光驱动脱羧酶
May 22nd, 2016
我们描述用于光催化生成过氧化氢的一个协议 - 对于氧化转化的辅因子。
本实验的总体目标是利用可见光驱动酶促反应。在这种方法中，使用光在温和的反应条件下将脂肪酸转化为末端炔烃。脱羧需要破坏 CC 键。
而这种键非常稳定，这使得这是一个非常困难的反应。使用光是实现如此困难反应的可持续方法。当我们尝试将过氧化氢直接添加到反应中时，我们第一次想到了这种方法，这会导致酶失活。
这种技术的主要优点是它提供稳定量的过氧化氢。首先，我们使用纯化的 OleT 进行光驱动生物催化来表征我们的酶。后来，我们还测试了粗提取物，这对工业应用的发展非常重要。
将合成的 OleT 基因克隆到表达载体中并将质粒转化为大肠杆菌后，如文本方案中所述，将细胞接种在两个含有 3 毫升 LB 培养基和每毫升 100 微克氨苄青霉素的试管中。将预培养物在摇床中孵育 15 小时。将 2 毫升培养物稀释成 200 毫升含氨苄青霉素的 LB，装在两个 1 升烧瓶中。
将培养瓶在 37 摄氏度和 180 RPM 的摇床中孵育，直到培养物达到 0.6 和 0.8 之间的 600 纳米光密度。接下来，向培养物中加入 0.5 毫摩尔的 δ 氨基乙酰丙酸。然后通过向培养瓶中加入 0.2 μg/ml 的四环素来诱导细胞。
将培养物在 20 摄氏度和 180 RPM 下孵育 15 小时。诱导后，将培养物倒入离心管中，并在 12000 倍 G 和 4 摄氏度下离心管 20 分钟。丢弃上清液。
通过移液 50 毫升冰冷的 Tris 缓冲液重悬沉淀，并将悬浮液转移到锥形离心管中。继续以 4000 倍 G 和 4 摄氏度离心 15 分钟。弃去上清液，通过重复移液将每个沉淀重悬于 3 毫升缓冲液中。
通过超声处理裂解细胞，每个循环之间间隔 3 个 30 秒，暂停 1 分钟。接下来，将裂解物在 15000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 20 分钟，然后小心地将无细胞提取物移液到锥形离心管中。为了制备用于光驱动生物催化的粗提取物，将 3 毫升单细胞游离提取物转移到 10 道尔顿离心过滤器中，并在 4 摄氏度下以 4000 倍 G 离心以去除小分子。
将蛋白质重悬于 3 mL Tris 中。为了表征 OleT 在光驱动生物催化中的活性，需要纯化蛋白质。要开始蛋白质纯化，请将 3 mL 无细胞提取物加载到平衡的镍 NTA 离心柱上。
用底部塞子和螺帽密封色谱柱。轻轻摇晃它们，直到树脂均匀分布。继续在顶置摇床中孵育色谱柱。
然后离心色谱柱。接下来，加入 1 毫升洗涤缓冲液并以 700 倍 G 离心 2 分钟，洗涤色谱柱。再重复洗涤两次。
洗涤后，将色谱柱放入锥形离心管中，并向每根色谱柱中加入 1 mL 洗脱缓冲液。将试管以 700 倍 G 离心 2 分钟，然后再次重复洗脱 2 次。将组合柱提取物添加到 10 千道尔顿离心过滤器中，并在 4000 倍 G 和 4 摄氏度下离心，以将用于洗脱的咪唑与酶分离。
最后，按照文本方案中的指示确定蛋白质纯度和浓度。要开始生物转化程序，首先将 10% 的表面活性剂（如 tergitol）和 28.4 毫克硬脂酸加入蒸馏水中，制成 10 毫升 10 毫摩尔的储备溶液。在加热室中将溶液在 60 摄氏度下加热，直到硬脂酸完全溶解。
使用此溶液根据下一个方案制备反应混合物。将 FMN、EDTA、缓冲液和硬脂酸加入两个透明玻璃管中，并在 25 摄氏度的水浴中搅拌。继续向试管中加入每毫升 200 微克纯化的酶或粗提取物。
并用透明的 LED 灯泡在两厘米的距离处照亮它们。接下来，在特定时间点在预装有 20 μL 37% 盐酸的试管中取 200 μL 样品以终止反应。然后向每个样品中加入 5 微升 10 毫摩尔肉豆蔻酸溶液作为内标。
为了分析反应产物，向试管中加入 500 μL 乙酸乙酯两次。倒置试管混合，以 13， 000 次 G 离心 1 分钟，接下来，将 400 微升上清液转移到微量离心管中，并用压缩空气轻轻吹扫试管将其完全蒸发。向试管中加入 200 微升 MSTFA。
并将混合物在 60 摄氏度下孵育 30 分钟，以便在分析前衍生化样品。通过使用文本方案中描述的温度曲线，将 4 μL 样品注入装有火焰离子化检测器的气相色谱仪中来分析反应产物。接下来，用气相色谱仪与质谱仪联用，确定每个反应样品中形成的一种庚十二烷和 β 羟基酸的比例。
使用文本方案中所述的柱温箱温度和质谱仪设置。将每个样品的 1 微升注入气相色谱仪中并记录色谱图。最后，监测每个样品的 GCMS 色谱图，并根据制造商的方案对其进行分析。
使用与质谱仪联用的气相色谱仪测定酶促反应产物的分子量。对于具有较长酰基链的脂肪酸，OleT 酶优先催化它们脱羧为不同长度的烯烃。通过装有火焰离子化检测器的气相色谱仪分析生物转化反应的样品。
硬脂酸的脱羧反应比羟基化反应快三倍，其中 99% 的硬脂酸转化为一种庚烷与 2-羟基硬脂酸的 3.3：1 混合物。一旦掌握了，如果我表现正常，光驱动的生物催化可以在几个小时内完成。在光催化中，挑战在于将有用的反应与光的收获联系起来。
在我们的例子中，我们将分子 FMN 中的光作为光敏剂，并通过转移分子（即过氧化氢）将它们连接到我们的酶。
概述
本文介绍了一种利用可见光催化酶促反应的协议，特别是将脂肪酸转化为端基炔烃。该方法专注于光驱动过氧化氢的生成，过氧化氢作为这些氧化转化的辅因子。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物催化
- 酶工程
- 光化学
背景
- 脂肪酸的脱羧涉及破坏稳定的CC键。
- 直接添加过氧化氢可能会使酶失活。
- 光提供了一种驱动具有挑战性反应的可持续方法。
- OleT酶的表征对于应用开发至关重要。
研究目的
- 开发一种光驱动的脂肪酸转化生物催化方法。
- 在反应过程中保持稳定的过氧化氢供应。
- 探索纯化和粗提酶提取物的使用。
使用的方法
- 将OleT基因克隆并转化到大肠杆菌中。
- 使用镍NTA柱诱导酶表达并纯化。
- 准备含有表面活性剂和底物的反应混合物。
- 使用气相色谱和质谱分析反应产物。
主要结果
- 成功从脂肪酸中生成端基炔烃。
- 在光驱动条件下表征酶活性。
- 展示该方法在工业应用中的潜力。
- 建立产品分析和酶纯化的协议。
结论
- 光驱动方法对于具有挑战性的酶促反应是有效的。
- 过氧化氢作为关键的辅因子，不会使酶失活。
- 这种方法可能会提高生物催化过程的可持续性。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables sustainable biocatalysis by using light to generate hydrogen peroxide in situ, addressing a key challenge in oxidoreductase applications where external cofactor supply is costly and enzyme stability is compromised. The approach supports target validation and assay development by providing a reproducible system for fatty acid decarboxylation, a reaction relevant to producing long-chain alkenes used in industrial additives. It enhances predictive confidence in early discovery by enabling controlled, light-driven oxidative transformations without enzyme inactivation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of OleTJE activity through light-driven hydrogen peroxide generation, supporting functional validation of this heme-dependent fatty acid decarboxylase.
- Operational Value: Avoids enzyme inactivation seen with direct hydrogen peroxide addition, allowing consistent measurement of decarboxylation versus hydroxylation activity.
