。实际上，需要一种专用的移动式麻醉系统，用于：1）诱导麻醉；2）解剖/组织处理（即.，暴露坐骨神经），以及3）在活体成像过程中维持麻醉状态（如前文所述） 31,32）。尤其是在使用高倍物镜（例如 40x 或 63x）时，麻醉深度会影响成像质量，因为较深的麻醉会引发大幅度的“喘息样”呼吸，导致频繁的焦距偏移。此类大幅度运动必然会影响成像后的运输分析（例如，使用 Fiji 插件 TrackMate 追踪货物）53 或 KymoAnalyzer54）因为呼吸运动会时间延时视频中产生伪影，可能导致视频无法使用&#160;对于自动化追踪而言较为困难，或需要耗时更长的评估。此外，我们还观察到坐骨神经内搏动的动脉所引起的成像伪影，此类问题只能通过选择不同的成像区域来解决。显微镜必须配备能够维持恒定体温的环境培养舱，因为温度和pH值会影响轴突运输。55此外，应避免在术后使用镇痛药，因为它们可能改变转运动力学56. 如果实验设计为纵向研究并需要进行重复成像（例如，57），解剖方案需要进行适当调整，以尽量减少侵入性，且可能需要额外的伦理/许可审批。
必须牢记某些实验注意事项。首先，本文详述的大多数方案涉及使用在线粒体或运动神经元轴突中表达荧光报告蛋白的转基因小鼠。这些小鼠品系均应以半合子/杂合子形式进行繁育和成像。但有两个例外：ChAT.Cre 和 Rosa26.tdTomato 小鼠品系可分别以纯合子形式单独保种，其杂交后产生的半合子后代可通过 Cre-loxP 重组实现在胆碱能神经元中表达 tdTomato。当将一种转基因半合子/杂合子小鼠（例如 Mito.CFP）与另一种转基因半合子/杂合子小鼠（例如 ChAT.eGFP）杂交时，需仔细规划繁育策略，因为获得所需数量的双突变后代可能耗时较长。此外，当将 ChAT.Cre 与 Rosa26.tdTomato 小鼠的 F1 代（即.，ChAT.tdTomato）再与其他转基因品系（例如 Mito.CFP）杂交时，预期获得携带目标三种转基因的个体数量将更少。同时，还需考虑当两种荧光报告小鼠的激发/发射波长相近时可能存在的荧光重叠问题（例如 Mito-CFP：激发 435 nm，发射 485 nm；与 ChAT.eGFP：激发 488 nm，发射 510 nm 配对），尽管可通过光谱解混技术克服这一问题58。
该技术具有一些 局限性 需要予以考虑。在本研究及我们先前的方案中31,32我们已展示了如何利用多种基因编码标记物和不同染色方法对特定细胞器进行标记与示踪 体内然而，并非所有探针都适用于该实验方法。我们评估了在成像前约4小时向胫骨前肌（TA）或比目鱼肌注射霍乱毒素β亚基（CTB）-488（0.5–1.5 µg/µL）的效果，该探针常用于标记运动神经元胞体 体内 逆行示踪实验59,60。然而，当单独注射或与 H 共同注射时CT-555 中，尽管使用的浓度与成功逆行标记运动神经元时所用的浓度相似，CTB-488 的标记效果仍较差。因此，我们得出结论：尽管 CTB 是一种优异的 体外 神经元培养物中信号内体的标记物61，HCT 仍是鉴定信号内体的金标准探针 体内 在坐骨神经轴突中。
