Name: 光驱动脱羧酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习利用可见光驱动OleT酶催化脂肪酸脱羧生成末端炔烃的生物催化方法。该技术通过光催化稳定产生过氧化氢作为辅因子，避免酶失活，为工业生物催化提供可持续的绿色化学途径。

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R.K. 和 F.H. 感谢欧盟委员会在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络 Biocascades（编号 634200）项目中提供的财政支持。

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。这些合成过程中使用的多种化学试剂具有急性毒性和致癌性。所有涉及有害有机溶剂的操作，特别是反应产物的萃取以及脂肪酸的衍生化，必须在通风橱中进行，并佩戴个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋）。本工作中所有涉及转基因生物的操作均需在符合安全等级S1的转基因生物操作许可设施中进行。
1. 重组脱羧酶OleT的表达JE 在 E. coli
<ol>
	<li>生产菌株的制备
	<ol>
		<li>合成OleT基因JE 从 Jeotgalicoccus 并按所述方法克隆至表达载体 pASK-IBA37plus 中。8 
		注意：为避免细菌代谢产生的酶对脂肪酸造成降解， E. coli 使用了Keio文库中的JW5020菌株，该菌株的脂肪酸降解通路功能失常。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酶表达的培养与诱导
	<ol>
		<li>通过接种制备预培养液 E. coli 来自含LB平板的JW5020 OleT突变体（含有 100 µg 毫升-1 氨苄青霉素）加入两支试管中，每管含3 ml LB培养基。用移液器加入氨苄青霉素（100 µg 毫升-1) 从储备液中加入培养基中用于筛选，并在 37 °C 在180 rpm的摇床培养箱中孵育15小时。</li>
		<li>向两份含有氨苄青霉素的200 ml LB培养基中各加入2 ml预培养液100 µg 毫升-1），置于1 L摇瓶中。孵育在 37 °C 180 rpm。</li>
		<li>监测 OD 的变化600nm 接种后。当OD600 达到 0.6 至 0.8 之间时，通过添加四环素诱导表达（0.2 µg 毫升-1。将培养物在37°C下孵育15小时 20 °C 和 180 rpm。 
		注意：由于 OleTJE 含有血红素辅因子，因此在诱导前需添加δ-氨基乙酰丙酸（0.5 mM），以为培养物提供辅因子合成的前体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>在冰上进行以下步骤。将培养物通过倾倒或移液转移至离心管中，并使用天平确保均匀分布。在4°C下以12,000 × g离心20分钟。 4 °C.</li>
		<li>小心弃去上清液，用移液器将沉淀重悬于50 ml缓冲液（Tris 50 mM，NaCl 200 mM，pH 7.5）中，并将悬液转移至锥形离心管中。</li>
		<li>4,000 × g 条件下离心 15 分钟后 4 °C 弃去上清液，用移液器将每份沉淀重悬于3 ml缓冲液中。</li>
		<li>在冰上通过超声处理裂解细胞（3个循环，每次30秒），每个循环之间间隔1分钟。随后在15,000 × g离心20分钟 4 °C 去除细胞碎片，用移液器将上清液转移至锥形离心管中，注意不要扰动沉淀。弃去沉淀。 
		注意：去除小分子后，其中一份溶剂组分将直接用于生物催化反应；另一份溶剂组分将用于纯化 His标签标记的OleT。JE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞提取物中小分子的去除
	<ol>
		<li>在将粗提物用于生物催化之前，为去除可能干扰过氧化氢生成或电子传递的小分子，用移液器将3 ml无细胞提取物转移至带有10 kDa膜的离心过滤装置中，并在4,000 x g条件下离心 4 °C将剩余蛋白质重悬于3 ml Tris-HCl缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>OleT 的纯化
	<ol>
		<li>将3 ml经预平衡的第二种细胞提取物加入已用平衡缓冲液（Tris 20 mM，NaCl 300 mM，imidazole 10 mM）平衡过的His Pur Ni-NTA离心柱中。</li>
		<li>用底部塞子和顶部螺旋盖密封层析柱，轻轻振荡，直至树脂与无细胞提取物均匀混合。将装填好的层析柱置于 overhead 摇床中孵育 30 分钟 4 °C.</li>
		<li>用洗涤缓冲液（Tris 20 mM，NaCl 300 mM，imidazole 20 mM，pH 7.4）1 ml 以 700 × g 离心 2 分钟洗涤柱子，重复此步骤两次。</li>
		<li>将柱子放入新的锥形离心管中，加入 1 ml 洗脱缓冲液（Tris 20 mM，NaCl 300 mM，咪唑 250 mM，pH 7.4）OleTJE . 以700 × g离心2分钟，重复此步骤两次。 
		注意：咪唑会与镍结合，从而去除OleTJE 从柱中。</li>
