Name: 定性和定量测定为检测和蛋白质抗菌药物的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学习使用微载玻片扩散法和染料释放法定性和定量测定酶类抗菌活性，快速筛选针对特定病原菌的裂解酶。该方法操作简便，适用于常规微生物实验室设备。

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本工作由 MITRE 公司通过 MITRE 创新计划（项目编号：25MSR621-CA）资助。作者谨此感谢 Mark Maybury 博士、Richard Games 博士、James Patton、Ellen Mac Garrigle 博士、Carl Picconatto 博士以及 Caroline Gary 对本工作的支持与审阅。

1. 细菌和肽聚糖底物的制备
注意：在微载玻片扩散实验和染料释放实验中，均使用全细胞细菌底物和纯化的肽聚糖作为酶反应底物。这些底物在进行酶反应前需要预先制备。以下方案描述了其制备过程。
<ol>
	<li>全细菌细胞底物
	<ol>
		<li>通过将500 ml营养肉汤接种2 ml的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168，美国典型培养物保藏中心；ATCC 23857）过夜培养物来制备细菌细胞底物。在30 °C下振荡培养（125 rpm），直至培养物进入对数生长期，即细菌培养物快速生长并实现数量翻倍的阶段。对于鼠伤寒沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp. enterica，ATCC 10708）的培养，使用营养肉汤作为培养基，在37 °C下振荡（125 rpm）培养。</li>
		<li>通过在121 °C、3 atm压力条件下高压灭菌10分钟，使各培养物热灭活。</li>
		<li>以5,000 × g离心20分钟收集热灭活的细菌底物。用I型水洗涤沉淀物三次，并重新悬浮于少量水中。本研究中，将底物悬浮于1,200 µl水中。</li>
		<li>将300 µl细菌细胞底物分装至1.5 ml微量离心管中，于20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化的肽聚糖底物
	<ol>
		<li>从目标底物细菌中纯化肽聚糖7-10，或从供应商处获取（见材料和设备表）。进一步纯化粗制肽聚糖制备物，去除附属细胞壁多聚物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 定性微载玻片扩散试验 [修改自 Lachica, 等. 11 ]
注意：微载玻片扩散试验是一种用于检测样品中是否存在抗菌酶的定性方法。当酶在含有底物的琼脂糖基质中扩散时，随着酶对底物的水解，会形成透明圈。以下方案描述了微载玻片扩散试验的制备与操作步骤，用于定性检测蛋白质类抗菌物质的存在。
<ol>
	<li>根据制造商提供的说明书，使用双辛可宁酸（Bicinchoninic Acid, BCA）蛋白质检测试剂盒测定待评估抗菌酶的浓度。</li>
	<li>使用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）作为酶反应缓冲液；但应根据实验经验确定适用于特定酶的合适缓冲液。</li>
	<li>使用磷酸盐缓冲液（PBS）作为反应缓冲液，对抗菌酶进行系列稀释。本微载玻片扩散实验中所用的系列稀释浓度，使每个反应体积中的最终蛋白质量分别为 0 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng、1 µg 和 10 µg。</li>
	<li>将上述蛋白质量分别加入各个微量离心管中，并用 PBS 调整各管中液体体积至 20 µl，以备加入微载玻片反应孔中使用。</li>