通过不同途径，我们还测试了常用于标记溶酶体的探针，如 LysoTracker Green DND-26，以及用于标记活性溶酶体水解酶的标志物，如用于组织蛋白酶 D 的 BODIPY-FL-胃蛋白酶抑制剂 A62 以及用于组织蛋白酶B的Magic Red，但均未成功。我们尝试了肌内注射BODIPY-FL-pepstatin A（2.5 µg注入胫骨前肌，成像前约4小时），以及坐骨神经内注射&#160;在成像前30-60分钟，向神经注射2 µL的LysoTracker（10 µM）、BODIPY-FL-pegstatin A（10 µM）或Magic Red（1/10）。尽管这些探针能够标记神经，但我们未能观察到清晰标记的细胞器。这些探针在轴突周围聚集，可能被施万细胞保留。因此，溶酶体标记失败可能是由于探针未能有效递送至神经元内，尽管也不能排除存在更适宜浓度的可能性。鉴于TMRE标记在类似条件下可以成功（即.，坐骨神经内&#160;神经注射）的标记强度可能依赖于染料，需针对每种标记物单独进行测试。然而，我们得出结论：靶向溶酶体 体内 在上述浓度下，使用这些探针是不可行的。
麻醉方法可能改变不同的生理读数（例如，耳蜗功能63 和皮层电生理64）；然而，目前尚不清楚麻醉是否会影响坐骨神经中 体内 的轴突运输。鉴于异氟烷诱导麻醉下神经肌肉活动减少，运输动力学可能与清醒状态存在差异。然而，唯一一项直接研究该问题的 体内 研究表明，丘脑皮层投射中致密核心囊泡的运输在麻醉与清醒小鼠之间并无差异65。此外，由于在野生型与疾病模型小鼠之间运输差异在麻醉状态下仍可被检测到35,43，显然异氟烷暴露并不会阻碍对信号内体或线粒体运输异常的识别。
本方案具有其他潜在应用，如下所述。将本方案中所述的转基因小鼠（例如 Mito.CFP、ChAT.eGFP）与神经退行性疾病小鼠模型1,2,3进行杂交，可实现对特定神经元亚型和/或特定运输货物的深入研究。此外，近年来开发的小鼠 Cre 品系66也可用于在不同感觉轴突群体中可视化荧光报告蛋白。例如，Rosa26.tdTomato 小鼠可与表达神经肽Y受体-2（Npy2r).Cre 的小鼠杂交，从而在有髓鞘A纤维伤害性感受器中实现 tdTomato 荧光标记67。此外，通过使用可诱导的 Cre 系统（例如他莫昔芬）68，还可实现时间上的精确控制。另一项潜在应用依赖于表达荧光报告蛋白的施万细胞转基因小鼠。事实上，S100-GFP69 和 PLP-GFP70 小鼠能够实现施万细胞的体内和/或原位成像，已在周围神经再生过程中施万细胞迁移的相关研究中处于前沿地位。
除了这些应用之外，Mito.CFP 小鼠还可与多种表达荧光蛋白的转基因小鼠品系配合使用，这些品系可在不同细胞器（如线粒体和自噬体）中特异性表达荧光蛋白。例如，可利用这些模型研究 在体 线粒体运输可能通过 mito::mKate2 小鼠实现71 或光转换型 mitoDendra 小鼠57此外， 体内 使用pH敏感的mito-Keima小鼠可能实现线粒体自噬体的运输研究72 和 mito-QC 小鼠73 用于线粒体自噬分析。此外，我们遇到的溶酶体标记困难问题可通过使用表达LAMP1-GFP的小鼠来克服，但需注意LAMP1也存在于与溶酶体不同的内吞细胞器中。74.
