Name: 重组人蛋白与HEK293悬浮细胞的瞬时转染高产表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学习利用HEK293悬浮细胞瞬时转染技术高效表达重组人蛋白的方法，通过内质网和高尔基体分泌途径实现哺乳动物糖基化修饰。该技术为免疫学研究中抗体结构与功能分析提供了可靠的蛋白表达平台。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助项目 K22AI099165（AWB）、P41GM103390（KWM）和 P01GM107012（KWM），以及爱荷华州立大学罗伊·卡弗生物化学、生物物理与分子生物学系（Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics &amp;#38; Molecular Biology at Iowa State University）资金的支持。本研究内容仅由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。

本方案适用于使用HEK293F或HEK293S细胞进行表达。&#160;
1. 细胞建立&#160;
<ol>
	<li>培养物接种 
	注意：所有细胞培养操作均须在生物安全二级（BSL-2）设施中进行，所有带入生物安全柜的物品必须用70%乙醇水溶液喷洒消毒。
	<ol>
		<li>在135 rpm、80%湿度和8.0% CO₂条件下操作培养摇床2 和 37 °C。转动 &#34;开启&#34; 在操作前至少1小时开启生物安全柜的紫外灯。将密封的A培养基和B培养基瓶置于37 °C水浴中预热1小时。</li>
		<li>用70%乙醇水溶液喷洒125 ml带通气盖的锥形培养瓶、移液器、移液枪和预热的培养基瓶进行消毒。将这些物品放入生物安全柜中。注意：仅对125 ml锥形培养瓶外层的塑料包装进行消毒，且仅在将其移入生物安全柜后方可拆除包装。</li>
		<li>对于30 ml培养液，吸取26 ml培养基A和3 ml培养基B（占最终培养液体积的10%），转移至125 ml锥形培养瓶中，轻轻振荡混匀（此后称为新鲜培养基）。</li>
		<li>将一管在 -80 °C 冻存的 HEK293F 细胞置于冰上，转移至细胞培养室。注意：HEK293F 细胞的提供密度为 1 × 107 细胞/毫升</li>
		<li>将冻存管在37 °C水浴中轻轻温育，以部分解冻细胞（约需1分钟，细胞不应完全解冻）。用70%乙醇水溶液擦拭冻存管外壁进行消毒，然后将其转移至生物安全柜中。</li>
		<li>使用1 ml移液器吸取细胞悬液（约0.7 ml），转移至含有29 ml新鲜培养基的125 ml锥形瓶中。盖紧培养瓶盖，将其放入恒温摇床中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养维护：检测细胞密度、活力及传代次数
	<ol>
		<li>解冻培养物24小时后，按照以下方案检测细胞密度。注意：解冻后需将细胞培养24小时，以确保细胞正常生长及存活率 &#62;80%.</li>
		<li>用70%乙醇水溶液对培养瓶进行消毒，并将其移入生物安全柜中。</li>
		<li>使用1 ml移液器和移液器，缓慢吸取100 μl悬浮培养液，转移至无菌的0.5 ml离心管中。盖好管盖，并尽快将培养瓶放回摇床。</li>
		<li>将7.5 μl台盼蓝溶液与7.5 μl细胞混合。取7.5 μl细胞/台盼蓝混合液，充分混匀后转移至计数载玻片。</li>
		<li>打开自动细胞计数仪，将计数载玻片放入加载室。自动读取器将被激活，自动计数细胞，结果以每毫升细胞数量和细胞活力百分比表示。</li>
		<li>确定在细胞密度为 0.3 x 10 时，将供体培养物转移至新鲜培养基所需的体积6 活细胞/毫升 
		注：参见补充材料中的示例计算。</li>
		<li>重复步骤 1.1.2 和 1.1.3 的 &#34;1.1 培养物接种&#34; 参照上述方案准备新鲜培养基所需的材料。</li>
		<li>将培养基A（23 ml）和培养基B（3 ml）转移至一个新的125 ml培养瓶中。将培养基A和培养基B的储备瓶从生物安全柜中移出。 
		注意：培养基瓶的储备不应与HEK 293F细胞同时存放于生物安全柜中，以降低污染储备培养基瓶的风险。</li>
		<li>从培养箱中取出HEK293细胞培养物，用70%乙醇水溶液喷洒消毒。使用新的移液管，从培养物中吸取细胞分装液（4 ml，该体积根据步骤1.2.6确定），转移至含有新鲜培养基的培养瓶中。</li>
		<li>将两种培养物从生物安全柜转移至按照1.1.1节设定的摇床培养箱中。培养细胞至密度约为2-3 × 10⁶ 个/mL。6 活细胞/毫升 
		注意：细胞的倍增时间约为32小时，达到此密度需要3-4天。在首次转染前，将细胞培养3-4代，以获得稳定的细胞生长模式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备转染所需材料
<ol>
	<li>准备 HEK293 细胞（第 1 天）
	<ol>
		<li>根据步骤 1.2，在转染前 24 小时，将细胞传代至新鲜的培养基 B 中，细胞密度为 1 × 106 个细胞/ml。 
		注意：转染培养的体积取决于细胞数量。较大体积的转染培养（&#62;20 ml）在此阶段需要更大体积的细胞培养物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备材料储备液
	<ol>
		<li>配制线性聚乙烯亚胺（PEI）的储备液，浓度为 1 mg/ml，溶剂为含 25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 150 mM NaCl 的缓冲液（pH 7.5）。充分溶解 PEI，此过程在室温下可能需要 30–60 分钟。通过 0.22 μm 滤器过滤除菌，长期保存置于 -20 °C。</li>
