Name: 单元位置的Imaging-和流式细胞仪为基础的分析和3D球体黑色素瘤细胞周期 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习利用FUCCI荧光标记结合成像分析和流式细胞术，在三维黑色素瘤球体中识别并分离不同细胞周期阶段的细胞。该方法可实时追踪细胞周期动态，为肿瘤微环境研究提供可靠工具。

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感谢Danae Sharp女士和Sheena Daignault女士提供的技术协助。感谢日本和光市理化学研究所（RIKEN）的Atsushi Miyawaki博士提供FUCCI载体，感谢美国费城威斯塔研究所（The Wistar Institute）的Meenhard Herlyn博士和Patricia Brafford女士提供细胞系，感谢百年研究所成像与流式细胞术平台提供的卓越技术支持。感谢Chris Johnson先生和Andrew Barlow博士在Volocity软件方面的技术支持。N.K.H. 是澳大利亚黑色素瘤与皮肤癌研究所的Cameron研究员。K.A.B. 是新南威尔士州癌症研究所的研究员（13/ECF/1-39）。W.W. 是新南威尔士州癌症研究所的研究员（11/CDF/3-39）。本研究获得以下项目资助：RG 09-08 和 RG 13-06（新南威尔士州癌症委员会）、570778 和 1051996（优先驱动型合作癌症研究计划/澳大利亚癌症中心/治愈癌症澳大利亚基金会）、08/RFG/1-27（新南威尔士州癌症研究所）以及APP1003637和APP1084893（国家健康与医学研究理事会）。