		<li>将洗脱液转移至离心过滤装置（10 kDa 膜）中，在 4,000 x g 条件下离心 4 °C 以去除咪唑。</li>
		<li>通过SDS-PAGE（15%）检测酶的纯度。9 混合 3 µl 用SDS缓冲液（终浓度1x）洗脱，并将溶液在指定条件下孵育 95 °C 变性5分钟。随后将全部样品上样至SDS-PAGE凝胶，使用商用蛋白质标准品，在35 mA条件下电泳，检测50 kDa的蛋白质条带。</li>
		<li>使用市售的BSA试剂盒测定蛋白质浓度。用移液器吸取 50 µl 稀释的蛋白质样品（1:100、1:200、1:500）和BSA标准品（0、20、30、40、50、60、80、100 mg/ml）-1) 加入96孔板中。加入 200 µl 加入 Bradford 试剂后，于 15 分钟后在 595 nm 处用荧光分光光度计测定吸光度，并利用标准曲线计算浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 光催化生物转化
<ol>
	<li>不添加过氧化氢的生物催化反应
	<ol>
		<li>通过将10%（v/v）特吉托（tergitol）和0.0284 g硬脂酸加入蒸馏水中，配制10 ml 10 mM的硬脂酸储备液（Mr 284.5 g mol-1）。将溶液置于加热腔中，加热至60 °C，直至脂肪酸完全溶解。</li>
		<li>生物催化与取样
		<ol>
			<li>配制两份2 ml反应混合液，其中含有50 mM EDTA、0.01 mM FMN、0.5 mM硬脂酸的Tris-HCl缓冲液。加入磁力搅拌子以保证充分供氧，并将玻璃试管置于25 °C水浴中。</li>
			<li>向每份反应混合液中加入200 µg ml-1的纯化酶或10%（v/v）无细胞提取物，并用透明玻璃灯泡（120 W）在距离反应管15 cm处进行照射。</li>
			<li>在特定时间点（0、10、30、60和120分钟以及过夜）取200 µl样品，加入20 µl 37% HCl终止反应。加入5 µl肉豆蔻酸（10 mM储备液）作为内标。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应产物分析
	<ol>
		<li>进行萃取时，向样品中加入500 µl乙酸乙酯，重复两次，倒置试管并以13,000 × g离心1分钟。</li>
		<li>移取400 µl上清液，使溶剂完全挥发。</li>
		<li>通过加入200 µl N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺（MSTFA）将羧酸衍生为三甲基硅基羧酸。将溶液在60 °C下孵育30分钟，以将羟基转化为三甲基硅基醚。</li>
		<li>通过GC/FID测定转化率 
		注：使用GC/FID检测1-十七碳烯（保留时间：8.34分钟）、α-和β-羟基硬脂酸（保留时间：12.05和12.1分钟）的生成以及底物（保留时间：11.15分钟）的减少。
		<ol>
			<li>设置如下所述的温度程序。进样口温度设为340 °C。初始柱温保持在90 °C 3.5分钟，随后以45 °C min-1的速率升温。在220 °C时保持2分钟。再次以45 °C min-1升温，在280 °C保持2分钟，然后以60 °C min-1升温。 
			注：最高温度330 °C保持1.44分钟。</li>
			<li>进样4 µl样品，分流比为5，以实现快速挥发并与载气氦气均匀混合。 
			注：随着温度升高，底物和产物将依次进入气相。物质在通过色谱柱后以特定保留时间被GC/FID检测器检测，并在屏幕上显示为峰。在显示器上观察峰的形成。</li>
			<li>使用以下公式计算产物浓度： 
			<img alt="使用峰面积比和校正因子计算产物浓度的公式；分析方法。" src="/files/ftp_upload/53439/53439eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式1"> 
			注：校正因子是通过已知量衍生化物质及其对应峰面积绘制标准曲线，针对该色谱柱对每种底物和产物分别测定的。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过GC/MS鉴定烯烃和β-羟基酸峰。
		<ol>
			<li>通过GC/MS鉴定烯烃和β-羟基酸峰。设置温度程序。进样口温度设为250 °C。柱温在100 °C保持5分钟，随后以20 °C min-1的速率升温。 
			注：最高温度保持7.5分钟。</li>
			<li>将质谱检测器温度设为250 °C，并在电子轰击模式下以50至500 m/z范围进行扫描。 
			注：电子轰击电离使分子失去一个电子，形成自由基阳离子，随后进入质谱分析。由于分子内能较高，共价键断裂产生较低m/z的碎片离子。这些碎片构成特定物质的“指纹”图谱。</li>
			<li>进样1 µl样品。通过相应“指纹”图谱在11.4分钟保留时间处检测1-十七碳烯（图2）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kourist, R., Domìnguez de Marìa, P., Miyamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+strategies+for+the+asymmetric+synthesis+of+profens+-+recent+trends+and+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments.</a> Green Chem. , 2607-2618 (2011).</li>