	<li>通过将 0.25 g 琼脂糖溶解于 50 ml PBS 中制备 0.5% 琼脂糖溶液。加热至沸腾，直至琼脂糖完全溶解。通过称重确定熔化过程中损失的水量，并将损失的水补充回溶液中。</li>
	<li>向琼脂糖溶液中加入 50 µl 10% 叠氮化钠水溶液，并将溶液置于水浴中调节温度至 50 °C。加入叠氮化钠是为了抑制微载玻片扩散实验孵育过程中可能发生的污染性细菌生长。若使用活细胞作为底物，则应在琼脂糖溶液中省略叠氮化钠。</li>
	<li>将热灭活的细菌底物置于冰上解冻。</li>
	<li>将细菌底物重新悬浮于 12 ml 琼脂糖溶液中，使其浊度大致相当于 2.0 McFarland 标准浊度（参见 材料表）。通过观察溶液后方白色背景上的黑色线条来比较溶液浊度，并继续向琼脂糖中添加细菌底物，直至达到目标浊度。</li>
	<li>立即用移液器将 3 ml 琼脂糖-底物混合液加入每张微载玻片（25 x 75 x 1 mm3）中。</li>
	<li>待载玻片上的凝胶固化后，使用打孔器（直径 4.8 mm）在每张微载玻片的琼脂糖-底物层中打三个孔。将各梯度稀释的蛋白溶液（20 µl）分别加入对应孔中。</li>
	<li>设置阴性对照孔，加入 PBS（20 µl）或牛血清白蛋白（5 µg 溶于 20 µl PBS）。设置阳性对照孔，加入针对该底物已知具有溶菌活性的酶，如溶菌酶（lysozyme）。</li>
	<li>将载玻片置于湿盒中，在 37 °C 或该酶最适活性温度下孵育。孵育时间取决于抗菌酶的浓度及其比活性。通常反应时间为过夜（约 16 小时）。</li>
	<li>孵育结束后，在间接光源下观察载玻片，并使用配备 60 mm 镜头的数码单反相机在约 30 cm 焦距处拍摄实验结果图像。 
	注意：抗菌蛋白酶对特定底物的酶活性表现为清晰的水解透明圈，该透明圈随酶在琼脂糖中的扩散而在孔周围形成。</li>
	<li>为定性评估酶活性，观察各孔周围形成的透明圈大小。酶活性越高，透明圈越大；酶活性越低，透明圈越小。</li>
</ol>
3. 底物标记——Remazol Brilliant Blue R 染料标记法［引自 Zhou 12，经修改］
注意：在染料释放实验中，底物共价连接于丽春红亮蓝R染料。以下方案描述了染料标记的酶底物的制备过程。
<ol>
	<li>通过将1 g NaOH溶解于99 ml I型水中，配制250 mM氢氧化钠（NaOH）溶液，用于后续配制200 mM Remazol Brilliant Blue R染料（RBB）溶液。</li>
	<li>在新鲜配制的250 mM NaOH溶液（步骤3.1）98.75 ml ± 1 ml中溶解1.25 g RBB，配制200 mM RBB溶液。</li>
	<li>将热灭活的细菌细胞以0.5 g湿重/30 ml的浓度重新悬浮于RBB溶液中；对于纯化的肽聚糖，则以0.3 g湿重/30 ml的浓度重新悬浮于RBB溶液中。</li>
	<li>将反应混合物置于锥形瓶中，在37 °C下于旋转平台上温和振荡孵育6小时。</li>
	<li>将反应混合物转移至4 °C培养箱中，继续在温和振荡条件下孵育12小时。</li>
	<li>孵育结束后，于3,000 x g离心30分钟，收集染色底物，并倾去上清染料溶液。</li>
	<li>通过反复用水（约3–5次）洗涤染色标记的细胞或肽聚糖，并每次洗涤后离心，以去除非共价结合的可溶性染料。每次加水后需充分重悬沉淀。 
	注意：当离心后的水洗液中不再可见游离的可溶性染料时，应再进行一次额外洗涤。注意底物本身仍呈蓝色，而最后一次洗涤的上清液应为无色透明。</li>
	<li>将染色后的底物以少量水悬浮，于-20 °C保存，以备后续使用。</li>
</ol>
4. 定量染料释放实验
注意：在染料释放实验中，酶促反应中RBB染色底物的水解会将染色产物释放到反应上清液中。通过比色法测定释放染料的量，可反映样品中特定酶的酶活性水平。该定量方法允许在不同底物间比较不同酶的活性，并可用于评估影响酶促反应的环境条件变化例如，温度、盐度和pH）。以下方案描述了染料释放实验的制备与操作步骤，用于定量检测蛋白质类抗菌物质的酶活性。
