单元位置的Imaging-和流式细胞仪为基础的分析和3D球体黑色素瘤细胞周期
December 28th, 2015
我们描述了两种互补方法，使用荧光泛素化细胞周期指示剂 （FUCCI） 和图像分析或流式细胞术来识别和分离 3D 球体内部 G1 期停滞和外部增殖区域中的细胞。
与 2D 细胞培养相比，该方法的总体目标是根据细胞周期状态和在类固醇中的位置来识别、表征和分离多细胞类固醇中的细胞。3D OID 模型通过将球体与流式细胞术和成像技术配对，模拟肿瘤结构及其微环境，概括了体内癌症的生物学特性。这种方法可以回答癌症领域的关键问题，例如肿瘤微环境如何改变药物敏感性、细胞运动和增殖。
这种方法的主要优点是它可以实时可视化细胞周期，并允许从特定的类固醇区域纯化活细胞，证明该程序将完成 我们实验室的一位研究助理 通过在 100 毫升汉克平衡盐溶液或 HBSS 中微波 1.5% aros 开始准备 3D 类固醇形成，或间歇性旋转烧瓶 3 到 5 分钟以确保AROS 已完全溶解。然后立即将 100 微升 aros 溶液移液到平底 96 孔组织培养板的每个孔中。将板在室温下孵育 1 小时，让 aros 凝固。
接下来，从细胞培养箱中取出表达 FCI 构建体的黑色素瘤细胞的 80% 汇合细胞培养物。用 10 毫升 HBSS 洗涤细胞。加入 1.5 毫升 0.05% 的 EDTA 溶液，然后将细胞在 37 摄氏度下孵育约 2 分钟。
一旦细胞分离复苏，将它们悬浮在 10 毫升细胞培养物中。中等。使用血液、细胞仪和倒置显微镜手动计数细胞，并在细胞培养基中将其稀释至每毫升 25， 000 个细胞。然后吸取 200 微升细胞悬液，以覆盖 96 孔 aros 板的每个孔。
将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育约三天，以形成细胞球体。孵育后，使用 Forex 物镜和相差滤光片在倒置显微镜上对球体进行成像。球状体应表现为紧凑的、大致球形的细胞聚集体，以准备用于切片和成像的细胞类固醇。
使用 1 毫升移液器将它们移动到 falcon 管中。然后让类固醇沉淀在锥形瓶的底部。接下来，去除培养基 bi 吸力，然后在室温下在 10% 中性缓冲福尔辛中孵育至少两个小时来固定球体。
然后，在细胞切片和成像后，可以将 SP 在 4 摄氏度的 HBSS 中储存数天。Sphe 打开图像分析软件并选择仅定量配置。然后创建一个新库，并通过将原始数据文件拖动到库中来导入球状体共聚焦图像文件。
接下来，转到 measurements 选项卡，通过在协议窗口中按正确顺序拖放命令来构建图像分析协议。要在绿色通道中查找对象，请将查找部分的 find objects 命令拖放到协议窗口中，然后选择适当的通道。添加在 processing 下找到的 open 命令，然后添加单独的触摸对象命令来分隔单元格。
最后，在筛选部分中，按大小添加和排除对象。用于小于 50 微米的物体的命令，以排除较小的非蜂窝物体。接下来，将新的 find objects 命令拖放到协议窗口中。
按照相同的步骤，选择红色通道并应用所有后续命令。找到对象后，使用 hide channel 或 show channel 命令直观地确保红色和绿色对象对应于红色和绿色原子核。如有必要，请单击 measurements （测量），然后单击 feedback 选项以修改对象掩码的外观。
现在，要查找与早期 S 期单元格相对应的黄色对象，请使用组合部分中的 intersect 命令，然后选择 interset red objects with green objects（将红色对象与绿色对象相交）。同样，按小于 50 微米的大小排除对象。要识别 G 单相单元，请使用组合部分中的 subtract 命令，然后选择 subtract yellow object from red objects （从红色对象中减去黄色对象） 以仅查找红色对象。
同样，从绿色对象中减去黄色对象，以识别与纯红色和纯绿色对象的 SG 2 和 MPH 相位单元相关的纯绿色对象。通过从过滤部分应用形状因子大于 0.25 的 filter population 命令，根据需要删除非蜂窝对象。然后找到 S 椭球体轮廓。
使用绿色或红色通道中查找部分中的 find objects 命令。使用 processing 部分中的 closed 命令将各个单元格合并为一个对象。然后添加 fill holes in objects 命令以填充 sphe 中的孔。
接下来，使用精细过滤器从 Sphero 对象中去除噪点。通过选择 Exclude objects by size （按大小排除对象） 以删除小于 30， 000 微米的对象，完成查找椭球体轮廓。定义所有对象后，添加从相关截面的测量距离，以确定从每个 OID 到 S 椭球体轮廓边缘的距离。
在每个黄色、纯红色和纯绿色种群中执行此作。要可视化从单元到最近的 S 椭球体边缘的最小距离，请打开 measurements 选项卡，然后选择反馈选项，然后选择关系。然后选择 show distances（显示距离）。
最后，保存协议以保存协议创建的数据。从 measurement 部分中选择 make measurement item。然后要解释数据，选择测量项，转到测量部分的分析选项卡，然后选择分析菜单下的分析，以计数在距类固醇边缘一定距离处发现的细胞。
通过从 analysis 选项卡中选择 filter 来创建过滤器。例如，仅显示与球体边缘的距离小于 100 微米的数据。要导出原始数据，请选择 导出 从 文件 选项卡，然后将数据另存为逗号分隔或受制表符限制的文本。
这些数据可以在电子表格程序中打开以进行进一步分析。从 C 8 1 16 1 生成的细胞 sphe。用 Fuji 系统转导的人黑色素瘤细胞被固定和切片。
对 AZA 绿色进行共聚焦成像，前者标记细胞周期的 SG 2 M 期细胞，后者标记 G 1 期的细胞。当这些图像重叠时，可以按预期观察到坏死的核心等关键特征。红色 G 一个停滞细胞在靠近这个坏死核心的地方占主导地位，而红色和绿色增殖细胞以梯度方式向类固醇的外缘增加，或者获得氧气和营养物质的机会最大。
在半自动图像分析之后，可以定义 fucci 细胞掩码和 S 球状体轮廓。使用成像软件定量 S 球体内部或外部区域的红色和绿色细胞。该分析表明，G 一期停滞细胞在内部区域富集，而增殖细胞在靠近类固醇 Edge 的地方占主导地位。
一旦掌握，这项技术可以在一到两周内完成，这个时间范围包括种植类固醇、成像和分析。按照这些程序，可以将 rads 植入胶原蛋白基质中，然后通过 TimeLapse 显微镜成像。然后可以对它们进行蛋白质或 RNA 分析，这可以帮助我们回答诸如类固醇中的位置以及获得氧气和营养物质是否会改变癌细胞表型等问题。
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概述
本文介绍了两种互补方法，利用荧光泛素化细胞周期指示器（FUCCI）以及图像分析和流式细胞术。这些技术旨在基于3D球体内的细胞周期状态来识别和分离细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 癌症研究
- 3D细胞培养
背景
- 3D球体模拟肿瘤结构和微环境。
- 理解细胞周期状态对癌症研究至关重要。
- 传统的2D培养不能准确代表体内条件。
- 流式细胞术和成像技术增强了分析能力。
研究目的
- 识别和表征不同细胞周期阶段的细胞。
- 从3D球体中分离特定的细胞群体。
- 研究肿瘤微环境对细胞行为的影响。
所用方法
- 荧光泛素化细胞周期指示器（FUCCI）用于可视化。
- 图像分析用于评估细胞周期状态。
- 流式细胞术用于细胞分离。