1. FUCCI 转导与细胞培养
<ol>
	<li>FUCCI 转导
	<ol>
		<li>使用慢病毒共转导，建立稳定表达 FUCCI 构建体 mKO2-hCdt1 (30-120) 和 mAG-hGem (1-100) 的细胞系15，方法如前所述7。 
		注意：FUCCI 系统现已商业化提供。</li>
		<li>通过单细胞分选获得荧光强表达的亚克隆。使用荧光激活细胞分选技术，将同时表达 AG 和 KO（呈黄色）的单细胞分选至 96 孔板中，方法如前所述7,16。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>黑色素瘤细胞培养
	<ol>
		<li>培养 C8161 人黑色素瘤细胞，方法如前所述7,17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 三维球状体形成（如先前所述3,9）
<ol>
	<li>琼脂糖平板制备
	<ol>
		<li>将1.5%琼脂糖（或优质琼脂）溶于100 ml Hank's平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）中，微波加热煮沸3–5分钟，并不断摇动，确保琼脂糖完全溶解。</li>
		<li>使用多通道移液器，立即向平底96孔细胞培养板的每个孔中加入100 μl琼脂糖溶液。 
		注意：琼脂糖在枪头中可能会在短时间内凝固，因此若制备多个琼脂糖平板，需在不同平板之间更换枪头以避免此问题。</li>
		<li>将96孔板置于平坦表面，使琼脂糖凝固至少1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞制备及在琼脂糖上的覆盖
	<ol>
		<li>在T75培养瓶中将细胞培养至约80%汇合度。用10 ml HBSS洗涤。</li>
		<li>使用1.5 ml 0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化细胞，重悬于10 ml正常培养基中。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞 18 或其他自动计数方法。</li>
		<li>用正常培养基重悬细胞，调整细胞浓度至25,000个细胞/毫升。</li>
		<li>在琼脂糖孔中加入200 μl细胞悬液，使每孔最终细胞数为5,000个。</li>
		<li>将培养板放回细胞培养箱（5% CO₂）2 并在37 ˚C下培养约3天以形成球状体。 
		注意：不同细胞系形成球状体所需的时间各不相同。某些细胞系使用此方法根本无法形成球状体。</li>
		<li>使用4倍倒置显微镜观察类球体形态&#160;目标是形成致密且大致呈球形的细胞聚集体，并确保每个孔中仅形成一个类球体，这可通过物镜和相差滤光片进行观察。 
		注意：可选步骤：一旦球状体形成，可将其移植到胶原蛋白或其他基质中，以进一步分析其生长和侵袭情况 3,7,17用500 μl浓度为2 mg/ml的胶原酶在37 °C处理，以从胶原中分离类球体，直至胶原充分溶解，使类球体释放到培养基中（约30分钟）。使用1 ml移液器轻柔地转移类球体。</li>
		<li>对类球体进行切片/成像前，用10%中性缓冲福尔马林（注意：福尔马林应在通风橱中使用）在室温（RT）固定至少2小时，或在4 °C过夜（O/N）。类球体可在4 °C的HBSS中保存数天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类球体振动切片
<ol>
	<li>在500 ml玻璃瓶中，将5 g低熔点琼脂糖溶于100 ml HBSS中，使用微波炉加热，采用中等功率并不断旋转。注意：加热溶液时瓶盖应保持松动，以便释放压力。操作热玻璃瓶时需佩戴防热手套，防止烫伤。</li>
	<li>等待琼脂糖稍微冷却，至用手触摸瓶身不致烫手为止。</li>
	<li>向库尔特计数杯或类似的塑料模具底部倒入约2 ml琼脂糖。立即使用1 ml移液器以尽可能小的液体体积吸取一个固定的类球体（见第2.2.8节），并将类球体加入琼脂糖中。每个杯子可加入数个类球体（最多10个）。</li>
	<li>再覆盖2 ml琼脂糖于类球体上方。操作应迅速，避免在第二层加入前琼脂糖已凝固。</li>
	<li>在室温避光条件下静置至少3小时，使琼脂糖完全凝固。此时，可在琼脂糖上方覆盖2–3 ml HBSS，并将杯子短期储存于4 °C以防止脱水。</li>
	<li>将琼脂糖从杯子中取出。修整含有类球体的琼脂糖块，使其能够贴合振动切片机的金属块，并确保类球体靠近琼脂糖顶部。类球体在琼脂糖内呈微小白点状，肉眼可见。使用瞬间胶将琼脂糖块固定于金属块上。&#160;</li>