总之，我们提供了评估的新方法 体内 来自多种转基因小鼠特定外周神经轴突中多种细胞器的轴突运输。鉴于近期发现线粒体和内体等细胞器在轴突内存在相互作用和共运输现象，对不同细胞器进行同步成像将尤为重要。75,76我们相信，所展示的方法将有助于增进对轴突基础生理学的理解 在体 并解析驱动周围神经变性的关键病理机制。

周围神经系统（PNS）将中枢神经系统（CNS）与其远端靶器官相连，从而实现传出信号的传递以施加运动控制，以及传入信号的反馈以提供感觉信息。借助小鼠遗传学领域的众多进展，科学家已开发出多种小鼠模型，用于研究影响PNS的多种疾病/综合征1,2,3。由于大多数神经退行性病变具有多因素特性，并涉及细胞自主性和非自主性的作用4,5，解析细胞/神经元特异性的病理变化可为疾病机制提供关键且新颖的见解。
为此，细菌人工染色体（BAC）转基因小鼠的开发6实现了荧光蛋白在特定神经元亚群中的选择性内源性表达。例如，已有可表达绿色荧光蛋白（GFP）的BAC转基因小鼠，用于标记胆碱能7或甘氨酸能神经元8，或在甲状旁腺素阳性神经元中表达红色荧光蛋白变体（tdTomato）9。另一种方法是通过Cre-loxP技术实现神经元中荧光蛋白的选择性表达10。例如，可将特定神经元亚群表达Cre重组酶的小鼠品系（如胆碱乙酰转移酶（ChAT）-Cre）与另一品系小鼠杂交，后者在转录抑制子控制下、于loxP位点两侧包围的组成型位点（如Gt(ROSA)26Sor）表达荧光蛋白（如tdTomato或GFP）11（从而获得仅在胆碱能神经元中表达tdTomato的小鼠）。事实上，利用Cre-loxP重组技术，已成功构建出在下行皮质脊髓束轴突中表达黄色荧光蛋白的转基因小鼠12。
此外，CRISPR/Cas9 基因编辑技术的最新进展（例如 ORANGE）能够对多种内源性神经元蛋白进行荧光标记，并可在纳米级分辨率下实现表达13。而且，结合表达 Cre 的小鼠品系，ORANGE-CAKE 可用于在单个神经元中标记多种内源性蛋白13。 alternatively，病毒介导的神经元示踪技术也可实现对特定神经元亚群的标记，并可通过靶向组合不同的病毒血清型和/或细胞特异性启动子来实现14,15,16,17。
除了神经元标记方法外，还构建了转基因小鼠品系，使其表达靶向特定细胞器的报告蛋白，例如表达青色荧光蛋白的线粒体（Mito.CFP）18 或表达 GFP 的自噬体（LC3.GFP）19此外，已构建转基因小鼠品系以特异性评估神经元中的钙动力学（例如., Thy1.GCaMP20,21总之，随着这些模型的不断进步，新的实验应用使科学家能够针对中枢神经系统和周围神经系统提出更为精确的生物学与病理学问题。
外周运动神经的主要功能是向骨骼肌传递电信号以引发运动。此外，在更长的时间尺度上，多种形式的细胞器（例如线粒体、内溶酶体、信号内体）以单向或双向方式沿细胞骨架网络传递神经化学和生理信号，以帮助维持神经元的稳态22,23,24。轴突运输功能受损将对神经元健康造成严重后果，并与多种神经发育和神经退行性疾病相关25。在分子水平上，轴突运输障碍可破坏调控突触信号传导与可塑性、基因转录以及轴突内局部翻译等生理过程26,27。尽管已有大量工具可用于研究培养细胞/神经元中的这些事件28,29，但要深入理解生理与病理过程的关键机制，仍需在活体（in vivo）条件下评估&#160;轴突运输动力学及与轴突相关的生物学事件30。
多年来，Schiavo 实验室已优化了多种实验方案，以探究轴突运输中的各类问题31,32,33,34,35,36这些实验的开展源于一项发现，即破伤风神经毒素的一个无毒片段（HCT）通过与基底蛋白聚糖和多唾液酸神经节苷脂的相互作用被内化至骨骼肌的轴突末梢37. 内化后，HCT 在含有神经营养因子、携带 Rab7 的信号内体中进行逆向运输，这些信号内体将被运往运动神经元和感觉神经元的细胞体38,39,40,41与此同时，成像技术的进步使得能够在活体麻醉小鼠中实时分析外周神经束及单个轴突30首次尝试评估 体内 SOD1 病理中轴突运输动态揭示信号内体和线粒体运输的临床前功能障碍G93A 肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠模型35重要的是，考虑到在肯尼迪病的小鼠模型中，运动神经元的丢失可能在没有轴突运输障碍的情况下发生，这些缺陷不太可能是神经退行性变的继发性后果。42 和一种杂合突变FUS的肌萎缩侧索硬化症模型43此类轴突运输缺陷可通过使用特定激酶抑制剂在ALS小鼠模型中得到改善33 或生长因子受体34此外，用一种特异性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理神经元会改变线粒体的运输 体内36最近，我们报道了在肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠的不同运动神经元亚型中，脑源性神经营养因子（BDNF）依赖的轴突运输调节功能发生紊乱。44.
