重组人蛋白与HEK293悬浮细胞的瞬时转染高产表达
2015年12月28日
具有适当翻译后修饰的真核蛋白的实验室规模生产是一个重大障碍。这是一种使用哺乳动物表达系统快速构建和周转蛋白质表达的稳健方案。该系统支持选择性氨基酸、蛋白质选择性标记和聚糖组成的小分子调节剂。
该程序的总体目标是通过将重组蛋白靶向 ER 和 GOGI 介导的分泌途径来表达具有适当哺乳动物糖基化的哺乳动物糖蛋白。该方法可以帮助回答免疫学中的关键问题，例如规格的作用、抗体和抗体片段的结构模式和免疫激活潜力。该技术的主要优点是它利用人类细胞来表达人类蛋白质，这为适当的细胞传教士提供了适当的折叠和修饰目标蛋白质。
用于细胞构建的培养箱摇床应在培养接种前至少一小时以 135 RPM、80% 湿度、8% 二氧化碳和 37 摄氏度运行。打开生物安全柜的紫外线灯，将密封的培养基 A 和培养基 B 瓶放入 37 摄氏度的水浴中预热。关闭紫外线灯，用 70% 乙醇和水溶液对生物安全柜进行消毒。
用通气盖移液器、移液器和预热培养基瓶喷洒 70% 乙醇水溶液，对 125 mL 锥形瓶进行消毒。在整个过程中，将这些物品放入生物安全柜中。所有物品在进入生物安全柜之前必须以这种方式进行消毒。
抽出 26 mL 培养基 A 和 3 mL 培养基 B 并转移到 125 mL锥形瓶中，制备用于 30 mL培养的新鲜培养基。轻轻摇晃、加热一小瓶先前在零下 80 摄氏度冷冻的 HEK 2 93 F 细胞，在 37 摄氏度的水浴中混合，以部分解冻细胞。这大约需要一分钟，并且细胞不应完全解冻。
接下来，用 70% 乙醇水溶液对小瓶外部进行消毒，然后将其移至生物安全柜中。使用 1 mL 移液器取出细胞悬液，并将其转移到含有 29 mL 新鲜培养基的 125 mL 锥形瓶中。盖上培养瓶盖，将培养瓶放入培养箱摇床中 24 小时。
培养接种后 24 小时。检查细胞密度，用 70% 乙醇和水溶液对培养瓶进行消毒，然后将其移至生物安全柜中。使用 1 毫升移液器和移液器缓慢抽取 100 微升培养物并将其转移到无菌的 0.5 毫升 einor 管中。
关闭培养瓶的盖子，尽快将培养瓶放回培养箱摇床中。将 7.5 微升 trian blue 溶液与 7.5 μL 细胞混合。剧烈混合，然后将 7.5 μL 混合物转移到计数玻片上。
打开自动细胞计数仪，将计数玻片放入加载室。自动读数仪被激活，并以每毫升细胞数和活力百分比为单位自动计数细胞。确定转移到新鲜培养基以获得每毫升 300， 000 个活细胞的细胞密度所需的供体培养物的体积。
如前所述，通过将 23 mL 培养基 A 和 3 mL 培养基 B 转移到新鲜的 125 mL 培养瓶中来制备新鲜培养基。之后，从生物安全柜中取出培养基 A 和培养基 B 的储备瓶，以降低其污染风险。从培养箱中取出 HEK 2 93 F 细胞培养瓶。
用 70% 乙醇和水溶液喷洒，然后使用新移液器将其放入生物安全柜中。从培养物中取出正确的等分试样细胞，并将其转移到含有新鲜培养物的培养瓶中。中等。将两种培养物从生物安全柜转移到培养箱摇床中。
转染前，将细胞生长至每毫升 2 至 300 万个活细胞的密度。如前所述检查细胞密度并确定转染的细胞量。使用无菌血清移液管。
将适当体积的细胞悬液转移至 250 mL离心管中。以 100 倍 G 离心 5 分钟，收集细胞。灭菌后，将装有沉淀细胞的试管转移到生物安全柜中。
使用无菌移液管倒出由用过的上清液组成。培养基使用 10 mL 新鲜培养基上下吹打，大力重新发送沉淀的细胞，然后转移到装有新鲜转染培养物的制备瓶中。中等。拧上通气细胞培养瓶的盖子，并在细胞孵育时将培养瓶在培养箱摇床中孵育 15 分钟至 1 小时。
使用新鲜培养基稀释血浆 DNA 和聚醚胺或 PEI 储备液，至终浓度为 0.5 μg/μL。从培养箱摇床中取出装有分散细胞的培养瓶，使用微量移液器将其带到生物安全柜中，将 300 μL 血浆 DNA 加入培养物中，并以 900 μL PEI 轻轻手动摇动混合，加入培养物中，然后再次混合。然后加入 3.8 毫升新鲜培养基。
将培养瓶转移至培养箱摇床中 24 小时。转染后 24 小时，必须稀释细胞培养物。首先制备稀释培养基时，使用无菌 1 毫升血清移液管抽取 1 毫升 PREWARM 220 毫摩尔丙戊酸或 VPA，并将其转移到无菌 50 毫升试管中。
接下来，使用无菌血清移液器向 VPA 溶液中加入 5 毫升预热培养基 B 和 44 毫升预热培养基 A。这会产生 50 mL 新鲜培养基，VPA 的最终浓度为 4.4 mL。从培养箱中检索转染的培养物。
对培养瓶的外部进行消毒，并将培养瓶放入生物安全柜中。将制备好的稀释培养基添加到培养物中。转染后，将培养瓶转移回培养箱摇床中再放置 4 到 5 天。
通过前面演示的程序每天监测细胞活力。还应每天保存等分试样用于蛋白质表达分析，转染后 5 至 6 天，或者如果细胞活力低于 50%则以 1000 倍 G 离心细胞加培养基 5 分钟来收获细胞。收集含有 5 毫升 10% 漂白剂溶液的上清液到 HEK 细胞沉淀中，并作为生物危害丢弃。
随后，从收集的上清液中纯化蛋白质。该表达系统产生了高产量的糖基化蛋白，这在瞬时转染 HK 2 93 F 细胞后 IgG one fc 的典型表达模式中得到了说明。使用 IgG one FC 蛋白柱或组胺标记的 GFP 的镍柱与 FC γ 受体 3 A 进行亲和纯化，得到高纯度的蛋白质。
该系统在二维 NMR 波谱中有效地表达了同位素富集的 IgG one FC，该波谱将氢原子核的共振频率与直接键合的酰胺氮相关联。观察到 15 个原子的信号分散良好。如基质辅助激光解吸电离质谱分析所示，HEK 2 93 F 和 HEK 2 93 s 细胞在不同培养条件下产生不同的糖型。