	<li>向振动切片机中加入蒸馏水，并将金属块安装至仪器上。设置切片厚度为100 µm，低速（设定值2）和高振动频率（设定值8）。将切割刀片角度设为16°。启动振动切片机，打开照明灯，从琼脂糖顶部开始切片，直至获得厚度为100 µm的类球体切片。将切下的类球体切片置于24孔板中的HBSS内。</li>
	<li>选择中间层面的切片用于图像分析。用镊子将切片平整转移至载玻片上。取10 ml注射器筒，装入真空脂，在切片边缘涂抹一圈薄层真空脂，以防止封片剂从载玻片边缘流失，并有助于盖玻片下切片的密封。在切片上滴加封片剂，盖上盖玻片，并用指甲油密封盖玻片边缘。成像前将载玻片储存于4 °C。</li>
</ol>
4. 共聚焦图像采集
<ol>
	<li>使用10X&#160;或20X&#160;物镜，对FUCCI类球体的中间Z平面切片进行成像，具体方法如前所述7。确保Kusabira Orange2与Azami Green之间无重叠或串色现象。若需对多个类球体切片进行图像分析比较，应保持各样本间的激光功率及其他成像参数一致。</li>
</ol>
5. 用于流式分选的Hoechst染料扩散实验
<ol>
	<li>将活的类球体（在琼脂糖接种后3-5天）转移至15 ml离心管中，让类球体依靠重力沉降到管底。每管可对多个类球体进行染色。进行流式细胞术分析需要约20个类球体以获得足够的细胞数量。</li>
	<li>加入1 ml用正常培养基稀释的10 μM Hoechst染料，37 °C孵育约1小时。孵育期间轻柔弹动管子1-2次，使类球体重新悬浮。 
	注意：孵育时间可根据需要调整，以改变Hoechst染料在类球体中的渗透深度。渗透程度取决于类球体的大小、密度及细胞系。对于某些较大或较致密的类球体，染料的最大渗透深度可能低于100%。</li>
	<li>用5 ml HBSS通过重力沉降法轻轻洗涤类球体。
	<ol>
		<li>可选步骤：如需成像观察染料渗透情况，可用10%中性缓冲福尔马林在室温固定至少2小时，或在4 °C过夜。制备振动切片，载片后按照上述第3和第4步所述方法在共聚焦显微镜下成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为进行流式细胞术分析，使用1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA在37 °C对类球体进行消化约30分钟，每隔10分钟轻弹管壁数次，以使类球体解离成单细胞悬液。 
	注意：类球体较难完全解离为单细胞悬液，可能需要优化消化条件。C8161细胞形成的4天类球体在此处理后的存活率约为95%。</li>
	<li>根据试剂生产商的说明书，使用近红外活/死细胞染料对细胞进行染色。用HBSS洗涤后，加入1 ml 10%中性缓冲福尔马林固定约30分钟。细胞可在4 °C的HBSS中保存数天后再进行流式分析。</li>
</ol>
6. 经Hoechst染色的FUCCI类球体的流式细胞术分析
<ol>
	<li>通过细胞筛网过滤，确保细胞无团块。将经Hoechst染色的FUCCI类球体重悬于冰上预冷的FACS洗涤液（含5%胎牛血清的PBS）中，浓度为1-5 × 106 个细胞/ml。取200 µl样品转移至5 ml圆底管中。</li>
	<li>按照6.1节所述方法制备以下单色对照样品：未染色的黑色素瘤细胞；用10 µM Hoechst染色1小时的贴壁黑色素瘤细胞；仅表达Azami Green的黑色素瘤细胞；以及仅表达Kusabira Orange的黑色素瘤细胞。 
	注意：单色对照样品可用甲醛固定，并保存于含0.1%叠氮化钠的FACS洗涤液中，在4 °C条件下可保存数周甚至数月。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析单细胞悬液，配备适当的激光器，并以前述方法设置单色对照和未染色对照7,16。</li>
	<li>使用FlowJo等商业流式分析软件，按以下步骤分析类球体的内层与外层细胞：
	<ol>
		<li>通过前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）图中主细胞群设门，去除碎片。</li>
		<li>利用FSC（面积）与FSC（高度）图设门，排除双联体，保留单细胞。</li>
		<li>根据活/死细胞低信号群设门，筛选活细胞。</li>
		<li>以经Hoechst染色的贴壁细胞产生的阳性信号为参考，将Hoechst高信号细胞定义为“外层”细胞。</li>
		<li>以未染色对照的信号为参考，将Hoechst低信号或阴性信号细胞定义为“内层”细胞。</li>
		<li>在确定内层和外层细胞群后，可进一步根据FUCCI信号设门，分为红色（G1期）、黄色（早期S期）、绿色（S/G2/M期）或阴性（早期G1期）细胞。 