		<li>制备无菌质粒 DNA（根据步骤 2.2.2.1–2.2.2.4）。质粒构建方法在其他文献中有描述42。此处简要说明 DNA 制备流程：
		<ol>
			<li>将含有 pGEn2 载体的化学感受态 Escherichia coli 细胞接种于 1 L LB 培养基（胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化钠 10 g/L）中，并添加 100 μg/ml 氨苄青霉素。在非加湿、振荡培养箱中于 37 °C 培养 E. coli。</li>
			<li>根据生产商的 DNA 纯化方案，纯化编码目标质粒 DNA 的 pGEn2 载体。</li>
			<li>为确保质粒 DNA 完全无菌，应在生物安全柜内完成 DNA 提取过程中的最终异丙醇沉淀和重悬步骤。</li>
			<li>向洗脱的 DNA 中加入质粒提取试剂盒中指定体积的异丙醇，于 10,000 × g 离心 10 分钟。用 70 % 乙醇水溶液对外部 DNA 容器进行消毒后，转移至生物安全柜内。使用移液器弃去上清异丙醇，空气干燥 DNA 沉淀。干燥后，将沉淀重悬于无菌的 10 mM Tris 缓冲液（pH 8.0）中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制 220 mM 丙戊酸（VPA）水溶液储备液，并通过无菌 0.22 μm 滤器过滤除菌。溶液保存于 -20 °C，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 建立瞬时转染&#160;
<ol>
	<li>转染（第0天）
	<ol>
		<li>通过执行步骤 1.2.2 至 1.2.5 检查细胞密度 &#34;1.2. 细胞培养维持&#34; 上述。确定用于转染的细胞数量（2.5–3.0 × 106 活细胞数/mL，存活率 &#62;95%）。参见补充材料中的示例计算。</li>
		<li>使用无菌血清移液管，将上一步计算出的悬浮培养细胞体积（此处为67 ml）转移至250 ml离心管中。在100 × g条件下离心5分钟，收集细胞。</li>
		<li>同时，根据步骤 1.1.3 配制新鲜的转染培养基 &#34;1.1 培养物接种&#34; 如上所述。参见补充材料中的示例计算。同时，将5 ml新鲜培养基转移至无菌15 ml离心管中，备用。</li>
		<li>将含有细胞沉淀的离心管转移至生物安全柜中，先用70%乙醇水溶液对外管壁进行消毒，然后使用无菌移液管弃去含有用过的培养基的上清液。</li>
		<li>用10 ml新鲜培养基通过移液吹打重悬沉淀细胞，充分混匀后转移至含有新鲜转染培养基（按步骤3.1.3制备）的培养瓶中。拧紧通气细胞培养瓶的瓶盖，将培养瓶放入已设定好的培养箱（如1.1.1所述）中，在振荡条件下孵育15分钟至1小时。</li>
		<li>在此期间，使用新鲜培养基（取自上述步骤 3.1.3 中移出的 5 ml 培养基）将质粒 DNA 和 PEI 储液稀释至终浓度为 0.5 μg/μl。参见补充材料中的示例计算，以确定 DNA 和 PEI 的使用量。将含有分散细胞的培养瓶转移至生物安全柜中。</li>
		<li>加入质粒DNA（300 μl，0.5 μg/μl），使用微量移液器混匀，轻轻手动摇动混合。加入PEI（900 μl，0.5 μg/μl），轻轻摇动混合。加入3.8 ml步骤3.1.3中准备的新鲜培养基，将培养瓶转移至摇床培养箱中，培养24小时。</li>
		<li>按照步骤1.1清洁生物安全柜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>稀释（第1天）（适用于50 ml转染体积）
	<ol>
		<li>将转染后的细胞培养物孵育24小时。</li>
		<li>使用无菌的1 ml刻度吸管吸取1 ml预热的220 mM丙戊酸（VPA；按步骤2.2.3制备），转移至无菌的50 ml离心管中。</li>
		<li>用无菌血清移液管吸取5.0 ml预热的培养基B和44 ml预热的培养基A，加入VPA溶液中，配制50 ml新鲜培养基，VPA终浓度为4.4 mM。</li>
		<li>将转染后的培养物移至生物安全柜中，用70%乙醇水溶液擦拭锥形瓶外表面进行消毒，加入预先配制的稀释培养基，然后将锥形瓶转移回摇床培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表达与收获（第2-6天）
	<ol>
		<li>将细胞继续培养4-5天（转染后总计5-6天）。</li>
		<li>在完成1.2.2至1.2.5步骤后，取出等量培养基样品。 &#34;1.2. 细胞培养与维持&#34; 使用无菌的1 ml血清移液管吸取上清液，以监测细胞活力，并保存等分试样，用于通过SDS-PAGE分析每日的蛋白表达（见下文第5节）。</li>
		<li>在培养5-6天后，将细胞连同培养基在1,000 g离心5分钟以收集细胞。此外，若细胞活力低于50%，还需收集上清液（见步骤1.2.2–1.2.5）。</li>
		<li>倒掉含有分泌蛋白的上清液。向HEK细胞沉淀中加入5 ml 10%次氯酸钠溶液，按生物危害物处理并丢弃。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 蛋白质纯化
<ol>
	<li>准备一个含有5 ml Protein-A Sepharose的层析柱。用5个柱体积的缓冲液A（20 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS），pH 7.4，100 mM NaCl）平衡层析柱。</li>