通过使用不断扩展的轴突运输动力学评估工具包28,29，本视频方案概述了若干应用，这些应用将有助于进一步深入了解不同的生物学与病理学情境。首先，选择性在胆碱能神经元中表达荧光蛋白的转基因小鼠（即., 运动神经元）用于区分运动轴突和感觉轴突 体内 和 离体. 荧光标记的 HC随后，将T加载到三种转基因品系的信号内体中，以区分不同外周神经元中的轴突运输动态。下一个实验方案详细介绍了通过将ChAT.tdTomato小鼠与Mito-CFP小鼠杂交，利用多重荧光方法特异性评估运动神经元中线粒体运输的技术。最后，提供了在同一轴突内同时成像线粒体和信号内体的操作指南。 体内.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL PCR管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%（v/v）乙醇水溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFlour555 C2 maleimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-20346</td><td>也可使用 AlexaFluor-488 或 -647 马来酰亚胺</td></tr><tr><td>B6.Cg-&lt;em&gt;Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm9(CAG-tdTomato)Hze&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;/</td><td>杰克逊实验室</td><td>7909</td><td>Rosa26.tdTomato 小鼠</td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>5029</td><td>HB9.GFP 小鼠</td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>7967</td><td>Mito.CFP 小鼠</td></tr><tr><td>B6;129S6-&lt;em&gt;轴突运输通过实现多种细胞器和货物的双向转运来维持神经元稳态。轴突运输的障碍会对单个神经元及其神经网络造成严重后果，并导致多种神经系统疾病。由于许多此类疾病涉及细胞自主性和非自主性机制，且常在不同神经元亚型中表现出广泛的病理特征，因此准确识别和分析神经元亚群的方法至关重要。本文详细描述了在麻醉小鼠坐骨神经中评估信号内体和线粒体体内轴突运输的实验方案。逐步说明包括：1）利用在胆碱能运动神经元中选择性表达荧光蛋白的小鼠，在体内、原位及离体条件下区分运动神经元与感觉神经元；2）单独或同时评估信号内体和线粒体的体内轴突运输。这些互补的活体成像方法可实现对不同外周神经轴突中多种货物的同时成像，从而在生理和病理状态下对轴突运输进行定量监测。&lt;sup&gt;tm2(cre)Lowl&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;/J 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>6410</td><td>ChAT.Cre 小鼠</td></tr><tr><td>配备显微镜控制与图像采集软件的计算机</td><td>蔡司</td><td>Zen</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细弯头镊子</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细直头镊子</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（22 × 64 mm，厚度1号）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带微升刻度和推杆的刻度玻璃微量移液管</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>毛发剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 微量注射器（701 N，体积 10 &amp;mu;L，针头尺寸26 s G，斜面尖端，针长51 mm</td><td>默克</td><td>20779</td><td></td></tr><tr><td>HcT-441</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>详见 Restani 等，2012</td></tr><tr><td>加热垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37℃荧光成像用浸油 