		注意：为准确区分FUCCI红色、黄色、绿色及阴性细胞群，可能需要使用单色对照进行补偿调节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在优化实验条件并通过共聚焦显微镜验证Hoechst渗透效果后，可按照前述方法7,16，对未固定的细胞进行流式分选，以进一步分析活细胞亚群。</li>
</ol>
7. FUCCI 类球体切片的图像分析
<ol>
	<li>开放软件 例如Volocity，选择仅定量配置。</li>
	<li>创建一个新库。通过将共聚焦显微镜中的原始数据文件拖拽至库中，导入FUCCI类球体共聚焦图像文件。或者，使用文件 &#62;导入&#160;命令</li>
	<li>转到“测量”选项卡以构建图像分析协议。在协议窗口中，通过按正确顺序拖放相应的命令来建立协议。</li>
	<li>在绿色通道中查找对象：将“查找对象”命令（位于“查找”模块中）拖入实验流程窗口，在查找对象协议中选择正确的通道。添加一个“打开”命令（位于“处理”模块中），然后添加一个独立的“分离接触对象”命令（位于“处理”模块中，用于分离细胞）。按大小排除对象 &#60;50 μm（在“Filtering”中设置——此参数将排除微小的非细胞物体）。 
	注意：需手动优化诸如寻找物体的阈值、开运算迭代次数、需分离物体的大小以及需排除物体的大小等参数，直至物体的掩膜与图像匹配。</li>
	<li>在红色通道中寻找目标：如上所述，对红色通道重复进行目标寻找。绿色和红色通道的方案可能需要分别调整。 
	注意：由于细胞核处于 G2 期，绿色荧光的细胞核通常略大一些。</li>
	<li>确认所找到的对象是否准确：通过开启和关闭绿色通道与红色通道（使用隐藏或显示通道命令），在显示本方案所识别出的红色和绿色掩膜的同时，核对红色和绿色对象是否与图像中的红色和绿色细胞核相匹配。反馈选项（测量） &#62;反馈选项可用于修改对象掩膜的外观。</li>
	<li>寻找黄色物体（早期S期细胞）：要找到黄色细胞，请添加一个红色与绿色细胞相交的命令（位于“组合”中）。按大小排除物体（&#60;50 μm，见“Filtering”）以排除任何微小的非细胞物体。</li>
	<li>寻找仅呈红色的物体（G1期细胞）：为识别仅呈红色的细胞核，需从红色细胞中减去黄色细胞（见“合并”步骤）。根据物体大小排除部分对象 &#60;50 μm（位于“Filtering”中），以去除产生的任何微小非细胞物体。</li>
	<li>寻找仅呈绿色的物体（S/G2/M期细胞）：对绿色通道重复上述操作，以识别仅呈绿色的物体。 
	注意：如果仍有非细胞对象残留，可在“仅绿色”或“仅红色”方案（位于“过滤”部分）中添加过滤种群命令，仅保留形状因子大于0.25的对象，从而去除非圆形物体。</li>
	<li>找到类球体轮廓：使用“查找对象”命令（位于“Finding”模块中），选择绿色或红色通道（选择类球体边缘细胞信号更强的通道）来识别类球体轮廓。与单个细胞的检测相比，查找类球体轮廓需要使用更低的阈值（在“查找对象”参数中设置）。
	<ol>
		<li>使用闭合命令合并对象（位于“Processing”中），然后填充对象中的孔洞（位于“Processing”中），接着使用精细滤波器（位于“Filtering”中）去除对象中的噪声。最后，按大小排除对象以去除较小的对象 &#60;30,000 μm（取决于类球体的大小）。 
		注意：该方案需要手动优化，直至类球体轮廓准确。也可使用明场图像——但通常对类球体切片的准确性较低，且需使用“组合”功能中的反相命令。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量细胞核到类球体轮廓的距离：在“关联”（Relating）功能中，测量黄色、仅绿色和仅红色细胞群体的细胞中心到类球体轮廓边缘的距离。为可视化最小距离（即细胞到最近类球体边缘的距离），可在反馈选项（Measurements）的“关系”（relationships）标签中启用“显示距离”（show distances）功能。 &#62;反馈选项 &#62;关系）。</li>
	<li>保存该方案。此方案可使用“测量”功能重新应用于其他图像。 &#62;恢复方案命令</li>
	<li>创建一个测量项目（测量） &#62;进行测量项目）。数据可使用分析功能进行分析。
	<ol>
		<li>转到测量项目中的分析选项卡。进入分析菜单（Analysis &#62;分析细胞重心（红色、绿色或黄色）到类球体边缘的最小距离，按数量汇总并按细胞群组分类。</li>
		<li>要统计距离边缘特定距离处的细胞数量，需创建一个滤镜（Analysis &#62;滤膜）。最小距离的滤膜 图2 基于Hoechst渗透（例如 最小距离小于80的为“外层”群体。或者，将原始数据导出至电子表格以进行进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
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</ol>