<ol>
	<li>染料释放实验的准备工作
	<ol>
		<li>将冷冻的染色底物恢复至室温，并用测定缓冲液（PBS）洗涤两次，该缓冲液根据特定酶的经验确定。</li>
		<li>通过将200 µl反应体积乘以拟进行的染料释放实验数量，计算所需底物悬浮液的体积。</li>
		<li>将染色底物加入步骤4.1.2中确定体积的测定缓冲液中，配制底物悬浮液，使用分光光度计在595 nm处调节至光密度（OD）为2.0。为保持分光光度计的功能范围，可将浓缩溶液1:1稀释后测得OD595为1.0，即代表原液OD为2.0。使用测定缓冲液作为空白对照。 
		注意：可根据高效酶的活性水平，将反应中底物的浊度调至高于2.0。</li>
		<li>将待评估的蛋白质抗菌剂用测定缓冲液悬浮，预估浓度为1 mg/ml。</li>
		<li>按照BCA蛋白测定试剂盒的制造商说明书，使用微孔板法测定待测蛋白样品的实际浓度。使用测定缓冲液将储备悬浮液的浓度调整至1 mg/ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用染料释放实验确定蛋白质抗菌剂的最佳孵育条件
	<ol>
		<li>将储备的蛋白质抗菌剂悬浮液稀释至100 ng/µl。此浓度可使加入反应体系的每10 µl体积中含有1 µg蛋白，达到最终反应质量。</li>
		<li>确定拟评估的溶菌蛋白的温度范围。本实验中所用的温度范围包括5 °C、15 °C、25 °C、35 °C、45 °C、55 °C和65 °C。</li>
		<li>在0.5 ml微量离心管中进行反应实验。针对每种温度条件，向200 µl已配制的底物悬浮液中加入10 µl储备蛋白溶液。</li>
		<li>在热循环仪中孵育8小时，每小时翻转混匀一次。</li>
		<li>孵育结束后，加入25 µl乙醇终止反应。</li>
		<li>在3,000 x g离心2分钟，去除未消化的不溶性底物，小心转移每种反应混合物的150 µl上清液至96孔平底微孔板中，避免扰动未消化底物形成的沉淀。</li>
		<li>通过测定酶解后从底物解离的可溶性RBB染料量，评估该底物条件下蛋白质抗菌剂的酶活性。为量化酶活性，使用微孔板分光光度计在595 nm处测定上清液的吸光度。上清液中由标记底物释放的可溶性染料导致的吸光度升高，是酶活性的定量指标。 
		注意：吸光度的变化以活性单位（AU）表示，其中1 AU对应染料释放反应上清液在595 nm处光密度增加0.01。以不含酶但包含所有其他反应组分的空白反应作对照，扣除因孵育过程导致RBB标记底物非酶解性染料释放的影响。最佳酶反应温度对应最高的活性单位值。</li>
		<li>重复步骤4.2.1至4.2.7，使用不同孵育缓冲液，以确定抗菌酶的最佳缓冲条件。本实验中使用PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用染料释放实验确定蛋白质抗菌剂在最佳孵育温度下的最低有效浓度
	<ol>
		<li>使用测定缓冲液对储备的抗菌蛋白悬浮液进行系列稀释。稀释范围应根据抗菌酶的活性而调整。本实验中采用的系列稀释最终在反应体系中得到的蛋白量分别为0 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng、1 µg和10 µg。</li>
		<li>在48孔平底微孔板中进行各反应实验。针对每种实验条件，向200 µl已配制的底物悬浮液中加入10 µl相应的蛋白悬浮液。若加入的蛋白溶液体积有差异，需用反应缓冲液补足至10 µl，以保持总体积一致。</li>
		<li>使用微孔板密封膜密封微孔板，防止蒸发导致体积变化。在已确定的最佳孵育温度下，于摇床培养箱中以振荡方式孵育16小时。</li>
		<li>孵育结束后，向每孔加入25 µl乙醇终止反应，并在3,000 x g离心2分钟以去除未消化的底物。</li>