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备环境培养室的倒置共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td>LSM 780</td><td>大多数倒置共聚焦显微镜应可进行适配</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器/麻醉机，配备诱导室和面罩稳定器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>美格胶带</td><td></td><td></td><td>隐形胶带</td></tr><tr><td>微移液管拉制仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）：137 mM NaCl，10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO₄, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4&amp;ndash;HCl，pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组人脑源性神经营养因子（BDNF）</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>可与 HcT-555 共同注射的 BDNF</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型弹簧剪</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术/手术显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科缝合线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd 小鼠</td><td>MMRRC</td><td>000296-UCD</td><td>ChAT.eGFP</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

拓展工具包 在体 内 轴突运输成像

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

轴突运输通过介导多种细胞器和货物的双向转运，维持神经元的稳态。轴突运输的障碍会对单个神经元及其神经网络造成严重后果，并导致多种神经系统疾病的发生。由于这些疾病中的许多都涉及细胞自主性和非自主性机制，且常常在不同神经元亚型中表现出广泛的病理特征，因此，准确鉴定和分析神经元亚群的方法至关重要。
本文详细描述了在麻醉小鼠坐骨神经中评估信号内体和线粒体体内轴突运输的实验方案。逐步说明包括：1）利用在胆碱能运动神经元中选择性表达荧光蛋白的小鼠，在体内、原位以及离体条件下区分运动神经元与感觉神经元；2）单独或同时评估信号内体和线粒体的在体轴突运输。这些互补的活体成像方法可实现对不同外周神经轴突中多种运输 cargo 的同步成像，从而对健康与疾病状态下的轴突运输进行定量监测。

本文详细介绍了一种用途广泛的实验方案，该方案拓展了 在体内 啮齿类动物模型中的轴突运输工具包 图1 通过使用转基因小鼠，可将运动神经元轴突与感觉神经元轴突及施万细胞区分开来。 图1A 显示活体麻醉的ChAT.eGFP小鼠中胆碱能运动轴突的eGFP表达。 图1B 采用一种替代方法，直接从新切除的 ChAT.tdTomato 小鼠神经组织（即无需额外组织处理）中获得 tdTomato 表达。因此，使用 ChAT.eGFP、ChAT.tdTomato 或 Hb9.GFP 等转基因品系可实现运动轴突特异性标记 体内.
此外，也可通过向骨骼肌注射示踪剂或标记物（例如 HCT31,32 或编码 eGFP 的病毒15）来识别轴突。图2 展示了该方法的应用，显示在向胫骨前肌（TA 肌）注射探针约 4 小时后，有八条强烈表达 ChAT.eGFP 的轴突含有 HCT-555 阳性的信号内体（白色箭头）。利用该实验设计，我们能够识别支配 TA 肌的 α-运动神经元，这些神经元主要属于快缩易疲劳型44。另有五条 ChAT.eGFP 轴突的 eGFP 表达较弱（图2A，橙色星号），部分失焦，可能位于坐骨神经稍深的位置。
此外，我们鉴定了HCeGFP阴性感觉轴突中T-555阳性信号内体（黄色箭头）。因此，利用该实验范式，可特异性评估和比较运动神经元与感觉神经元中信号内体的轴突运输。 体内 确实, 利用这种转基因报告基因品系，我们发现ChAT.eGFP阳性运动轴突中信号内体的运输速度比ChAT.eGFP阴性感觉轴突更快，而这两类轴突可通过轴突宽度可靠区分43.