	<li>将收集的含表达蛋白的上清液高速离心（14,000 g，10分钟），以去除残留的细胞碎片。倾倒上清液至新离心管中收集。将沉淀作为生物危害物丢弃。</li>
	<li>取10 μl上清液作为等分试样，并在每个蛋白纯化步骤中额外收集少量样品，用于后续SDS-PAGE分析（见第5节）。将澄清后的上清液上样，并收集穿流组分。</li>
	<li>用3个柱体积的缓冲液A洗涤层析柱，然后用5个柱体积的100 mM甘氨酸（pH 3.0）洗脱蛋白。将洗脱液收集于含有等体积1 M TRIS缓冲液（pH 8.0）的收集管中，以迅速中和pH。</li>
	<li>用10个柱体积的缓冲液A洗涤层析柱，随后保存以供后续使用。</li>
	<li>使用10 kDa分子量截留的离心过滤器，将洗脱的蛋白置换至至少10倍体积过量的缓冲液A中。注意：不要将洗脱样品浓缩至极低体积（&#60;2 ml）的洗脱缓冲液中。应使用离心过滤器完成缓冲液置换至缓冲液A。</li>
	<li>将纯化的蛋白于4 °C保存，直至后续使用。 
	注意：在上清液中表达的蛋白可根据蛋白特性或使用亲和标签选择相应的亲和层析柱进行纯化。典型的纯化方法中，IgG或Fc片段可使用Protein A柱，而带有聚组氨酸标签的蛋白则可使用镍柱。此处以Protein A柱纯化IgG1-Fc为例，描述其纯化步骤。</li>
</ol>
5. 通过SDS-PAGE分析蛋白质
<ol>
	<li>将每个样品的等分试样（7.5 μl）与等体积的2倍上样缓冲液（0.125 M Tris，pH 8.0，4% SDS，10% β-巯基乙醇，20% 甘油和0.01% 溴酚蓝）混合稀释。</li>
	<li>使用加热块或水浴在90 °C下煮沸混合物5分钟。将样品在10,000 g下离心1分钟。使用带一次性吸头的20 μl移液器，向制备好的凝胶中加入5 μl蛋白标记物和14 μl样品进行分析。</li>
	<li>以25毫安电流运行一块凝胶60分钟。电泳步骤完成后，将凝胶转移至含有1 L水的容器中，并微波加热5分钟。</li>
	<li>用染色液（40%乙醇，10%乙酸和0.1%考马斯亮蓝）染色2小时，然后用水脱色。</li>
</ol>
6. 质谱法分析糖类
<ol>
	<li>按先前所述方法分析糖链44。简言之，将75 μg IgG1-Fc进行胰蛋白酶消化，然后用PNGaseF处理以释放糖链45。释放的糖链经完全甲基化后，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOFMS）进行分析。</li>
</ol>
7. 特殊情况下的方案调整
<ol>
	<li>使用15N标记的氨基酸对蛋白质进行标记（适用于50 ml转染体积）
	<ol>
		<li>将每种氨基酸各5 mg分装至一个无菌玻璃小瓶中，加入4 ml经高压灭菌的水重悬（注意：酪氨酸（Tyr）不会完全溶解，而赖氨酸（Lys）和苯丙氨酸（Phe）则可完全溶解）。在121 °C下高压灭菌15分钟以灭菌溶液。待溶液冷却至约50–60 °C。</li>
		<li>对于50 ml的转染体积，按照&#34;3.1 建立瞬时转染&#34;中的步骤3.1.3操作。适当体积的示例请参见补充材料部分。</li>
		<li>进行转染时，使用上述制备的含标记氨基酸残基的新鲜培养基，按照&#34;3. 建立瞬时转染&#34;中的步骤操作。</li>
		<li>转染24小时后，在进行培养物稀释当天，取5.0 ml预热的B培养基、40 ml预热的A培养基，以及4 ml新近高压灭菌的氨基酸混合物（按上述步骤7.1.1制备），并加入1 ml预热的VPA储备液，配制成50 ml新鲜稀释培养基，其中VPA的终浓度为4.4 mM。使用无菌移液管将该培养基加入转染培养物中。</li>
		<li>用70%乙醇水溶液对外部消毒后的培养瓶进行灭菌处理，然后将其转移至生物安全柜中，加入已配制的稀释培养基，再将培养瓶放回恒温摇床中继续培养。 
		注：A培养基为化学成分明确、无血清的培养基，因此可配制不同配方。可联系供应商获取不含特定氨基酸的定制A培养基。虽然可以去除所有氨基酸，但我们更倾向于使用仅缺失少数特定氨基酸的培养基，因为完全缺失氨基酸的培养基在补充后需调整渗透压。我们选用的是缺失Lys-Tyr-Phe的A培养基，该培养基可直接补充且无需调整渗透压。此外，A培养基供应商未公开提供培养基组分的具体浓度；我们曾成功使用Lys、Tyr和Phe各100 mg/L的浓度。转染和表达培养基的体积需根据所添加的氨基酸进行相应调整。以下是上述方案中用于同位素标记的调整说明</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向转染体系中补充小分子
	<ol>
		<li>使用高压灭菌水配制100 mM的2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖（2-deoxy-2-fluoro-l-fucose）储备液，并用0.22 μM滤器对该溶液进行除菌处理。</li>
		<li>对于50 ml培养体系，向转染和稀释培养基中各加入125 μl（终浓度250 μM）的岩藻糖类似物溶液。注：由于在此浓度下添加该替代物仅占总培养体积的0.25%，因此我们未进行额外的体积校正。可通过糖链加工的小分子抑制剂来调控蛋白表达。此处描述的是添加2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖（一种糖链岩藻糖基化抑制剂）的实验条件。我们发现，在转染和稀释培养基中以250 μM浓度添加该岩藻糖类似物，可使岩藻糖基化水平降低&#62;90%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