		<li>小心将每种反应混合物的150 µl上清液转移至96孔平底微孔板中，避免扰动未消化底物形成的沉淀。</li>
		<li>为量化酶活性，使用微孔板分光光度计在595 nm处测定上清液的吸光度。以不含酶但包含所有其他反应组分的空白反应作对照，扣除因孵育过程导致RBB标记底物非酶解性染料释放的影响。由标记底物释放至上清液中的可溶性染料引起的吸光度升高，提供了酶活性的定量测量依据。 
		注意：吸光度的变化以活性单位（AU）表示，其中1 AU对应染料释放反应上清液在595 nm处光密度增加0.01。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。&#160;The MITRE Corporation&#160;是一家非营利性公司，运营多个联邦资助的研究与开发中心（FFRDCs）。

微载玻片扩散实验和染料释放实验在检测和表征先前未被识别的蛋白质类抗菌物质方面具有优势。这些快速且灵敏的方法可在投入更多研究资源之前，对生物来源文库进行高通量筛选，以鉴定目标酶。当鉴定出备受关注的目标酶后，可通过调整检测实验方案，快速检测该酶或确定其生化特性。例如，在多步蛋白质纯化过程中，微载玻片扩散实验可快速检测含有目标酶的组分。此外，通过改变染料释放实验中的反应缓冲液和孵育温度，可确定该酶反应的最适条件。
微载玻片扩散法检测所需的酶质量范围取决于酶的特性。该方法的检测限通常要求使用的酶量高于染料释放法。本研究中，微载玻片扩散法（图1）与染料释放法（图4）的检测限比较表明，微载玻片扩散法的灵敏度低于染料释放法。当酶浓度不是限制因素时，微载玻片法可用于对蛋白类抗菌物质库进行快速初筛，以鉴定其对特定底物的作用，且对人力和设备要求较低。尽管染料释放法需要更多的操作步骤和设备，但其灵敏度更高、结果更可重复，能够提供定量数据，从而允许对同一种或不同酶在相同底物上的染料释放实验结果进行比较。这两种方法均可在大多数微生物学实验室中轻松开展，无需高度专业化的仪器。在代表性实验中，使用染料释放法可检测到低至100 ng的对照酶α-胰凝乳蛋白酶（图5），而在微载玻片扩散法中可检测到的最低量为1 µg（数据未显示）。
作为一种用于检测抗菌酶的定性分析方法，已有多种扩散试验的变体被报道11,13。在对这些方法进行综述的基础上，微载玻片扩散试验因其相对较高的灵敏度适合作为初筛方法，且便于观察反应过程而被开发出来。该方法改进自Lachica et al.11的研究，后者利用琼脂糖覆盖层检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株核酸酶的产生。微载玻片扩散试验的原理与径向免疫扩散法14类似，即蛋白质从加样孔中扩散进入含有底物的琼脂糖凝胶。在径向免疫扩散法中，当扩散的抗原与琼脂糖中的抗体达到复合物形成的平衡状态时，免疫沉淀圈的扩展即停止。相比之下，微载玻片扩散试验中的底物会被扩散出的抗菌蛋白持续降解，在加样孔周围形成一个不断扩大的溶菌圈。溶菌圈直径的增大将持续进行，直至酶失去活性或底物被耗尽。随着酶的纯度（即比活性）提高，或加入加样孔中的酶浓度增加，溶菌圈的形成速率也会加快。
为定量评估蛋白质类抗菌物质对热灭活微生物的酶活性 B. subtilis因此选择了染料释放实验。利用氯胺天蓝R染料（RBB）标记底物的比色法实验可对蛋白质的抗菌活性进行多用途且灵敏的评估。RBB标记底物的酶促水解会释放可溶性蓝色产物，可通过分光光度计在595 nm处便捷地测定。已有多种RBB染料释放实验的改良方法被开发用于表征其他蛋白抗菌酶，表明该实验在不同底物应用中的灵活性。例如，在测定溶葡球菌酶溶菌活性的影响时，Zhou 等报道了一种染料释放实验，使用RBB染色的葡萄球菌细胞和葡萄球菌肽聚糖作为底物 12在对该RBB染料释放测定法的应用进行改进时，使用RBB标记的 Micrococcus luteus 底物被提议作为一种快速且灵敏的方法，用于诊断和筛查细菌感染及恶性癌等疾病，这些疾病可与人血清中溶菌酶的表达水平相关联 15此外，RBB标记的细菌细胞基质也已用于检测溶菌酶的酶谱法中 16.