<li>Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taming+of+oxygen%3A+biocatalytic+oxyfunctionalisations%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Comm%22%5BJournal%5D)">The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations.</a> Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).</li>
<li>Churakova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+photobiocatalytic+oxyfunctionalization+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ang.+Chem.+In.+Ed%22%5BJournal%5D)">Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions.</a> Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).</li>
<li>Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalytic+Redox+Reactions+for+Organic+Synthesis%3A+Nonconventional+Regeneration+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods.</a> ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).</li>
<li>Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+biocatalysis+with+cytochrome+P450+peroxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).</li>
<li>Bartsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+production+of+enantioselective+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell.+Fact%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts.</a> Microb. Cell. Fact. 14, 53(2015).</li>
<li>Rude, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+olefin+%281-alkene%29+biosynthesis+by+a+novel+P450+fatty+acid+decarboxylase+from+Jeotgalicoccus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).</li>
<li>Zachos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobiocatalytic+decarboxylation+for+olefin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis.</a> Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide-independent+production+of+%CE%B1-alkenes+by+OleTJE+P450+fatty+acid+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide-independent production of α-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase.</a> Biotechnol. Biofuels. 7, 28(2014).</li>
<li>Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-driven+and+chloroperoxidase-catalyzed+oxygenation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions.</a> Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