PerkinElmer 承担了部分出版费用。

半自动图像分析可识别类球体内部的G1期阻滞区域以及外层的增殖区域。该方法可用于活体类球体的光学切片，或固定后的类球体切片，以检测这些不同区域中细胞周期的变化，以及标志物表达（通过免疫荧光）、细胞死亡或细胞形态的变化。若结合活细胞共聚焦延时成像及细胞追踪图像分析步骤，还可对不同类球体区域内的细胞运动性进行定量分析。图像分析的关键在于获取高质量的z轴切片共聚焦图像，更高分辨率的图像有助于更准确地识别细胞。图像分析的一个局限性在于，当细胞核过于密集，或红色与绿色荧光强度差异过大时，无法准确识别所有细胞。该图像分析方法无法识别FUCCI阴性细胞（处于早期G1期），仅能识别红色（G1期）、黄色（早期S期）和绿色（S/G2/M期）信号。本文所述基于图像的分析方法另一缺点是未考虑类球体完整的三维结构。尽管Volocity软件可利用z轴堆栈图像进行三维测量，但由于类球体体积较大，共聚焦显微镜难以穿透并成像整个结构。多光子成像可用于获取完整类球体的z轴堆栈图像以实现三维测量7，该技术可穿透至500 μm深度，但某些类球体仍可能过大而无法通过此方法完成全貌成像。另一种对整个类球体进行成像的可选方案是光片显微镜技术，该技术可从多个角度可...

多细胞三维球体作为肿瘤模型已为人所知数十年，但直到最近才开始被更广泛地用作一种 体外 许多实体癌的模型。它们正越来越多地被用于高通量药物筛选，作为复杂、昂贵且耗时的 体内 模型以及简单、低成本的二维单层模型 1-6二维培养研究通常难以重复 体内多种癌症的球状体模型能够模拟实际肿瘤的生长特性、药物敏感性、药物渗透性、细胞间相互作用、氧气和营养物质的受限供应以及坏死的形成 体内 在实体瘤中 6-11类球体形成坏死核心，核心周围为静止期或G1期阻滞区域，类球体边缘则为增殖细胞 7这些区域的发育可能因细胞密度、增殖速率以及球体大小的不同而有所差异 12已有假说认为，这些不同亚区域中观察到的细胞异质性可能与癌症治疗耐药性有关 13,14因此，能够分别分析这些区域中的细胞对于理解肿瘤对药物的反应至关重要。
荧光泛素化细胞周期指示系统（FUCCI）基于对Cdt1和geminin分别进行红色（Kusabira Orange – KO）和绿色（Azami Green – AG）荧光标记，这两种蛋白在细胞周期的不同阶段被降解15。因此，细胞核在G1期呈红色，在早期S期呈黄色，在S/G2/M期呈绿色。本文描述了两种互补的方法，均利用FUCCI系统来识别细胞周期，并结合成像软件或染料扩散流式细胞术检测，以确定细胞位于G1期阻滞的中心区域还是外周增殖环中，以及单个细胞距类球体边缘的距离。这些方法源自我们此前的发表研究，在该研究中我们证明，位于类球体中心缺氧区域的黑色素瘤细胞和/或在靶向治疗存在的情况下，能够长期维持在G1期阻滞状态，并在条件更有利时重新进入细胞周期7。

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>用于切片</td></tr><tr><td>高贵琼脂&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>用于制备球状体</td></tr><tr><td>用于球状体的琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>用于制备球状体</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>警告：有害，具有腐蚀性。请使用个人防护装备，操作时务必谨慎 &amp;nbsp;不要吸入蒸气（应在通风橱中打开）。</td></tr><tr><td>活/死 近红外</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养杯</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SIE936</td><td>用于切片球状体的模具</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养板</td><td>体外</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C5138&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪分析仪</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>速度</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>流式细胞术软件</td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI（商业构建体）</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>瞬时转染</td></tr><tr><td>70 微米细胞滤网 &amp;#956;m</td><td>体外</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>圆底5 ml无菌管</td><td>体外</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>圆底5 ml非无菌管</td><td>体外</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