- Mechanistic De-risking: Clarifies the role of hydrogen peroxide as a cofactor in OleTJE-mediated decarboxylation, reducing ambiguity in mechanistic studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized method to generate terminal alkenes from fatty acids, enabling quantitative assay readouts for enzyme activity screening.
- Operational Value: Supports use of both purified enzyme and crude extracts, facilitating assay scalability and adaptation for industrial workflow development.
- Assay Standardization: The light-driven system ensures steady, low-concentration cofactor supply, improving reproducibility across reaction batches.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: The production of 1-alkenes like heptadecane offers a detectable metabolic output that can serve as a biomarker for OleTJE activity in engineered systems.
- Preclinical Model Relevance: Enables production of long-chain alkenes used in lubricants and plasticizers, supporting feasibility studies for bio-based industrial chemical production.
- Risk-Adjusted Advancement: Demonstrates improved yield and enzyme stability under light-driven conditions, informing go/no-go decisions for pathway optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for enzymes requiring oxidative cofactors where stability and reproducibility are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of OleTJE function by enabling controlled decarboxylation reactions under mild, light-driven conditions.
- Screening: Generates quantifiable alkene products compatible with gas chromatography, enabling high-confidence hit validation in enzyme engineering campaigns.
- Analytics: Produces measurable ratios of alkene to hydroxy acid products (e.g., 3.3:1 heptadecane to 2-hydroxy stearic acid), providing clear chromatographic readouts for activity assessment.
- Translational Research: Connects enzymatic activity to industrially relevant outputs (1-alkenes), supporting continuity from discovery to preclinical feasibility for bio-based chemical synthesis.
- Enterprise Reuse: The photobiocatalytic system is designed as a reusable platform for oxidoreductases that can utilize in situ-generated hydrogen peroxide, reducing dependency on costly cofactor recycling systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in enzyme mechanism by decoupling cofactor supply from enzyme inactivation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through steady, low-concentration hydrogen peroxide generation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing need for exogenous cofactors and sacrificial substrates in oxidoreductase assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of OleTJE-based pathways for bio-based alkene production through demonstrated yield improvements and enzyme stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photobiocatalysis and enzyme purification, including handling of FMN as a photosensitizer.
- Depends on access to LED illumination systems and gas chromatography with flame ionization detection for product analysis.
- Necessitates standardization of light exposure distance and duration across teams to ensure reproducible hydrogen peroxide generation.
- Involves adaptation considerations when transferring from purified enzyme to crude extract systems for industrial relevance.
- Limited by the need to optimize light intensity and photosensitizer concentration to avoid oxidative damage while maintaining sufficient cofactor flux.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Production of Recombinant Decarboxylase in Escherichia coli
3:42
Purification of OleTJE
5:22
Biotransformation of Fatty Acids Using OleT
6:50
Analysis of Biotransformation Products
8:26
Results: Analysis of the Light-catalyzed Biotransformations by Gas Chromatography
9:19
Conclusion