所有作者声明本稿件不存在竞争性经济利益。

本方案通过瞬时转染HEK293F或S细胞来实现蛋白表达。Barb和Moremen实验室建立的最优转染条件，采用细胞密度与试剂浓度的关键组合，以实现高效的转染效果。实施本方案时需考虑的关键因素包括：转染前维持稳定的细胞培养状态（保持一致的细胞倍增时间）；转染时使用生长活跃的细胞（通过在转染前24小时将细胞稀释至1 × 106 个细胞/ml获得），且细胞活力需高于95%；转染时的细胞密度应为每毫升2.5–3.0 × 106 个活细胞，细胞活力&#62;95%（即转染密度），培养体系中含90%培养基A和10%培养基B；DNA的加入应先于PEI，两者的终浓度分别为3 μg/ml和9 μg/ml31；转染后24小时，用含有4.4 mM丙戊酸的培养基将培养物按1:1稀释，使稀释后培养物中丙戊酸浓度为2.2 mM；随后在37 °C、8% CO2条件下，于湿润摇瓶中继续培养4–5天以进行蛋白生产阶段。本文所述载体经过优化，是可溶性蛋白表达系统的一个重要特征32,42。
如果目标蛋白未能表达...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated.

Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

要获得大量正确折叠且经过适当翻译后修饰的人类蛋白质，以进行结构与功能的详细分析，仍然是一个重大挑战。目前已有多种表达系统可用于生产具有天然样功能和行为的重组蛋白。其中，细菌表达系统（主要是大肠杆菌Escherichia coli菌株）由于其操作简便，成为科研领域中最易获取且最常用的工具，尽管也已有酵母、植物、昆虫和哺乳动物表达系统的相关报道1-4。然而，这些系统中的大多数无法对目标蛋白进行恰当的翻译后修饰。Barb 和 Moremen 实验室的一个核心研究兴趣是生产具有正确糖基化修饰的真核蛋白。许多人类蛋白需要正确的糖基化才能发挥正常功能（见5）。
真核生物的糖基化机制十分复杂，能够进行多种修饰，包括天冬酰胺（N）连接和丝氨酸/苏氨酸（O）连接的复杂聚糖6。据估计，超过&#62;50%的人类蛋白质具有N-糖基化修饰7。聚糖是许多蛋白质的重要组成部分，例如治疗性单克隆抗体、促红细胞生成素以及凝血因子IX等。尽管目前已存在多种制备适当N-糖基化蛋白质的方法，范围从完全化学合成8-10、化学-酶法合成11-14，到从基因工程重组系统中回收获得15-20，但毫不意外的是，人类表达系统迄今为止仍被证明是生成人源蛋白质最可靠的方法。
许多治疗性人类糖蛋白是利用哺乳动物细胞的重组系统生产的。常用的系统包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、小鼠骨髓瘤（NS0）细胞、幼年仓鼠肾（BHK）细胞、人胚胎肾（HEK-293）细胞以及人视网膜细胞系，这些细胞系可通过贴壁培养或悬浮培养用于蛋白质生产4,21,22。然而，哺乳动物蛋白表达系统需要建立稳定细胞系，使用昂贵的培养基，并依赖基质辅助的转染方法23。
借助多种试剂可实现哺乳动物细胞转染，这些试剂包括磷酸钙24,25、阳离子聚合物（DEAE-葡聚糖、聚凝胺、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺（PEI））或带正电荷的阳离子脂质体26-29。PEI 是一种多聚阳离子、带电荷的线性或支化聚合物（25 kDa）26，可与 DNA 形成稳定的复合物，并通过内吞作用进入细胞。当内体酸化后，PEI 被认为会膨胀，导致内体破裂，从而将 DNA 释放到细胞质中26,30。
直到最近，悬浮培养中的瞬时转染仍需先形成DNA/PEI复合物，再将其加入细胞培养物中29。然而，Würm及其同事报道了一种在HEK293细胞中优化用于重组蛋白表达的高效方案，该方案在细胞培养体系中就地（in situ）形成DNA/PEI复合物31,32。这种方法避免了复合物的预先制备、灭菌以及缓冲液置换至培养基的步骤。通过进一步优化，加入可增强表达的质粒，显著提高了表达产量33。本文所述方法在此基础上发展而来，具有广泛的适用性。此外，还可通过改变表达条件来影响N-糖链的组成。
HEK293S 细胞系携带一个基因缺失，可使 N-聚糖的加工过程停滞在中间阶段，从而表达出具有均一 N-聚糖的蛋白质，其结构包含 2 个 N-乙酰葡糖胺残基和 5 个甘露糖残基（Man5GlcNAc2）34,35。这些细胞缺乏 N-乙酰葡糖胺基转移酶 I（GntI）基因，而该基因是下游 N-聚糖加工所必需的36,37。使用糖基转移酶抑制剂（包括千金藤素、唾液酸类似物、岩藻糖类似物 2-脱氧-2-氟-岩藻糖）也可产生类似效果，限制 N-聚糖的加工过程38-41。
本方案采用如图142,43所示的pGEn2载体，通过PEI辅助的瞬时转染法将质粒转入哺乳动物细胞系（HEK293F或HEK293S细胞），并获得大量正确糖基化的蛋白产物。该系统具有良好的稳定性，可适用于多种因素的调控，包括同位素标记和糖链工程，以实现高滴度重组蛋白的生产。

