热生物催化:等温滴定量热法表征酶促反应

以下实验描述了一种可靠、快速且无标记的方法，该方法采用等温滴定量热法，使用随时间释放和吸收的热量作为内部探针，定量测定溶液中酶促反应的热力学和动力学。这是通过允许酶促反应在仪器样品池中在恒定温度下发生并监测热伴踪与初始基线的偏差来实现的。在称为方法一或 M1 的第一个实验中，将底物注入酶溶液中，并测量完全底物转化的热量，从而确定反应的总摩尔焓。

在称为方法 2 或 M 2 的第二个实验中，进行底物的多次注射，从而可以测量不同底物浓度下随时间推移的产热速率。假设 meis menton 酶催化，从两个热量度量实验得出的结果能够确定动力学参数 kcat 和 km。与其他方法（例如监测产物形成的石油光度测定法）相比，使用等温损耗量热法的主要优点是 ITC 不需要对被分析的系统进行任何修改和标记，并且需要非常少量的材料，因为它使用反应的固有热作为内部探针，证明该程序将是 lusai。

我们实验室的一名博士生首先用两毫升缓冲液稀释酶的浓缩溶液，得到 M1 实验的最终酶浓度在纳摩尔范围内。然后将 0.5 毫升缓冲液添加到底物的浓缩溶液中，以得到底物浓度至少比酶浓度高三个数量级且高于 km 的底物浓度。对于 M 2 实验，制备最终浓度在皮摩尔至纳摩尔范围内的 2 毫升酶溶液。

用 0.5 mL 缓冲液稀释底物，得到毫摩尔范围内的底物浓度。在确认样品池和注射注射器已按照制造商的说明清洁后，用蒸馏水填充加载注射器。然后将针头轻轻插入样品池，填充样品池并使用先前描述的方法去除液体，用蒸馏水洗涤样品池两次，用缓冲液洗涤两次。

将酶溶液缓慢注入细胞中，直到它从细胞干细胞的顶部溢出。为了去除样品池中捕获的气泡，向样品池中喷射约 0.25 毫升溶液。在又产生两次喷发后。

将加载注射器的针头放在细胞干细胞和细胞端口之间的壁架上，并去除任何多余的溶液。启动 VP 查看器程序，并将 ITC 仪器平衡到比所需实验温度低 3 摄氏度的温度。以与以前相同的方式用蒸馏水填充参比池后，使用细硅胶管将塑料注射器连接到注射注射器的注水口，将注射注射器尖端放入水中并注满注射器，直到水从顶部注水口流出，表明注射注射器已满。

然后从水中取出注射器尖端并吸入空气以清空注射注射器。使用相同的步骤，用缓冲液清洗注射注射器，并吸入空气通过系统。接下来，将底物溶液系在干净的窄管中。

将其放置在注射器下方，并将注射注射器的针头完全插入其中。填充注射注射器，从计算机界面在试管底部留下少量溶液。按 close fill port。

取出硅负载管后，按吹扫并重新填充以去除注射注射器中的任何气泡并将其排出回散装溶液中。然后，用纸巾擦拭注射注射器的侧面，以去除任何残留溶液并将其放入样品池中。在 M1 实验中，至少添加两次 5 至 30 微升的底物以验证可重复性。

然后将每次进样之间的间隔时间设置得足够大，以确保热信号在下次添加之前返回到基线。在 M 2 实验中，设置 5 至 10 μL 的多次进样。设置进样之间的间隔，使系统在每次进样后将热功率稳定到新的基线。

此时，将参考功率设置为 20。然后定义实验酶和底物浓度，并为实验选择一个名称。将温度设置为 25 摄氏度并开始实验。

实验完成后，根据制造商的说明清洁样品池和注射器。打开 origin 7.0 软件后，点击打开按钮，在 M1 实验的热跟踪中选择与第一次注射对应的文件。为了确定反应的 delta H，将基线偏差产生的第一个峰积分到单次进样的热谱图中。

M1 实验。然后将获得的面积值除以微卡路里表示的总反应热除以最终底物、以微摩尔表示的样品池中的浓度和以升表示的样品池体积。对 M1 实验的第二个峰重复相同的步骤，并对两次 delta H 测量获得的值进行平均，然后通过测量每次进样后原始基线与新基线之间的差异，确定 M 2 实验中 DT 的 DQ。

这可以通过根据以下方程将实验数据转换为反应速率来完成。使用在 M1 实验中获得的焓值。然后将数据拟合到 michalis menon 方程，特别是来自分析程序的数据。

单击 read data 按钮并导航到 M two 实验所在的文件夹。然后单击类型文件的向下滚动箭头并选择 enzyme assay。随后，单击并打开文件。

做 M 两个实验的 ITC。酶检测对话框打开后，仅从 delta H 窗口中的窗口中选择方法二底物，表示在 M1 实验中获得的 delta H 值。接下来，单击零 y 轴按钮，然后在第一个注射点之前双击。

单击 calculate rate 按钮以绘制速率与底物浓度的关系。最后，使用 fit to model 函数拟合曲线并获得动力学一致性。选择 cannavale 和 CMIS 或 JAK bean URI 的裂解活性作为代表性反应，以证明 ITC 在定量测定酶催化中的适用性。

在 M10.5 实验中测量了每摩尔负 10.5 千克卡路里的 delta H 值，方法是将尿素底物注射产生的热能集成到脲酶溶液中，并允许反应进行完成。使用以下方程将 M 2 实验中记录的热功率转换为反应速率。将获得的数据与 McKayla Cementin 方程的拟合提供了 20 毫摩尔堆中 JAK 豆脲酶的动力学参数。

pH 值 7 为 kcat 等于每秒 30， 200，KM 等于 3.45 毫摩尔，与之前报告的数据一致。在 M1 实验中测得的总热变化代表所分析反应期间发生的所有事件的总和，并且取决于所有涉及过程的摩尔焓，而不仅仅是底物到产物的转化率。在反应系统在缓冲溶液中获取质子的通用过程中，缓冲器释放质子，在反应池内产生额外的热量。

因此，测得的 delta H 是显而易见的，包括反应的固有 delta H，以及缓冲液的电离焓和根据突出显示的方程式交换质子的数量。在 M1 实验中使用此方程，可以通过在具有不同电离焓的缓冲液中进行相同的实验来确定交换质子的数量和内禀 delta H。整个尿素水解反应导致从缓冲液中获得质子。

因此，如上所述，反应的热量包括缓冲液 d 质子化的贡献。为了计算水解反应的内禀 delta 年龄，在不同的缓冲液中进行了三个 M1 实验，其特征是三个已知的不同电离焓。本征焓和从缓冲区释放的质子数可以通过实验数据的截距和线性拟合的斜率计算得出。

它们分别为每摩尔负 14.7 公斤卡路里和 0.98 卡路里，与之前报告的数据完全一致。该程序的应用范围从基础研究扩展到应用研究和药物筛选，因为一旦确定了酶反应的动力学。可以在存在不同种类和浓度的酶抑制剂的情况下重复实验，以监测抑制、常数。