光驱动过氧化氢的生成可用于多种氧化还原转化反应，包括过氧合酶3、氯过氧化物酶10和P450单加氧酶5。这是一种简便且可行的方法。从长远来看，利用可见光为使用太阳光驱动化学转化反应提供了可能，为高能耗反应提供了一种可持续的替代方案。
该方法适用于纯化的酶或无细胞提取物。尽管后者成本较低且操作更简便，但需注意粗提物中的小分子可能会干扰光催化转化过程。一种可行的方法是使用微滤膜（即，通过离心过滤装置离心或透析）去除这些小分子成分。捕光分子FMN的浓度决定了过氧化氢的浓度。根据氧化还原酶的亲和力，该浓度对酶活性具有决定性作用。另一个重要因素是牺牲性电子供体EDTA的浓度。然而，最重要的参数是酶的操作稳定性和活性。
脂肪酸的烯烃化是一种将生物基脂肪酸转化为烯烃的优雅反应，而烯烃是化学工业中的重要大宗商品。这种光驱动的生物催化脱羧反应可在室温及中性pH条件下进行，具有显著的可持续性优势。
我们的结果表明 原位 过氧化氢的生成是一种在不损害酶稳定性的前提下提供辅因子的策略，可实现高转化率。目前的辅因子再生方法主要使用农产品或石油基化学品。光驱动反应正作为一种可再生的替代方案兴起。未来的研究将致力于开发更廉价的分子以替代牺牲性试剂EDTA，并减少光捕获分子FMN的使用量。