<table><tbody><tr><td>生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>NuAire, Inc.</td><td>CellGard ES NU-S475-400</td><td>II级A2型生物安全柜</td></tr><tr><td>恒温振荡培养箱</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Multitron Cell&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养基A：FreeStyle表达培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>培养基B：ExCell 293无血清培养基&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>14571C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>125 mL带通气盖的锥形瓶</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431143</td><td></td></tr><tr><td>250 mL带通气盖的锥形瓶</td><td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle HEK 293F细胞</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>1 mL一次性移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10B</td><td></td></tr><tr><td>10 mL一次性移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 mL一次性移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>移液器（Pipet-Aid XP）</td><td>Drummond Scientific</td><td>161263</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>TC20全自动细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td>用含25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和150 mM NaCl（pH 7.5）的缓冲液配制浓度为1 mg/mL的储存液。完全溶解PEI后，经0.22 &amp;mu;m针头滤器除菌，于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>25 mm针头滤器，0.22 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>222249</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fluka Analytical&amp;nbsp;</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BDH chemicals</td><td>BDH8014</td><td></td></tr><tr><td>质粒纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td></td></tr><tr><td>丙戊酸（VPA）</td><td>SIGMA</td><td>P4543</td><td>用水配制220 mM&amp;nbsp;的储存液，经无菌0.22 mm滤器过滤除菌后，于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>EW-17707-65</td><td></td></tr><tr><td>蛋白A-Sepharose柱</td><td>SIGMA</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>QIAGEN</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa截留分子量Amicon&amp;reg;超滤离心管&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>ALDRICH</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>ALDRICH</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>SIGMA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue标准蛋白</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N标记的L-酪氨酸</td><td>ALDRICH</td><td>332151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N标记的L-赖氨酸</td><td>ALDRICH</td><td>592900</td><td></td></tr><tr><td>未标记的L-苯丙氨酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C6-葡萄糖</td><td>ALDRICH</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖&amp;nbsp;</td><td>SANTA CRUZ Biotechnology</td><td>sc-283123</td><td></td></tr></tbody></table>

悬浮培养hek293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

制备具有复杂翻译后修饰的重组蛋白是结构与功能研究中面临的主要挑战之一。通过瞬时转染哺乳动物细胞系实现快速建立并获得高表达量，可有效克服这一障碍，尤其适用于天然经由内质网和高尔基体介导的分泌途径转运的蛋白质表达。本文介绍一种利用人源HEK293F和HEK293S细胞系表达蛋白的方案，该方法采用专为高产量蛋白表达设计的哺乳动物表达载体。该系统的适用性通过三种代表性糖蛋白的表达得以验证，每升培养液可纯化获得95–120 mg蛋白。这些蛋白包括人FcγRIIIa和大鼠α2-6唾液酸转移酶ST6GalI（两者均带有N端GFP融合标签），以及未经修饰的人免疫球蛋白G1 Fc片段。该高效表达系统采用无血清培养基，适用于制备用于质谱和核磁共振波谱结构研究的同位素标记蛋白与糖类。此外，通过添加小分子化合物可调控N-聚糖的组成，以阻止特定的糖链修饰，且不影响蛋白表达产量。

高水平的蛋白表达与纯度
该优化表达系统可高效产出糖基化蛋白。图中展示了IgG1-Fc表达的典型模式（图1）。在此情况下，第0天为转染日，随后为第1天（稀释）及持续培养至第5天。通过粗培养基中的可溶性表达组分分析蛋白表达。在第1天观察到极少量的蛋白表达，因为培养物稀释后3小时即取样。若使用GFP标记的蛋白，则可通过培养基中明显的绿色更直观地观察表达情况。从第2天到第5天，GFP-FcγRIIIa和GFP-ST6GalI的表达均呈现此类上升趋势。在第4天与第5天之间未观察到表达量的显著增加。第5天时，细胞被 &lt;50% 存活率，因此收获培养物以限制蛋白水解。使用 Protein A 柱对 IgG1 Fc 进行亲和纯化，或使用镍柱对 GFP-FcγRIIIa 进行亲和纯化，均获得高纯度蛋白（&gt;99%; 图2），产率（表1）以及完全的糖基化（数据未显...

利用适当的翻译后修饰在实验室规模生产真核蛋白仍面临重大障碍。本文提供了一种基于哺乳动物表达系统的蛋白质表达方案，具有建立迅速、周期短的优点。该系统支持氨基酸选择性标记、蛋白质选择性标记以及糖链组成的小分子调节剂。

悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

生产具有复杂翻译后修饰的重组蛋白的技术对于结构与功能研究而言是一项重大挑战。

本实验的总体目标是通过将重组蛋白靶向至内质网和高尔基体介导的分泌途径，实现具有适当哺乳动物糖基化的哺乳动物糖蛋白的表达。该方法有助于回答免疫学领域的一些关键问题，例如特定结构特征在抗体及抗体片段的结构模式及其免疫激活潜能中所起的作用。该技术的主要优势在于利用人类细胞表达人类蛋白质，从而提供适当的细胞环境，以实现目标蛋白的正确折叠和修饰。用于细胞建立的摇床培养箱应在接种培养物前至少一小时以135 RPM、80%湿度、8%二氧化碳和37°C的条件运行。打开生物安全柜的紫外灯，将密封的培养基A和培养基B瓶置于37°C水浴中预热。关闭紫外灯，并用70%乙醇与水的混合溶液对生物安全柜进行消毒。使用70%乙醇水溶液喷洒125毫升带通气盖的锥形培养瓶、移液管、移液器及预热的培养基瓶，进行灭菌处理。在整个操作过程中，将这些物品放置于生物安全柜内。所有物品在移入生物安全柜之前，均须以此方式灭菌。通过移取26毫升培养基A和3毫升培养基B，配制30毫升新鲜培养液，并转移至125毫升锥形瓶中。轻轻摇晃混匀。将一管先前在-80摄氏度冰箱中冻存的HEK 293F细胞置于37摄氏度水浴中温育，使其部分解冻。解冻过程约需1分钟，细胞不应完全解冻。接下来，用70%乙醇水溶液对冻存管外壁进行消毒，并将其转移至生物安全柜中。使用1毫升移液器吸取细胞悬液，转移至含有29毫升新鲜培养基的125毫升锥形瓶中。盖紧培养瓶盖，将培养瓶放入摇床培养箱中培养24小时。接种培养后24小时。检查细胞密度，用70%乙醇与水的混合溶液对培养瓶进行表面消毒，然后将其转移至生物安全柜中。使用1毫升移液器缓慢吸取100微升培养液，转移至无菌的0.5毫升离心管中。尽快关闭培养瓶的盖子，并将培养瓶放回摇床培养箱中。取7.5 µL台盼蓝溶液与7.5 µL细胞混合，充分混匀后，转移7.5 µL混合液至计数载玻片上。打开自动细胞计数器，将计数板放入加载室中。自动读取器将被激活，细胞将自动计数，结果以每毫升细胞数和存活率百分比表示。根据计数结果，确定为获得每毫升30万个活细胞的密度，需转移至新鲜培养基中的供体培养物体积。按照先前方法，将23毫升培养基A和3毫升培养基B转移至一个新的125毫升培养瓶中，制备新鲜培养基。随后，将培养基A和培养基B的储备瓶从生物安全柜中移出，以降低污染风险。从培养箱中取出HEK 293 F细胞培养瓶。用70%乙醇水溶液喷洒，并将其放入生物安全柜中。使用新的移液器，从培养物中吸取正确体积的细胞，转移至含有新鲜培养基的培养瓶中。将两份培养物从生物安全柜转移至摇床培养箱中。转染前将细胞培养至每毫升约200万至300万个活细胞的密度。按照之前演示的方法检测细胞密度，并确定转染所需的细胞数量。使用无菌血清移液管。将适量体积的细胞悬液转移至250毫升离心管中。在100 × g条件下离心5分钟以收集细胞。灭菌后，将含有细胞沉淀的离心管转移至生物安全柜中。使用无菌移液管弃去含有用过的培养基的上清液，用 10 毫升新鲜培养基通过上下吹打重悬沉淀的细胞，并转移至含有新鲜转染培养基的预置培养瓶中。拧紧通气细胞培养瓶的瓶盖，将培养瓶置于摇床培养箱中孵育 15 分钟至 1 小时，期间继续培养细胞。