我们先前利用 ChAT.eGFP 小鼠鉴定了运动神经元轴突 体内43我们现报道，HB9.GFP 小鼠也可用于实现运动神经元轴突的鉴定 体内确实， 图3 展示了一系列包含逆行运动H的HB9.GFP轴突的延时成像图片CT-555阳性信号内体。注意，与ChAT驱动的表达不同，HB9.GFP轴突中的GFP呈现更明显的点状/颗粒状分布模式；其原因尚不明确。
我们此前已描述过如何监测 体内 通过坐骨神经内注射线粒体靶向染料四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE）研究坐骨神经中的线粒体动力学32,36为了可靠地区分运动神经元与感觉神经元中的线粒体，使用 Mito.CFP 小鼠, 在CFP表达下的 Thy1 启动子18，可与在特定神经元类型中表达荧光报告基因的转基因小鼠杂交。事实上，通过将 Mito.CFP 小鼠与 ChAT.tdTomato 小鼠（称为 ChAT.tdTomato::Mito.CFP）交配，我们能够特异性地在运动轴突中观察到线粒体，如图所示 图4在此活体多重成像示例中，可观察到五条 ChAT.tdTomato 轴突，其中四条含有 CFP 阳性线粒体。此外，郎飞结（图 iii 中白色箭头所示）亦可被识别。. 此外，在 ChAT.eGFP、HB9.GFP 和 Mito.CFP 小鼠中可清晰检测到郎飞结（nodes of Ranvier）（未展示）。这些双转基因品系可用于活体麻醉小鼠的延时共聚焦成像，以监测运动神经元特异性的线粒体含量及轴突运输动态。
最后，可在同一轴突内同时观察信号内体和线粒体 体内 通过注射HCT 注射到 Mito.CFP 小鼠的肌肉中（图5). 肌肉注射 HCT-555 标记在 Mito.CFP 小鼠的 TA 肌肉中进行，成像前约 4 小时完成。线粒体（i 图）和信号内体（ii 图）在肌肉特异性轴突中被同时可视化（即.，支配胫骨前肌（TA）的轴突）。事实上，可以观察到顺向移动的细胞器（黄色三角形）、逆向移动的细胞器（绿色三角形和圆形）以及停滞的细胞器（橙色三角形和圆形）。利用这一实验范式，可评估轴突内线粒体与信号内体之间复杂的功能性相互作用 体内总体而言，我们展示了多种不同的实验方法，用于评估胆碱能运动神经元中信号内体和/或线粒体的轴突运输。 体内.
<img alt="ChAT神经元的荧光显微镜观察；活体ChAT.eGFP与离体ChAT.tdTomato比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63471/63471fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1坐骨神经运动轴突 (AeGFP阳性运动轴突的代表性单平面图像 在体 来自 ChAT.eGFP 小鼠。B) ChAT.tdTomato 小鼠坐骨神经中 tdTomato 阳性运动轴突的代表性单平面图像。轴突直径的差异源于小鼠年龄和体型的不同。比例尺 = 50 µm缩写：eGFP = 增强型绿色荧光蛋白；ChAT = 胆碱乙酰转移酶。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63471/63471fig1v3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像显示神经组织中 ChAT.eGFP 与 HCT-555 标记物的共定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63471/63471fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2: 在体 活体ChAT.eGFP小鼠坐骨神经运动神经元和感觉神经元中信号内体的轴突运输 (A-C) 表达 eGFP 的胆碱能轴突的代表性图像（A) 并含有 HCT-555阳性信号内体（B）以及合并（merge）C）。白色箭头标示出一条表达 eGFP 的运动轴突，其中含有 HCT-555阳性信号内体，青色箭头指示一条缺乏H的运动轴突CT-555阳性信号内体，黄色箭头指示一条不表达eGFP的感觉轴突正在转运HCT-555阳性信号内体。橙色星号标记eGFP表达较弱的运动轴突。