基于成像和流式细胞术的三维黑色素瘤球体中细胞位置与细胞周期的分析

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

三维（3D）肿瘤球体在癌症研究中被用作更准确的模型 体内 肿瘤微环境，相较于传统的二维（2D）细胞培养模型，具有更高的生理相关性。球形体模型能够模拟细胞间相互作用、缺氧与营养剥夺以及药物渗透等效应。该模型的一个特征是形成坏死核心，其周围环绕着处于G1期阻滞的细胞环，而外层则为增殖活跃的细胞。在癌症研究领域，人们尤为关注球形体不同区域对药物治疗以及遗传或环境干预的响应差异。本文介绍了荧光泛素化细胞周期指示系统（FUCCI）结合流式细胞术及商业软件进行图像分析的方法，用于表征黑色素瘤球形体内部细胞所处位置与其细胞周期状态之间的关系。这些方法可用于在不同时间和实验条件下，追踪肿瘤球形体不同亚区域中细胞周期状态、基因/蛋白表达或细胞活力的动态变化。

生成肿瘤球体有多种方法，本方案采用非黏附生长法，即将细胞培养在琼脂或琼脂糖上3,7,9。图1展示了C8161黑色素瘤细胞在琼脂上培养3天后的球体示例。C8161细胞在培养3天后可形成大小均一的球体，直径为500–600 μm（均值=565，标准差=19，n=3）。其他可形成球体的黑色素瘤细胞系包括：WM793、WM983C、WM983B、WM164、1205lu（该细胞系形成的球体形态不规则且密度较低19）。
为了在三维球状模型中观察单个细胞的细胞周期，将C8161黑色素瘤细胞转导了FUCCI系统7,15。由于球状体体积较大（C8161细胞在琼脂糖上培养3天、再在胶原中生长24小时后直径可达1 mm），切片是观察球状体中心区域细胞的最佳选择。虽然完整球状体（活体或固定样本）可通过共聚焦显微镜成像，但共聚焦成像的穿透深度仅约150 μm，因此只有直径小于300 μm的球状体才能获得其中心光学切面。图2A、B和C展示了一...

我们介绍了两种互补的方法，利用荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）结合图像分析或流式细胞术，以鉴定并分离三维球状体中处于内层G1期阻滞和外层增殖区域的细胞。

