高效的哺乳动物细胞表达和细胞外糖蛋白的结晶一步纯化

这种哺乳动物蛋白质表达技术的总体目标是产生毫克级的天然折叠蛋白质，适用于结构、生物物理和功能研究。该技术的主要优点是它是一种快速直接的方案，用于获得分泌的哺乳动物蛋白和结构研究所需的纯度浓度。一般来说，我们发现蛋白质产量的大多数问题都是由于细胞健康和活力造成的。

通过密切监测细胞活力和培养基糖水平，您可以大大提高蛋白质产量并延长细胞的实用性。监测细胞密度也非常重要。我们发现，如果在转染前的任何时间细胞超过每毫升 200 万个细胞，则蛋白质产量会大大降低 要进行 2 93 F 细胞的大规模培养，请补充 1 升 2 93 F 培养基，其中含有 10 毫升 100 x 谷氨酰胺和 5 毫升 100 x 笔链球菌。

抗生素在无血清条件下具有足够的强度，降低的抗生素浓度提高了转染过程中的细胞活力，从而提高了蛋白质产量和培养物。将 2 个 93 F 细胞放入 300 mL 培养基中，装在一升聚碳酸酯挡板锥形瓶中，并在 37 摄氏度下用 8% 二氧化碳摇动，同时在转染前一天在标准组织培养箱中摇动，在转染当天将细胞稀释至每毫升密度 50 万个细胞。通过在 2 93 F 培养基中加入 10% 体积或每体积细胞增强 2% 重量来补充培养基。

在此步骤中加入 kafu 以控制蛋白质糖基化。在无血清培养基中制备 DNA 和转染试剂溶液，孵育 5 分钟。接下来，以 1 mL 的增量将转染试剂加入 DNA 溶液中，混合。

在室温下轻轻孵育 30 分钟，以形成试剂 DNA 复合物。然后以逐滴方式将溶液添加到细胞上，让转染的细胞表达蛋白质 72 至 96 小时以纯化糖蛋白。首先将培养物倒入离心瓶中，以 1300 离心 20 分钟 Gs.To 沉淀细胞，收集上自然，必要时再旋转一次，或使用 0.22 微米过滤器澄清上清液。

接下来，加入 10% 体积的 10 x 镍硝基负载、三乙酸或镍 NTA 结合缓冲液。然后，向柱中加入 2 毫升镍 NTA 浆液，并在 4 摄氏度下用 10 倍柱体积的 1 x 结合缓冲液平衡，制备 4 摄氏度的重力柱。将上清液流过填料并收集流过的液流。

倒入上清液流过柱后，用 10 倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤。然后在 5 柱体积的洗脱缓冲液中洗脱蛋白质。如果最终体积为 0.5 mL，则需要离心浓缩器将 EIT 浓缩至 0.43 mL，通过在 16， 000 GS 和 4 摄氏度下离心沉淀任何碎片。

然后加入 50 微升 500 毫摩尔柠檬酸钠，pH 值为 5.5 和 20 微升 endo hf。将混合物在室温下孵育 2 小时以去除 endo HF 首先在磷酸盐缓冲盐水中洗涤直链淀粉树脂 3 次。将蛋白质与洗涤过的树脂在 4 摄氏度下孵育 1 小时。

孵育后，以 1000 G 离心 5 分钟，使树脂沉淀并收集上清液。使用适当的截留分子量、离心过滤器和缓冲液置换到所示的储存缓冲液中浓缩蛋白质。以下是镍亲和层析后在 cine 处理的细胞中表达的分泌蛋白的代表性 SDS 页面结果。

第一个泳道是糖基释放前的蛋白质，第二个泳道是 endo hf 糖基释放后的蛋白质。糖基化蛋白的运行速度高出约 10 道尔顿，然后在单次纯化步骤后，在去糖基化后塌陷成与预测分子量一致的单个条带。使用悬滴法设置水晶屏风。

上图显示了初始晶体命中，下图显示了优化的结晶条件。这表明目标蛋白质的生化均一性可能是结晶成功的决定因素，优化的哺乳动物表达系统可产生适合这种结晶的蛋白质。通过体积排阻色谱很容易进一步纯化镍纯化的蛋白质。

这也是评估蛋白质生产和优化条件以产生正确折叠蛋白质的有用步骤。目标蛋白质应该是色谱洗脱中的主要物质，洗脱体积应与蛋白质的分子量相对应。早些时候。一旦掌握，EEU 时间可能表明蛋白质的聚集或错误折叠。

如果执行得当，这项技术可以在四天内完成。在执行此程序时，保持细胞培养的无菌条件非常重要。遵循此程序。可以进行其他方法，如大小、排阻色谱、多角度光散射和差示扫描、荧光测定，以评估蛋白质的卵黄状态和热稳定性。