比例尺 = 25 µm缩写：eGFP = 增强型绿色荧光蛋白；ChAT = 胆碱乙酰转移酶；HCT-555 = 破伤风毒素结合域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63471/63471fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="活细胞成像示意图；荧光蛋白示踪；逆行运动；合并；延时序列" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63471/63471fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：代表的时间推移图像序列 在体 活体HB9.GFP小鼠运动神经元中信号内体的轴突运输 (A-D每隔3秒拍摄一次的延时图像，显示表达绿色荧光蛋白（i）并含有H的运动神经元轴突CT-555阳性信号内体（ii）以及合并图像（iii）。每组相同颜色的圆圈标识了不同帧中同一移动的内体。逆行运动方向为从右向左。比例尺 = 10 µm缩写：GFP = 绿色荧光蛋白；HCT-555 = 破伤风毒素结合域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63471/63471fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="ChAT.tdTomato、Mito.CFP及合并通道的荧光显微镜示意图，用于细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63471/63471fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4: 体内 活体小鼠坐骨神经运动神经元中线粒体的轴突运输，该小鼠为 ChAT.tdTomato::Mito.CFP 转基因品系。 (A-CtdTomato阳性运动轴突的代表性图像（A)，含有 CFP 阳性线粒体（B），以及合并（merge）C）。插图 i-iii 为各图板中相应区域的高倍放大图像。白色箭头表示疑似郎飞结。比例尺 = 25（A-C）和 10 µm (i-iii) 缩写：ChAT = 胆碱乙酰转移酶；CFP = 青色荧光蛋白。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63471/63471fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体运输分析，Mito.CFP 和 HC-T-555，荧光显微镜，延时成像结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63471/63471fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：代表同时发生的延时图像序列 体内 活体Mito.CFP小鼠坐骨神经运动神经元中线粒体与信号内体的轴突运输 (A-C每隔3秒拍摄的延时图像，显示同一坐骨神经轴突内线粒体（i）和信号内体（ii）的轴突运输过程（iii）。黄色三角形标记顺向运输的货物，绿色圆圈/三角形标记逆向运输的货物，橙色圆圈/三角形标记静止的货物。顺向运输方向为从左到右，逆向运输则相反。比例尺 = 10 µm缩写：HCT-555 = 破伤风毒素结合域；CFP = 青色荧光蛋白 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63471/63471fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

利用转基因荧光小鼠，本文详细描述了在活体动物中评估完整坐骨神经内运动和感觉轴突中信号内体和线粒体的体内轴突运输的实验方案。

轴突运输通过介导多种细胞器和 cargo 的双向运输来维持神经元的稳态。轴突运输的中断会……