气候变化与可再生资源的可预见枯竭对我们的社会构成了严重威胁。在此背景下，酶催化作用为发展可持续的、“更环保”的化学提供了尚未充分开发的潜力1氧化还原酶能够在温和的反应条件下催化官能团的引入和修饰，属于最重要的生物催化剂之一2大多数氧化还原转化需要外源性辅因子（如 NAD(P)H）的供给。辅因子再生方法虽已应用于工业规模，但仍导致较高的工艺成本，因而限制了其应用范围，主要局限于高附加值产品。有趣的是，多种过氧化物酶3,4 和 P450 单加氧酶5 通过所谓的过氧化物旁路从过氧化氢接受电子。尽管 H2O2 是一种廉价的共试剂，据报道对许多酶有害。一种稳定的 原位 形成 使用低浓度的过氧化氢是一种可行的方法，可在不损害酶操作稳定性的前提下驱动反应。
<img alt="显示OleT酶在实验室装置中与底物发生光化学反应的示意图" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. OleTJE催化脂肪酸光生物催化脱羧反应的实验装置示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
近年来，利用光作为化学和生物过程的能源受到了越来越多的关注6。过氧化氢的光驱动生成已成为一种简便且可靠的方法，用于为氧化还原转化提供过氧化氢（图1）。一种光催化剂，如黄素腺嘌呤二核苷酸（FMN），可实现分子氧还原为过氧化氢，后者随后作为酶催化氧功能化反应的辅因子。可能的电子供体包括乙二胺四乙酸（EDTA）、抗坏血酸或廉价的甲酸盐。该方法普遍适用于依赖H2O2的酶，包括过氧化物酶3,4和P450单加氧酶5。
我们最近研究了一种新型细菌脱羧酶7在将天然脂肪转化为烯烃8中的应用。这将为从生物基来源合成广泛使用的平台化学品提供一条可持续的途径。来自革兰氏阳性菌Jeotgalicoccus sp. 的脱羧酶OleTJE可催化脂肪酸的氧化脱羧反应，生成1-烯烃作为产物。OleTJE与细菌P450单加氧酶密切相关，其反应需要过氧化氢提供的电子。
遗憾的是，将H2O2加入底物和酶的溶液中会导致转化率较低且实验结果重复性差，这可能是由于过氧化氢对OleTJE稳定性具有不利影响所致。通过构建与NADPH-还原酶RhFred的融合蛋白，实现了依赖NADPH的脱羧反应9。然而，由于NADPH价格昂贵，且目前尚缺乏经济高效的再生方法，促使我们探索更廉价的电子供体。受OleTJE与P450单加氧酶相似性的启发，我们采用了光催化生成H2O2的方法。令人欣喜的是，使用无细胞提取物或纯化的酶溶液时，我们获得了较高的转化率（高达>95%）。
以脂肪酸脱羧为例，本文介绍了一种利用FMN作为光催化剂、过氧化氢作为辅因子的光驱动酶促氧化还原反应的通用实验方案。所述方法包括在重组大肠杆菌（E. coli）细胞中表达该酶、酶的纯化、用于1-烯烃合成的应用以及反应产物的分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Roth</td><td>K015.1</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90604-29-8</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Fisher Chemical</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>核黄素5-单磷酸钠盐水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130-40-5</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;delta;-氨基乙酰丙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5451-09-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-甲基-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(三甲基硅基)三氟乙酰胺（MSTFA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>24589-78-4</td><td></td></tr><tr><td>肉豆蔻酸 &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208-875-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>硬脂酸 &gt;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57-11-4</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60-54-8&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>特吉妥</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD01779855&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>G-25CK</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ecotron</td><td>Infors HT</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Labofuge 400R</td><td>Heraeus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RC 5B Plus</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fresco 17</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>离心转子</td><td>SS34</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SLA</td><td>Sorvall</td><td></td></tr><tr><td>洁净工作台</td><td>Envirco</td><td>Ceag Schirp Reinraum technik</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）&amp;nbsp;</td><td>CP-Sil 5CB (30 m x 0.25&amp;nbsp;mm x 0.25 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱-质谱联用柱（GC-MS）</td><td>FactorFour 毛细管柱 (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）</td><td>GC-2010 plus</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）</td><td>IST-40</td><td>Varian</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>RCT classic</td><td>IKA</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>SevenEasy</td><td>Mettler toledo</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Branson Sonifier 250</td><td>Branson</td><td></td></tr><tr><td>光谱光度计</td><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>亲和层析柱</td><td>His Pur Ni-NTA 离心柱</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>超滤离心管</td><td>Vivaspin turbo 15</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>微量滴定板</td><td>96孔 Multiply&amp;reg;PCR板</td><td>Sarstedt</td><td></td></tr></tbody></table>