从 HEK 2 93 s 细胞表达的 IgG one FC 和具有 5 个 anos 和 2 个 N 乙酰氨基葡萄糖残基的形式的聚糖，其中不含来自 HEK 2 93 F 表达材料的 FU 葡萄糖聚糖，是具有核心 FU 葡萄糖的复杂型 bi 路线形式，并且大多数具有末端 N 乙酰氨基葡萄糖或一小部分单体或扩张形式。在使用 HEK 2 93 F 细胞进行的表达中加入糖基化抑制剂后，岩藻糖掺入减少 90% 以上。一旦掌握，建立瞬时转染可在第 1 天 1.5 小时和第 2 天 15 分钟内完成。表达期为 4 至 6 天后，可在 15 分钟内收获含有蛋白质的溶液。
最后，在尝试此程序时，蛋白质的纯化大约需要 1.5 小时，重要的是要记住在转染之前保持稳定的培养物，转染活跃生长的细胞，并在添加 PEI 之前添加 DNA。遵循此过程。可以执行其他方法，例如使用一系列生物物理技术的蛋白质功能表征，以探测表达的糖蛋白发育后的结构和功能。
这项技术为免疫学领域的研究人员在体外和体内探索 IgG 和糖基化的结构活性关系铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用我们的 K 2 93 F 细胞和 PZ N 2 载体的组合制备和纯化糖蛋白有很好的了解。
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概述
该协议概述了一种利用ER和高尔基分泌途径表达具有正确糖基化的哺乳动物糖蛋白的方法。它特别适用于免疫学研究，重点关注抗体结构和免疫激活。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 蛋白质表达
背景
- 真核蛋白的生产因翻译后修饰而具有挑战性。
- 人类细胞为蛋白质的正确折叠和修饰提供了必要的环境。
- 该方法增强了对抗体功能的理解。
- 它支持选择性氨基酸标记和小分子调控。
研究目的
- 表达具有哺乳动物糖基化的糖蛋白。
- 研究抗体的免疫激活潜力。
- 探索抗体和抗体片段的结构模式。
使用的方法
- 利用哺乳动物表达系统。
- 将重组蛋白靶向ER和高尔基途径。
- 摇床设置：135 RPM，80% 湿度，8% CO2，37°C。
- 培养基的准备和生物安全柜的灭菌。
主要结果
- 成功表达哺乳动物糖蛋白。
- 展示了蛋白质的正确糖基化和折叠。
- 提供了关于抗体结构和免疫反应的见解。
- 建立了快速的蛋白质表达协议。
结论
- 该方法促进了免疫学中糖蛋白的研究。
- 使用人类细胞增强了研究结果的相关性。
- 该协议为蛋白质表达提供了一种稳健的方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Transient transfection of HEK293 suspension cells enables rapid, high-yield production of recombinant human glycoproteins with native-like post-translational modifications, addressing a critical bottleneck in biologics discovery. This system supports early-stage target validation by providing properly folded and glycosylated proteins for functional and structural assays, reducing mechanistic ambiguity in antibody and cytokine studies. The ability to tune glycoforms and incorporate isotopic labels enhances predictive confidence in lead selection and de-risks downstream preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables expression of human FcγRIIIa, ST6GalI, and IgG Fc with yields of 95-120 mg/L, supporting quantitative binding and effector function assays.
- Operational Value: Uses serum-free, suspension-adapted HEK293F/S cells scalable to multi-liter cultures for consistent protein supply.
- Predictive Value: Glycoform tuning via VPA inhibition allows assessment of FcγR binding and ADCC potential without yield loss.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Secreted glycoproteins in culture supernatant simplify harvest and enable high-throughput purification via affinity tags (His, Protein A/G).
- Operational Value: Transfection-to-purification timeline of <6 days supports iterative antigen/antibody screening campaigns.