我们展示了染料释放法具有更低的检测限、操作便捷且结果可重复，可用于快速筛选产酶菌株库。对该方法的改进还可用于后续的定量生物化学表征实验，包括温度、pH、盐度的影响，以及其他蛋白水解酶对抑菌蛋白活性的作用6。此外，定量染料释放法可用于比较多种酶对同一底物的活性。RBB染料释放法已被报道可用于检测具有降解多糖活性的酶，同时也适用于蛋白类抑菌物质的表征与检测。Pettersson和Eriksson曾报道一种利用无定形RBB染色的纤维素、木聚糖、甘露聚糖和壳聚糖微珠检测内切糖苷酶活性的实验方法17。在此基础上，研究人员开发出一种高灵敏度方法，使用RBB标记的胶体壳聚糖检测苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis Bt-107）产生的壳聚糖酶18。基于这些及其他研究，目前已出现多种商业化RBB染色底物，可用于检测糖解活性，包括针对角蛋白、支链淀粉、直链淀粉、糖原、海带多糖、D-木聚糖、偶氮大麦葡聚糖和淀粉的底物。
本研究展示了染料释放法在微孔板中的应用，该方法减少了产生比色结果所需的RBB标记底物和酶的体积。如图4和图5所示，微孔板染料释放法在检测酶活性时的检测限低于微载玻片扩散法。在快速使用、节省人力和结果判读便捷性方面，微载玻片扩散法在初步高通量筛选抗菌活性，以及在下游蛋白质分离与纯化步骤中指示抗菌蛋白存在的检测中具有实用价值。这两种方法相互补充，可用于新型蛋白类抗菌物质的初步筛选与最终表征。

抗菌剂在靶向多种微生物（如病毒、真菌和细菌）方面发挥着关键作用。不同细菌产生的抗菌活性在靶标特异性上各不相同，从广谱性到物种特异性均有涵盖，其中包括具有临床意义的细菌病原体1。在自然界中，诸如细菌素和溶菌素等蛋白质类抗菌化合物构成了微生物用于自我防御、复制和获取营养的武器库2,3。作为微生物群落内种群动态的调节介质，蛋白质类抗菌物质为产生这些物质的微生物提供了相对于非产生型敏感物种的竞争优势4。随着细菌群体中抗菌耐药性的不断扩展，人们对新型病原体控制手段的需求日益增长，这些蛋白质作为重组酶和益生菌，也因而具有重要的经济和社会价值5。
对新发现的蛋白质类抗菌物质进行初步评估时，需确定其内在的基本物理特性。快速筛选潜在抗菌物质的方法可用于选择对目标底物具有水解活性的候选分子。微载玻片扩散法和定量染料释放法可用于检测酶促水解反应，并适用于多种底物。对于作用于细菌细胞壁的蛋白质抗菌酶，这些方法具有良好的适用性，可对活菌细胞（仅微载玻片法适用）、热灭活的完整细菌细胞底物或从目标细菌中纯化的肽聚糖进行快速、有效的定性和定量筛选。这些检测方法在抗菌酶的发现中具有重要应用价值，可用于替代疗法、食品补充剂以及生物膜生成抑制剂等领域的研究。
微载玻片扩散实验和染料释放实验是用于检测和表征新型蛋白质抗菌物质的已验证方法。微载玻片扩散实验可提供抗菌活性的相对（定性）评估，并允许对酶浓度和活性进行初步推断。使用该方法时，活性可通过裂解区的形成直观观察：若无活性，则不会形成裂解区。裂解区的形成速率和直径可反映样品中酶的含量和纯度；然而，该速率以及裂解区内底物清除的质量也可能受到污染物存在、水解反应完成程度以及底物类型的影响。干扰性污染物可能影响酶从孔中扩散的速率，而水解不完全或底物类型的差异可能导致裂解区呈现浑浊状态6。
染料释放实验可定量测定酶促水解底物后释放到反应上清液中的共价结合型雷马唑尔亮蓝R染料产物的量。该方法因底物差异所导致的变异程度较小，因此与微载玻片扩散实验相比，对水解反应的检测具有更高的灵敏度。这些特性使得该方法可用于酶的生物化学性质表征，以及在不同抗菌酶之间进行比较时实现检测方法的标准化。
在本实验方案中，我们提供了进行基本微载玻片扩散实验和染料释放实验的方法，同时展示了每种方法的检测限范围和变异性。这些实验用于对一种从未表征的土壤细菌分离株培养上清液中纯化的未知蛋白质抗菌物质进行基本评价。通过实验中观察到的对细菌细胞底物的作用活性，可将该未表征的蛋白质抗菌物质与作为对照的蛋白水解酶α-胰凝乳蛋白酶（α-chymotrypsin）的反应活性进行比较。这些实验方案为两种技术的应用奠定了基础，且可根据不同应用需求进行扩展和修改。