光驱动酶促脱羧反应

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

氧化还原酶是工业上应用最广泛的酶类之一。然而，这类酶需要外部电子，而电子的供给通常成本较高且具有挑战性。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）等电子供体的循环利用，需要额外的酶和牺牲性底物。有趣的是，一些氧化还原酶可接受过氧化氢作为电子供体。尽管过氧化氢价格低廉，但该试剂常会降低酶的稳定性。解决这一问题的方法是 原位 辅因子的生成。在低浓度下持续供应辅因子可驱动反应，同时不损害酶的稳定性。本文展示了一种光催化 原位 以血红素依赖型脂肪酸脱羧酶OleT为例产生过氧化氢JE脂肪酸脱羧酶OleTJE 因其能够利用脂肪酸生成长链1-烯烃而被发现，这是一种此前未知的酶促反应。1-烯烃广泛用作增塑剂和润滑剂的添加剂。OleTJE 已被证明可从过氧化氢接受电子，以进行氧化脱羧反应。尽管添加过氧化氢会损伤该酶并导致产率降低， 原位 辅因子的生成避免了这一问题。该光生物催化系统在酶活性和产率方面表现出明显优势，从而实现了一种简单高效的脂肪酸脱羧体系。

虽然向反应体系中加入过氧化氢仅导致较低至中等程度的转化率（&lt;10%), 原位 过氧化氢的生成使转化率提高至80%。通过气相色谱-质谱联用（GC/MS）分析显示，脂肪酸生成了烯烃图2).
<img alt="气相色谱图；温度程序、质谱图和烃类结构。" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. （A）GC/MS 测定所用的温度程序。（B）1-十七碳烯在 11.4 分钟后洗脱的特征图谱。（C）末端烯烃特征性的次级 CnH2n-1 碎片离子，以 1-十七碳烯为例展示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
利用大肠杆菌（E. coli）无细胞提取物进行的光催化反应实现了高转化率。纯化的酶溶液显示出酶浓度与转化率之间存在明显相关性。增加光捕获分子FMN的浓度可提高转化率。然而，当FMN浓度超过10 mM时，反应速率不再进一步加快，表明过氧化氢的量已充足，不再为反应的限制因素。
除了催化脂肪酸脱羧反应外，OleTJE 还能催化β位的羟基化反应。在硬脂酸的转化过程中，脱羧反应速率约为羟基化反应的三倍。在典型的实验中，使用0.5 mM硬脂酸和10 µM FMN的溶液，99%的底物转化为1-十七碳烯和2-羟基硬脂酸的混合物，其比例为3.3:1（图3）8。对光驱动生物催化底物谱的研究表明，对于酰基链较长的脂肪酸，OleTJE 优先催化脱羧反应；而随着链长缩短，产物混合物中羟基脂肪酸的相对含量增加。少于十四烷酸（C14）链长的脂肪酸不发生脱羧反应。
<img alt="显示分子结构及峰分析以进行鉴定的色谱图。" src="/files/ftp_upload/53439/53439fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. OleTJE 介导硬脂酸（11.15 分钟）脱羧生成 1-十七碳烯（8.4 分钟）、α-羟基硬脂酸（12.04 分钟）和 β-羟基硬脂酸（12.1 分钟）的气相色谱分析。图中显示了在 2 小时时间过程中采集样品的峰面积变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53439/53439fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
令人意外的是，不饱和脂肪酸油酸（C18:1d9cis）和亚油酸（C18:2d9d12）未被接受为底物，表明cis双键的扭曲构型无法在酶中形成有效的结合模式。添加油酸（10%）还会抑制硬脂酸的转化。有趣的是，反式油酸（C18:1d9 trans）可被OleTJE转化，但其活性略低于硬脂酸。