- Assay Readiness: Purified proteins show high purity and homogeneity, suitable for SPR, ELISA, and biophysical characterization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Mammalian glycosylation patterns from HEK293 cells improve relevance of in vitro functional data to in vivo mechanisms.
- De-risking: Isotopic labeling (15N) enables NMR/MS structural analysis to confirm folding and modification early in discovery.
- Preclinical Alignment: Glycoengineered variants support Fc-silent or enhanced effector function molecule design for therapeutic optimization.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing recombinant antigens and immunoglobulins for early biophysical and cellular assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-glycan interactions and immune complex formation using properly glycosylated Fc domains.
- Screening: Enables production of recombinant glycoproteins for screening antibody libraries or glycan-binding proteins.
- Analytics: Yields isotopically enriched samples for NMR and MS, facilitating structural epitope mapping and glycan profiling.
- Translational Research: Glycoform control allows evaluation of Fc effector functions predictive of in vivo activity.
- Enterprise Reuse: Platform is adaptable across projects for antibodies, cytokines, and enzymes requiring human-like glycosylation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through authentic human glycosylation and folding.
- Operational Value: Standardized, suspension-based protocol with defined transfection and harvest timelines.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early glycoform structure-function analysis.
- Portfolio Impact: Accelerates lead selection via high-yield, reproducible antigen/antibody production for mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and sterile technique.
- Dependent on incubator shaker with precise CO2, humidity, and temperature control.
- Needs access to biosafety cabinet, centrifuge, and protein purification systems (Ni-NTA, Protein A/G).
- Adaptation to other cell lines may require optimization of DNA/PEI ratios and transfection timing.
- Glycoform modulation via VPA requires validation of target protein function post-treatment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Culture Inoculation
5:11
Transfection
7:50
Expression and Harvest
8:36
Results: High Yield Expression of Appropriately Glycosylated Protein with Transient Transfection
10:20
Conclusion
3:00
Cell Maintenance: Checking Cell Density and Viability and Passaging Cells