利用我们的实验方案，可以在活体麻醉小鼠的运动神经元和感觉神经元轴突内可视化并定量评估信号内体和线粒体的动力学行为。该方法可用于理解轴突在体内的基础生理特性，并揭示驱动疾病小鼠模型中外周神经退行性病变的重要病理机制。我们的技术可用于评估潜在治疗方法（如药物制剂和基因治疗）对活体运动神经元和感觉神经元中轴突运输的影响。该技术可用于同时成像特定外周神经轴突中的不同细胞器，并有助于运动性疾病模型以及衰老的研究。开始准备时，拉制梯度玻璃微电极，以便对较小的肌肉进行最佳的肌肉内注射。手术过程中，将无菌手术单固定在设定为37摄氏度的加热垫上，并调整和聚焦手术显微镜。然后，按照文稿中的描述，取出所有必需的外科手术器械和工具。准备工作完成后，将已麻醉的小鼠转移至手术区域另一位置的咬口器上，并在剃除手术区域毛发前，确认角膜反射和足底回缩反射均消失。随后，使用手术胶带的黏性面将剃除的毛发从小鼠身上清除。接下来，将小鼠置于电子天平上记录术前体重。然后使用棉签涂抹眼药膏，并将小鼠和咬嘴转移至手术区域。为注射胫骨前肌（tibialis anterior，TA肌肉），将小鼠仰卧放置，并将后肢从中线向外展开10度角。当后肢处于正确位置时，用手术胶带固定足部。使用70%乙醇或等效溶液对剃毛区域进行消毒。将破伤风毒素、神经毒素或HcT溶液的无毒工作片段吸入拉制的玻璃微量移液管中。接下来，在与运动点和终板区相对应的靶肌肉区域表面做一小切口。然后，刺穿肌肉的外部筋膜以注射 HcT。将微量移液器停留原位 5 至 10 秒后，再缓慢抽出。注射后，用一到两针缝合切口。然后将小鼠转移至单独的恢复笼中，观察30分钟。准备手术器械并将其摆放在手术区域周围，以暴露坐骨神经。通过将Parafilm切割成宽度为1厘米、尖端呈角度的细长矩形，制备一个楔形片，以辅助成像过程。准备工作完成后，将小鼠转移至手术区域的咬嘴装置上，并使用手术胶带将头部固定在咬嘴上。用手术胶带将目标后肢从身体中线向外展开并固定在45度角位置。如果角膜和足底屈曲反射消失，使用剪刀剪开坐骨神经上方的皮肤。随后，在不损伤坐骨神经和血管的前提下，去除覆盖其上的股二头肌及周围肌肉或结缔组织。当完整暴露坐骨神经后，将预热的无菌生理盐水涂抹于坐骨神经周围区域，以防止干燥。然后，使用弯头镊子分离深层的结缔组织，并将预先制备好的石蜡膜楔形片置于神经下方。在将小鼠移至充满异氟烷和氧气的诱导室内的加热垫上之前，先用生理盐水浸湿的棉球覆盖暴露区域。进行成像时，将一块22×64毫米的盖玻片放置在定制的显微镜载物台上，并用胶带固定盖玻片的位置。将浸油涂抹到物镜上后，将显微镜载物台连接至倒置显微镜，并缓慢抬升浸油物镜使其接触盖玻片。当装置准备就绪后，使用胶带将麻醉面罩固定在显微镜载物台上。随后，移除坐骨神经上的棉球，并将小鼠从诱导室转移至面罩处，使暴露的神经面向盖玻片。将小鼠头部固定在接口上，在维持最低有效麻醉水平的同时，轻轻提起小鼠尾巴，向暴露的坐骨神经附近盖玻片处添加无菌生理盐水。借助目镜定位坐骨神经，确定最佳焦平面，并选择包含可移动轴突细胞器的兴趣区域。随后，单击“Acquisition”按钮切换至计算机软件，并选择兴趣区域。使用数字变焦获得80倍放大倍数，并旋转选定区域以使轴突呈水平方向。点击“区域”框并选择一个矩形感兴趣区域。在采集模式中，将帧尺寸设置为至少1024×1024像素，并开始采集100至1,000帧的时间序列图像。每只小鼠的三条轴突中，至少捕获10个可移动的运输 cargo。在本研究中，通过使用转基因小鼠实现了体内运动轴突的特异性标记。在活体麻醉的 ChAT-eGFP 小鼠中，可观察到胆碱能运动轴突中增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的表达。采用替代方法，无需额外的组织处理，即可在新切除的 ChAT.tdTomato 小鼠神经中检测到 tdTomato 表达。此外，通过向骨骼肌注射示踪剂或标记物（如 HcT 或编码 eGFP 的腺病毒），可识别轴突。代表性分析展示了HB9-GFP小鼠活体运动神经元中信号内体轴突运输的延时成像序列。在HB9中，GFP呈现出更明显的颗粒状分布模式。GFP 轴突。将 Mito.CFP 小鼠与 ChAT 小鼠杂交。tdTomato 小鼠实现了运动轴突中线粒体的可视化。此外，也可识别郎飞结。将 HcT 注射到 Mito 小鼠的肌肉中。CFP小鼠可在活体内实现同一轴突中信号内体和线粒体的同步可视化。可观察到顺向和逆向运动的细胞器，以及停滞不动的细胞器。成像过程中减少麻醉有利于限制大呼吸伪影的影响，从而简化轴突运输的追踪与分析。坐骨神经可用于RNA和蛋白质分析，以将细胞器动力学与轴突运输机制的关键组分（如马达蛋白和货物特异性衔接蛋白）相关联。

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