我们描述了一种光催化生成过氧化氢的方案——过氧化氢是氧化转化反应的辅因子。

氧化还原酶是最常用于工业的酶类之一。然而，这类酶需要外部电子供应，而电子的供给通常成本较高且具有挑战性。

本实验的总体目标是利用可见光驱动酶促反应。在此方法中，利用光在温和的反应条件下将脂肪酸转化为末端炔烃。脱羧反应需要断裂碳-碳键。这种化学键非常稳定，使得该反应难以进行。利用光催化是实现此类困难反应的一种可持续方法。我们最初在尝试将过氧化氢直接加入反应体系时，发现会导致酶失活，由此萌生了本方法的构想。该技术的主要优势在于其能够提供稳定量的过氧化氢。首先，我们使用纯化的OleT进行光驱动生物催化，以表征我们的酶。随后，我们还测试了粗提物，这对于工业应用的开发具有重要意义。按照文本方案中所述，将合成的OleT基因克隆至表达载体中，并将质粒转化至大肠杆菌（E. coli）后，将菌体接种于两支试管中，每管含有3毫升添加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基。将预培养物在摇床中培养15小时。取2毫升菌液，分别接种至两个1升锥形瓶中的200毫升含氨苄青霉素的LB培养基中。将锥形瓶置于37摄氏度、180 RPM的摇床中孵育，直至菌液在600纳米处的光密度达到0.6至0.8之间。随后，向菌液中加入0.5毫摩尔的δ-氨基乙酰丙酸。然后通过向锥形瓶中加入终浓度为0.2微克/毫升的四环素来诱导细胞。在 20 °C 和 180 RPM 条件下培养菌液 15 小时。诱导后，将菌液倒入离心管中，在 4 °C 下以 12000 ×g 离心 20 分钟。弃去上清液。用移液枪吸取 50 毫升冰预冷的 Tris 缓冲液重悬沉淀，将悬液转移至锥形离心管中。随后在 4000 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟。弃去上清液，再通过反复移液将每份沉淀重悬于 3 毫升缓冲液中。采用超声处理裂解细胞，设置三个30秒循环，每个循环之间暂停1分钟。接着，将裂解液在4 °C条件下以15000 × g离心20分钟，然后小心地用移液器将无细胞提取物转移至锥形离心管中。为制备用于光驱动生物催化反应的粗提物，取3 mL无细胞提取物转移至10 kDa离心过滤器中，并在4 °C条件下以4000 × g离心，以去除小分子物质。将蛋白质重悬于 3 mL Tris 中。为了表征 OleT 在光驱动生物催化中的活性，需要对蛋白质进行纯化。开始蛋白质纯化时，将 3 mL 无细胞提取物上样至已平衡的镍-NTA 离心柱中。用底部塞子和螺旋盖密封层析柱，轻轻摇动直至树脂均匀分布。随后将层析柱置于 overhead 摇床中孵育。然后离心柱子。接下来，向柱子中加入一毫升洗涤缓冲液，并在700 × g下离心两分钟以进行洗涤。重复此洗涤步骤两次。洗涤后，将层析柱放入锥形离心管中，每根柱子加入1毫升洗脱缓冲液。在700 × g条件下离心2分钟，并重复洗脱两次。将合并的柱洗脱液加入10 kDa离心过滤管中，在4000 × g及4 °C条件下离心，以去除洗脱过程中使用的咪唑，从而分离出酶。最后，按照文本方案中所述方法测定蛋白质纯度和浓度。开始生物转化实验前，首先将10%的表面活性剂（如Tergitol）和28.4毫克硬脂酸加入蒸馏水中，配制成10毫升的10毫摩尔储备液。将该溶液置于60摄氏度的加热箱中加热，直至硬脂酸完全溶解。使用该溶液根据下一方案制备反应混合物。将FMN、EDTA、缓冲液和硬脂酸加入两支透明玻璃试管中，并在25°C水浴中搅拌。随后向试管中加入200微克/毫升的纯化酶或粗提物。用一个距离样品两厘米的透明 LED 灯泡照射样品。随后，在特定时间点取 200 微升样品，加入预先装有 20 微升 37% 盐酸的离心管中以终止反应。然后向每个样品中加入 5 微升 10 毫摩尔的肉豆蔻酸溶液作为内标物。为分析反应产物，向试管中加入两次，每次500微升乙酸乙酯。倒置试管以充分混匀，并在13,000 × g条件下离心1分钟。随后，将400微升上清液转移至微量离心管中，用压缩空气轻轻吹入管内，使液体完全蒸发。向管中加入200微升MSTFA。将混合物在 60 摄氏度下孵育 30 分钟，以在分析前对样品进行衍生化。通过将 4 µL 样品注入配备火焰离子化检测器的气相色谱仪中来分析反应产物，气相色谱仪的温度程序见文本方案中的描述。接下来，使用与质谱仪联用的气相色谱仪测定每个反应样品中十七烷与 β-羟基酸的生成比例。使用文中所述的烘箱温度和质谱仪设置。将每个样品各取一微升注入气相色谱仪，并记录色谱图。最后，监测每个样品的气相色谱-质谱联用色谱图，并根据制造商提供的方案进行分析。通过使用与质谱仪联用的气相色谱仪测定酶促反应产物的分子量。对于具有较长酰基链的脂肪酸，OleT 酶优先催化其脱羧生成不同长度的烯烃。生物转化反应的样品采用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分析。硬脂酸的脱羧反应发生速度是羟基化反应的三倍，其中99%的硬脂酸转化为正十七烷与2-羟基硬脂酸，其比例为3.3:1。一旦掌握，若操作得当，光驱动生物催化可在数小时内完成。在光催化中，关键挑战在于如何将有用的化学反应与光能的捕获有效耦合。在本例中，我们利用分子FMN内的光作为光敏剂，并通过过氧化氢这一传递分子将其与酶连接起来。

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热生物学催化：利用等温滴定 calorimetry 表征酶促反应

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光驱动酶促脱羧反应

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