- 使用组织培养板中的aros制备3D球体。
主要结果
- 成功识别了内G1停滞和外增殖细胞。
- 实现了细胞周期动态的实时可视化。
- 从球体的特定区域分离活细胞得到证明。
- 洞察了肿瘤微环境如何影响药物敏感性和增殖。
结论
- 这些方法为研究癌症生物学提供了一种稳健的方法。
- 实时分析增强了对3D模型中细胞行为的理解。
- 这些技术可以为癌症治疗策略提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding spatial heterogeneity in tumor spheroids enables mechanistic de-risking of target validation by linking cell cycle status to microenvironmental cues. This approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying proliferation gradients and quiescent niches relevant to drug penetration and resistance. It informs portfolio triage by identifying subpopulations most likely to drive recurrence or therapeutic escape.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping G1 arrest and proliferation to spheroid regions, clarifying pathway dependencies in hypoxic versus nutrient-rich zones.
- Operational Value: Enables isolation of live cells from defined zones for downstream functional assays, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantifiable cell cycle readouts for compound screening, ensuring assay relevance to 3D architecture.
- Operational Value: Standardizes spatial and phenotypic outputs via image analysis, improving reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling necrosis, quiescence, and proliferation gradients observed in vivo.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking position-dependent phenotypes to microenvironmental stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of microenvironmental effects on cell cycle, proceeds to screening via standardized spheroid-based assays, and supports translational research through spatially resolved biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating cell position with cell cycle phases to clarify drug response mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable red/green cell ratios in inner/outer spheroid regions, enabling compound effect tracking.
- Analytics: Provides distance-from-edge measurements and phase-specific masks as quantitative outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling oxygen/nutrient gradients that influence cancer cell phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal tracking of cell viability, gene expression, or drug response across multiple spheroid generations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through spatial resolution of proliferation and quiescence, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization and scalability via semi-automated image analysis and flow cytometry isolation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by de-risking targets based on microenvironmental responsiveness.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds that penetrate quiescent niches or target cycling cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FUCCI transduction, spheroid culture, and confocal imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy and image analysis software capable of channel segmentation and morphometric filtering.
- Necessitates standardization across cell lines and matrix conditions for reproducible spheroid formation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-melanoma or stromal co-culture systems.
- Limited by sectioning depth and signal penetration in larger spheroids, affecting core region resolution.