三维（3D）肿瘤球体在癌症研究中被用作比传统模型更准确地模拟体内肿瘤微环境的模型，相较于……

本方法的总体目标是针对多细胞类固醇中细胞的细胞周期状态及其在类固醇内的位置，实现细胞的识别、表征与分离。与二维细胞培养相比，三维OID模型能够更好地模拟体内肿瘤的生物学特性，包括肿瘤结构及其微环境。通过将类球体与流式细胞术和成像技术相结合，该方法可解答癌症研究领域中的关键问题，例如肿瘤微环境如何影响药物敏感性、细胞运动性及增殖能力。该方法的主要优势在于能够实时观察细胞周期，并允许从特定的类固醇区域纯化活细胞，从而证明该实验流程的可行性。本实验将由本实验室研究助理A sharp进行演示。首先准备3D类固醇的形成：将1.5%的aros溶于100毫升Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，间歇性地摇动烧瓶，微波加热三至五分钟，以确保aros完全溶解。随后立即用移液器将100微升aros溶液加入平底96孔组织培养板的每一孔中。将培养板在室温下孵育一小时，使aros凝固。接下来，从细胞培养箱中取出表达FCI构建体的黑色素瘤细胞，其融合度约为80%。用10毫升HBSS洗涤细胞。加入1.5毫升含0.05% EDTA的溶液，然后在37°C下孵育约两分钟。待细胞脱落后，将其重悬于10毫升细胞培养基中。使用血细胞计数板和倒置显微镜手动计数细胞，并用细胞培养基将细胞稀释至每毫升25,000个细胞。然后吸取200微升细胞悬液，加入96孔Transwell板的每个上室中进行覆盖接种。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育约三天，以形成细胞球体。孵育结束后，在倒置显微镜下使用物镜和相差滤光片对球体进行成像。细胞球体应呈现为致密的、大致呈球形的细胞聚集体，以备后续对细胞球体进行切片和成像处理。使用1毫升移液器将它们转移至一个Falcon管中。然后让类固醇沉淀至锥形管底部。接着通过抽吸去除培养基，并在室温下用10%中性缓冲福尔马林固定类球体，孵育至少两小时。切片并成像细胞后，SP 可在 HBSS 中于 4 摄氏度保存数天。打开图像分析软件，选择仅定量配置。然后创建新库，并通过将原始数据文件拖入库中来导入类球体共聚焦图像文件。接下来，转到“测量”选项卡，在协议窗口中通过拖放命令按正确顺序构建图像分析流程。为了在绿色通道中识别目标，从“识别”部分拖放“识别目标”命令至协议窗口，并选择相应的通道。然后添加位于“处理”类别下的“开操作”命令，再添加一个独立的“分离接触目标”命令以分离细胞。最后，在过滤部分，根据大小添加并排除对象。设置命令以排除小于 50 微米的对象，从而去除较小的非细胞对象。接下来，将一个新的“寻找对象”命令拖放到方案窗口中。按照相同的步骤，选择红色通道并应用所有后续命令。找到目标物体后，使用隐藏通道或显示通道命令，直观地确认红色和绿色物体分别对应红色和绿色的细胞核。如有必要，点击“测量”然后选择“反馈选项”，以调整物体掩膜的显示效果。现在，为了找到对应于早期S期细胞的黄色物体，请使用组合部分中的“相交”命令，并选择将红色物体与绿色物体相交。同样，排除大小小于50微米的物体。为了识别G1期细胞，请使用组合部分中的“减去”命令，并选择从红色物体中减去黄色物体，以获得仅有的红色物体。类似地，通过从绿色物体中减去黄色物体，识别出仅与SG二期和MPH相细胞对应的绿色物体，包括仅红色和仅绿色物体。根据需要，在过滤部分应用形状因子大于0.25的过滤种群命令，去除非细胞物体。然后确定S类球状体的轮廓。在绿色或红色通道中，使用“查找对象”命令来识别目标。接着使用“处理”部分中的“闭合”命令，将单个细胞连接成一个整体对象。然后添加“填充对象中的孔洞”命令，以填补球体中的空隙。接下来，使用精细滤波器去除 Sphero 对象中的噪声。通过选择按大小排除对象，去除小于 30,000 微米的物体，以完成类球体轮廓的识别。在所有对象定义完成后，从相关部分添加测量距离功能，以确定每个 OID 到 S 类球体轮廓边缘的距离。请在每一群黄色、单独的红色和单独的绿色群体中执行此操作。为了可视化细胞到最近的 S 类球体边缘的最小距离，请打开“测量”标签页，选择“反馈选项”，然后选择“关系”，再选择“显示距离”。最后，保存该实验方案以保存由该方案生成的数据。在测量部分选择“进行测量”项目。随后，为了解读数据，选中测量项目，进入测量部分的分析选项卡，在分析菜单下选择“分析”以统计位于类固醇边缘特定距离处的细胞数量。在分析选项卡中选择“筛选”以创建筛选条件。例如，仅显示距离球体边缘小于100微米的数据。要导出原始数据，请在文件选项卡中选择“导出”，然后将数据保存为逗号分隔或制表符分隔的文本文件。该数据可在电子表格程序中打开以进行进一步分析。细胞球体由 C81161 细胞生成。已用 Fuji 系统转导的人黑色素瘤细胞经过固定并切片。对AZA绿色荧光（标记细胞周期SG2M期的细胞）和Berra橙色荧光（标记G1期细胞）进行共聚焦成像。当这些图像叠加时，可观察到预期的关键特征，例如坏死核心。靠近坏死核心的区域以红色G1期阻滞细胞为主，而红色与绿色的增殖细胞则随着向类器官外缘延伸呈梯度增加，该区域对氧气和营养物质的可及性最高。经过半自动图像分析后，可定义 fucci 细胞掩模和 S 类球体的轮廓。使用成像软件对 S 类球体内部或外部区域的红色和绿色细胞进行定量。该分析显示，G1 期阻滞的细胞在内部区域富集，而增殖细胞则主要分布在类固醇边缘附近。一旦掌握，该技术可在一到两周内完成，该时间范围包括类固醇的培养、成像和分析。按照这些步骤，可将细胞球体植入胶原基质中，然后通过延时显微镜进行成像。随后可对其进行蛋白质或RNA分析，这有助于我们回答诸如类固醇内的位置以及氧气和营养物质的可及性是否会影响癌细胞表型等问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