使用新鲜培养基将血浆DNA和聚醚胺（POLYETHERAMINE）或PEI储备液稀释至终浓度为每微升0.5微克。从摇床培养箱中取出含有分散细胞的培养瓶，转移至生物安全柜中，用微量移液器向培养液中加入300微升血浆DNA，轻轻手动振荡混匀，再加入900微升PEI，再次混匀。然后加入3.8毫升新鲜培养基。将烧瓶转移至摇床培养箱中培养24小时。转染后24小时，必须对细胞培养物进行稀释。首先准备稀释培养基：使用无菌的1毫升血清移液管吸取1毫升预热的220毫摩尔戊二酸（PREWARM 220 millimolar valproic acid 或 VPA），转移至无菌的50毫升离心管中。接着，使用无菌刻度移液管向VPA溶液中加入5毫升预热的B培养基和44毫升预热的A培养基，得到50毫升新鲜培养基，其中VPA的终浓度为4.4毫摩尔。从培养箱中取出转染后的培养物。对烧瓶外部进行灭菌，并将烧瓶放入生物安全柜中。向培养物中加入已配制的稀释培养基。转染后，将烧瓶转移回摇床培养箱中继续培养四到五天。通过之前演示的方法每天监测细胞活力。应在转染后第五至第六天，或当细胞活力降至50%以下时，每天取样保存用于蛋白质表达分析。通过以1000 × g 离心5分钟收集细胞及培养基来收获细胞。收集含有分泌蛋白的上清液，并向HEK细胞沉淀中加入5 mL含10%次氯酸钠的溶液，按生物危害物处理弃去。随后，从收集的上清液中纯化蛋白。该表达系统可高效表达糖基化蛋白，如HK293F细胞瞬时转染后人IgG1 Fc的典型表达模式所示。利用蛋白柱对IgG1 Fc进行亲和层析，或利用镍柱对带有组氨酸标签的GFP与Fcγ受体3A融合蛋白进行纯化，均可获得高纯度的蛋白。该系统在此二维核磁共振谱中高效表达了同位素富集的IgG单克隆抗体Fc段，该谱图关联了氢核的共振频率与直接相连的酰胺氮原子。观察到15个原子分散良好的信号。在不同培养条件下，利用HEK 293F和HEK 293S细胞产生了不同的糖型，基质辅助激光解吸电离质谱分析结果如图所示。由HEK 293S细胞表达的IgG一种Fc所携带的聚糖为五甘露糖加两个N-乙酰葡萄糖胺残基的结构形式，不含岩藻糖基化聚糖；而由HEK 293F细胞表达的材料中的聚糖则为复杂的双天线型结构，具有核心岩藻糖，并主要以末端N-乙酰葡萄糖胺为主，或含有少量单唾液酸化或双唾液酸化形式。在使用HEK 293F细胞进行表达时，若添加聚糖岩藻糖基化抑制剂，可使岩藻糖掺入量减少超过90%。一旦掌握，瞬时转染操作可在第一天完成，耗时约1.5小时，第二天仅需15分钟。经过四至六天的表达期后，含目标蛋白的溶液可在15分钟内完成收获。最后，纯化该蛋白大约需要1.5小时。在进行此操作时，重要的是要记住在转染前维持稳定的细胞培养状态，转染时应使用处于活跃生长期的细胞，并在加入PEI之前先加入DNA。完成此操作后，可采用多种生物物理技术对蛋白进行功能表征，以研究该表达的糖蛋白在获得后的结构与功能。该技术为免疫学领域的研究人员探索IgG的结构-活性关系及其在体外和体内糖基化的功能铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用K 2 93 F细胞与PZ N two载体组合来制备和纯化糖蛋白。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

