重组人蛋白与HEK293悬浮细胞的瞬时转染高产表达

该程序的总体目标是通过将重组蛋白靶向 ER 和 GOGI 介导的分泌途径来表达具有适当哺乳动物糖基化的哺乳动物糖蛋白。该方法可以帮助回答免疫学中的关键问题，例如规格的作用、抗体和抗体片段的结构模式和免疫激活潜力。该技术的主要优点是它利用人类细胞来表达人类蛋白质，这为适当的细胞传教士提供了适当的折叠和修饰目标蛋白质。

用于细胞构建的培养箱摇床应在培养接种前至少一小时以 135 RPM、80% 湿度、8% 二氧化碳和 37 摄氏度运行。打开生物安全柜的紫外线灯，将密封的培养基 A 和培养基 B 瓶放入 37 摄氏度的水浴中预热。关闭紫外线灯，用 70% 乙醇和水溶液对生物安全柜进行消毒。

用通气盖移液器、移液器和预热培养基瓶喷洒 70% 乙醇水溶液，对 125 mL 锥形瓶进行消毒。在整个过程中，将这些物品放入生物安全柜中。所有物品在进入生物安全柜之前必须以这种方式进行消毒。

出 26 mL 培养基 A 和 3 mL 培养基 B 并转移到 125 mL锥形瓶中，制备用于 30 mL培养的新鲜培养基。轻轻摇晃、加热一小瓶先前在零下 80 摄氏度冷冻的 HEK 2 93 F 细胞，在 37 摄氏度的水浴中混合，以部分解冻细胞。这大约需要一分钟，并且细胞不应完全解冻。

接下来，用 70% 乙醇水溶液对小瓶外部进行消毒，然后将其移至生物安全柜中。使用 1 mL 移液器取出细胞悬液，并将其转移到含有 29 mL 新鲜培养基的 125 mL 锥形瓶中。盖上培养瓶盖，将培养瓶放入培养箱摇床中 24 小时。

培养接种后 24 小时。检查细胞密度，用 70% 乙醇和水溶液对培养瓶进行消毒，然后将其移至生物安全柜中。使用 1 毫升移液器和移液器缓慢抽取 100 微升培养物并将其转移到无菌的 0.5 毫升 einor 管中。

关闭培养瓶的盖子，尽快将培养瓶放回培养箱摇床中。将 7.5 微升 trian blue 溶液与 7.5 μL 细胞混合。剧烈混合，然后将 7.5 μL 混合物转移到计数玻片上。

打开自动细胞计数仪，将计数玻片放入加载室。自动读数仪被激活，并以每毫升细胞数和活力百分比为单位自动计数细胞。确定转移到新鲜培养基以获得每毫升 300， 000 个活细胞的细胞密度所需的供体培养物的体积。

如前所述，通过将 23 mL 培养基 A 和 3 mL 培养基 B 转移到新鲜的 125 mL 培养瓶中来制备新鲜培养基。之后，从生物安全柜中取出培养基 A 和培养基 B 的储备瓶，以降低其污染风险。从培养箱中取出 HEK 2 93 F 细胞培养瓶。

用 70% 乙醇和水溶液喷洒，然后使用新移液器将其放入生物安全柜中。从培养物中取出正确的等分试样细胞，并将其转移到含有新鲜培养物的培养瓶中。中等。将两种培养物从生物安全柜转移到培养箱摇床中。

转染前，将细胞生长至每毫升 2 至 300 万个活细胞的密度。如前所述检查细胞密度并确定转染的细胞量。使用无菌血清移液管。

将适当体积的细胞悬液转移至 250 mL离心管中。以 100 倍 G 离心 5 分钟，收集细胞。灭菌后，将装有沉淀细胞的试管转移到生物安全柜中。

使用无菌移液管倒出由用过的上清液组成。培养基使用 10 mL 新鲜培养基上下吹打，大力重新发送沉淀的细胞，然后转移到装有新鲜转染培养物的制备瓶中。中等。拧上通气细胞培养瓶的盖子，并在细胞孵育时将培养瓶在培养箱摇床中孵育 15 分钟至 1 小时。

