光驱动酶促脱羧反应

本实验的总体目标是利用可见光驱动酶促反应。在此方法中，利用光在温和的反应条件下将脂肪酸转化为末端炔烃。脱羧反应需要断裂碳-碳键。

这种化学键非常稳定，使得该反应难以进行。利用光催化是实现此类困难反应的一种可持续方法。我们最初在尝试将过氧化氢直接加入反应体系时，发现会导致酶失活，由此萌生了本方法的构想。

该技术的主要优势在于其能够提供稳定量的过氧化氢。首先，我们使用纯化的OleT进行光驱动生物催化，以表征我们的酶。随后，我们还测试了粗提物，这对于工业应用的开发具有重要意义。

按照文本方案中所述，将合成的OleT基因克隆至表达载体中，并将质粒转化至大肠杆菌（E. coli）后，将菌体接种于两支试管中，每管含有3毫升添加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基。将预培养物在摇床中培养15小时。取2毫升菌液，分别接种至两个1升锥形瓶中的200毫升含氨苄青霉素的LB培养基中。

将锥形瓶置于37摄氏度、180 RPM的摇床中孵育，直至菌液在600纳米处的光密度达到0.6至0.8之间。随后，向菌液中加入0.5毫摩尔的δ-氨基乙酰丙酸。然后通过向锥形瓶中加入终浓度为0.2微克/毫升的四环素来诱导细胞。

在 20 °C 和 180 RPM 条件下培养菌液 15 小时。诱导后，将菌液倒入离心管中，在 4 °C 下以 12000 ×g 离心 20 分钟。弃去上清液。

用移液枪吸取 50 毫升冰预冷的 Tris 缓冲液重悬沉淀，将悬液转移至锥形离心管中。随后在 4000 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟。弃去上清液，再通过反复移液将每份沉淀重悬于 3 毫升缓冲液中。

采用超声处理裂解细胞，设置三个30秒循环，每个循环之间暂停1分钟。接着，将裂解液在4 °C条件下以15000 × g离心20分钟，然后小心地用移液器将无细胞提取物转移至锥形离心管中。为制备用于光驱动生物催化反应的粗提物，取3 mL无细胞提取物转移至10 kDa离心过滤器中，并在4 °C条件下以4000 × g离心，以去除小分子物质。

将蛋白质重悬于 3 mL Tris 中。为了表征 OleT 在光驱动生物催化中的活性，需要对蛋白质进行纯化。开始蛋白质纯化时，将 3 mL 无细胞提取物上样至已平衡的镍-NTA 离心柱中。

用底部塞子和螺旋盖密封层析柱，轻轻摇动直至树脂均匀分布。随后将层析柱置于 overhead 摇床中孵育。

然后离心柱子。接下来，向柱子中加入一毫升洗涤缓冲液，并在700 × g下离心两分钟以进行洗涤。重复此洗涤步骤两次。

洗涤后，将层析柱放入锥形离心管中，每根柱子加入1毫升洗脱缓冲液。在700 × g条件下离心2分钟，并重复洗脱两次。将合并的柱洗脱液加入10 kDa离心过滤管中，在4000 × g及4 °C条件下离心，以去除洗脱过程中使用的咪唑，从而分离出酶。

最后，按照文本方案中所述方法测定蛋白质纯度和浓度。开始生物转化实验前，首先将10%的表面活性剂（如Tergitol）和28.4毫克硬脂酸加入蒸馏水中，配制成10毫升的10毫摩尔储备液。将该溶液置于60摄氏度的加热箱中加热，直至硬脂酸完全溶解。

使用该溶液根据下一方案制备反应混合物。将FMN、EDTA、缓冲液和硬脂酸加入两支透明玻璃试管中，并在25°C水浴中搅拌。随后向试管中加入200微克/毫升的纯化酶或粗提物。

用一个距离样品两厘米的透明 LED 灯泡照射样品。随后，在特定时间点取 200 微升样品，加入预先装有 20 微升 37% 盐酸的离心管中以终止反应。然后向每个样品中加入 5 微升 10 毫摩尔的肉豆蔻酸溶液作为内标物。

为分析反应产物，向试管中加入两次，每次500微升乙酸乙酯。倒置试管以充分混匀，并在13,000 × g条件下离心1分钟。随后，将400微升上清液转移至微量离心管中，用压缩空气轻轻吹入管内，使液体完全蒸发。向管中加入200微升MSTFA。

将混合物在 60 摄氏度下孵育 30 分钟，以在分析前对样品进行衍生化。通过将 4 µL 样品注入配备火焰离子化检测器的气相色谱仪中来分析反应产物，气相色谱仪的温度程序见文本方案中的描述。接下来，使用与质谱仪联用的气相色谱仪测定每个反应样品中十七烷与 β-羟基酸的生成比例。

使用文中所述的烘箱温度和质谱仪设置。将每个样品各取一微升注入气相色谱仪，并记录色谱图。最后，监测每个样品的气相色谱-质谱联用色谱图，并根据制造商提供的方案进行分析。

通过使用与质谱仪联用的气相色谱仪测定酶促反应产物的分子量。对于具有较长酰基链的脂肪酸，OleT 酶优先催化其脱羧生成不同长度的烯烃。生物转化反应的样品采用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分析。

硬脂酸的脱羧反应发生速度是羟基化反应的三倍，其中99%的硬脂酸转化为正十七烷与2-羟基硬脂酸，其比例为3.3:1。一旦掌握，若操作得当，光驱动生物催化可在数小时内完成。在光催化中，关键挑战在于如何将有用的化学反应与光能的捕获有效耦合。

在本例中，我们利用分子FMN内的光作为光敏剂，并通过过氧化氢这一传递分子将其与酶连接起来。