单元位置的Imaging-和流式细胞仪为基础的分析和3D球体黑色素瘤细胞周期

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

在此，我们介绍一种用于构建三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型的方案，该模型可重现器官/肿瘤的结构特征和多细胞复杂性 体内...

一种三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。...

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

本文介绍了几种用于评估三维肿瘤细胞球体存活与死亡的简单方法。相比二维培养，三维细胞球体能更真实地模拟体内肿瘤的理化梯度环境。因此，该球体模型可更准确地评估抗癌药物的疗效，并提高向体内条件的转化预测能力。...

评估癌细胞三维球状培养物中的细胞活力与死亡

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。...

一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

建立了一种基于肿瘤细胞与基质成纤维细胞异质相互作用的新型三维球体模型。本文介绍了肿瘤细胞与基质成纤维细胞的共培养、延时成像及共聚焦显微镜技术，用于可视化球体的形成过程。该三维模型为研究肿瘤-基质相互作用及筛选抗癌治疗药物提供了一个恰当的研究平台。...

一种新型的由基质成纤维细胞调控的三维肿瘤球模型，用于研究肿瘤-基质相互作用及药物发现

本文介绍了一种易于使用的胶质母细胞瘤侵袭实验方法。该实验适用于胶质母细胞瘤干细胞样细胞。同时介绍了一种用于便捷定量分析侵袭、迁移和增殖的Fiji宏工具。...

一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

本文介绍了一种球形体成像装置的制备方案。该装置可实现对癌细胞球形体的动态或长期荧光成像。本方案还提供了一种简单的图像处理流程，用于分析癌细胞的侵袭行为。...

三维球体模型中癌细胞侵袭的实时荧光成像与分析

肿瘤类球体正越来越多地被用于评估肿瘤细胞与微环境之间的相互作用以及治疗反应。本方案描述了一种利用快速光学透明化技术对三维肿瘤类球体进行半高通量成像的稳健且简便的方法。...

用于肿瘤类球体半高通量分析的快速光学透明化

本文介绍了一种研究原代人单核细胞来源的巨噬细胞与三维（3D）I型胶原基质中肿瘤球体相互作用的实验方案，可用于比较微环境的可溶性因素和物理特性对细胞侵袭的影响。...

巨噬细胞-肿瘤类球体共侵袭实验

学习利用FUCCI荧光标记结合成像分析和流式细胞术，在三维黑色素瘤球体中识别并分离不同细胞周期阶段的细胞。该方法可实时追踪细胞周期动态，为肿瘤微环境研究提供可靠工具。

基于成像和流式细胞术的三维黑色素瘤球体中细胞位置与细胞周期的分析

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