使用新鲜培养基稀释血浆 DNA 和聚醚胺或 PEI 储备液，至终浓度为 0.5 μg/μL。从培养箱摇床中取出装有分散细胞的培养瓶，使用微量移液器将其带到生物安全柜中，将 300 μL 血浆 DNA 加入培养物中，并以 900 μL PEI 轻轻手动摇动混合，加入培养物中，然后再次混合。然后加入 3.8 毫升新鲜培养基。

将培养瓶转移至培养箱摇床中 24 小时。转染后 24 小时，必须稀释细胞培养物。首先制备稀释培养基时，使用无菌 1 毫升血清移液管抽取 1 毫升 PREWARM 220 毫摩尔丙戊酸或 VPA，并将其转移到无菌 50 毫升试管中。

接下来，使用无菌血清移液器向 VPA 溶液中加入 5 毫升预热培养基 B 和 44 毫升预热培养基 A。这会产生 50 mL 新鲜培养基，VPA 的最终浓度为 4.4 mL。从培养箱中检索转染的培养物。

对培养瓶的外部进行消毒，并将培养瓶放入生物安全柜中。将制备好的稀释培养基添加到培养物中。转染后，将培养瓶转移回培养箱摇床中再放置 4 到 5 天。

通过前面演示的程序每天监测细胞活力。还应每天保存等分试样用于蛋白质表达分析，转染后 5 至 6 天，或者如果细胞活力低于 50%则以 1000 倍 G 离心细胞加培养基 5 分钟来收获细胞。收集含有 5 毫升 10% 漂白剂溶液的上清液到 HEK 细胞沉淀中，并作为生物危害丢弃。

随后，从收集的上清液中纯化蛋白质。该表达系统产生了高产量的糖基化蛋白，这在瞬时转染 HK 2 93 F 细胞后 IgG one fc 的典型表达模式中得到了说明。使用 IgG one FC 蛋白柱或组胺标记的 GFP 的镍柱与 FC γ 受体 3 A 进行亲和纯化，得到高纯度的蛋白质。

该系统在二维 NMR 波谱中有效地表达了同位素富集的 IgG one FC，该波谱将氢原子核的共振频率与直接键合的酰胺氮相关联。观察到 15 个原子的信号分散良好。如基质辅助激光解吸电离质谱分析所示，HEK 2 93 F 和 HEK 2 93 s 细胞在不同培养条件下产生不同的糖型。

从 HEK 2 93 s 细胞表达的 IgG one FC 和具有 5 个 anos 和 2 个 N 乙酰氨基葡萄糖残基的形式的聚糖，其中不含来自 HEK 2 93 F 表达材料的 FU 葡萄糖聚糖，是具有核心 FU 葡萄糖的复杂型 bi 路线形式，并且大多数具有末端 N 乙酰氨基葡萄糖或一小部分单体或扩张形式。在使用 HEK 2 93 F 细胞进行的表达中加入糖基化抑制剂后，岩藻糖掺入减少 90% 以上。一旦掌握，建立瞬时转染可在第 1 天 1.5 小时和第 2 天 15 分钟内完成。表达期为 4 至 6 天后，可在 15 分钟内收获含有蛋白质的溶液。

最后，在尝试此程序时，蛋白质的纯化大约需要 1.5 小时，重要的是要记住在转染之前保持稳定的培养物，转染活跃生长的细胞，并在添加 PEI 之前添加 DNA。遵循此过程。可以执行其他方法，例如使用一系列生物物理技术的蛋白质功能表征，以探测表达的糖蛋白发育后的结构和功能。

这项技术为免疫学领域的研究人员在体外和体内探索 IgG 和糖基化的结构活性关系铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用我们的 K 2 93 F 细胞和 PZ N 2 载体的组合制备和纯化糖蛋白有很好的了解。