重组人蛋白与HEK293悬浮细胞的瞬时转染高产表达

优化的转染策略用于在HEK-293T细胞中表达及记录重组电压门控离子通道的电生理特性

在后人类基因组时代，天然构象重组蛋白的可获得性对于结构、功能及治疗相关的研究与开发至关重要。本文介绍了一种在人胚胎肾293T细胞中进行小规模及大规模蛋白表达的系统，可用于生产多种重组蛋白。...

一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

该视频展示了一种利用稳定转染的哺乳动物细胞生产治疗性抗体的方法。添加胰蛋白胨可促进细胞分裂，导致细胞过度生长，并支持更高的抗体产量。收集含抗体的培养基，经过滤后储存，以供后续使用。...

转染哺乳动物细胞的批量过量培养中抗体的生产

利用哺乳动物系统表达重组蛋白正成为生产用于结构生物学研究的蛋白复合物的一种颇具吸引力的方法。本文介绍了一种简单且高效的表达系统，该系统利用悬浮培养的哺乳动物细胞来纯化用于结构研究的蛋白复合物。...

用于结构生物学研究的重组蛋白表达：在HEK 293F悬浮细胞中的一种新颖且易于实现的方法

本文介绍了一种使用HEK293T细胞的低成本颗粒酶表达系统，该系统可产生高产量、高纯度、完全糖基化且具有酶活性的蛋白酶。...

一种高效且低成本的人类颗粒酶在哺乳动物细胞中的表达系统

这是一种快速且成本效益高的方案，用于表达分泌型糖基化哺乳动物蛋白，并通过单步纯化获得足量均一的蛋白，适用于X射线晶体学及其他生物物理研究。...

用于结晶的高效哺乳动物细胞表达及胞外糖蛋白单步纯化

本方案描述了在哺乳动物表达系统中生产治疗性抗体的方法。所述方法包括载体DNA的制备、人胚胎肾293细胞系的稳定转染和无血清适应、大规模培养体系的建立，以及利用亲和层析进行纯化。...

治疗性抗体的小规模生产与纯化

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通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

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培养昆虫细胞中重组蛋白的瞬时表达与细胞定位

我们提供了可扩展的实验方案，涵盖在HEK293细胞中设计构建体、瞬时转染以及全长人源亨廷顿蛋白变体的表达与纯化。...

利用瞬时表达系统在哺乳动物细胞中高效且可扩展地生产全长人源亨廷顿蛋白变体

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利用HEK293悬浮细胞生产高产量腺相关病毒载体批次

学习利用HEK293悬浮细胞瞬时转染技术高效表达重组人蛋白的方法，通过内质网和高尔基体分泌途径实现哺乳动物糖基化修饰。该技术为免疫学研究中抗体结构与功能分析提供了可靠的蛋白表达平台。

悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

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