<table><tbody><tr><td>48孔平底微孔板，带低蒸发盖</td><td>Becton Dickinson</td><td>3078</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底微孔板（Costar 3595）</td><td>Corning, Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP162-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-糜蛋白酶</td><td>MP Biomedicals</td><td>215227205</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 168</td><td>American Type Culture Collection</td><td>23857</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch 热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>打孔器</td><td>Humboldt</td><td>H-9661</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>麦法伦（McFarland）浊度标准液（2.0）</td><td>Fisher Scientific</td><td>R20412</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-38-103</td><td></td></tr><tr><td>营养肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25959B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt; 168 的肽聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69554-10MG-F</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（1×）</td><td>Teknova</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT 微孔板分光光度计</td><td>BioTek Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丽丝胺亮蓝 R 染料（RBB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8001</td><td></td></tr><tr><td>肠炎沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp. enterica）</td><td>American Type Culture Collection</td><td>10708</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Titer Tops 预切粘性聚乙烯薄膜</td><td>Diversified Biotechnology</td><td>T-TOPS-50</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 去离子水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖溶液&lt;br/&gt; 50 ml PBS&lt;br/&gt; 0.25 g 琼脂糖</td><td></td><td></td><td>向熔融的 PBS/琼脂糖溶液中加入 10% 叠氮化钠</td></tr><tr><td>营养肉汤培养基&lt;br/&gt; 4 g 营养肉汤&lt;br/&gt; 500 ml I 型水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM 氢氧化钠（NaOH）溶液&lt;br/&gt; 1 g NaOH&lt;br/&gt; 99 ml I 型水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM 丽丝胺亮蓝 R 染料（RBB）&lt;br/&gt; 1.25 g RBB&lt;br/&gt; 98.75 ml 250 mM NaOH 溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

定性与定量检测及表征蛋白质类抗菌物质的实验方法

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

在投入更多研究精力和资源之前，对大型微生物文库进行初步评估以筛选潜在的新型抗菌蛋白生产者，需要同时采用定性和定量方法来检测目标酶。本实验方案旨在展示两种互补的检测方法，用于开展此类初步评估。微载玻片扩散法可作为初步或简单的检测筛选手段，能够对多种活菌及热灭活细菌靶标底物的蛋白水解活性进行定性且快速的评估。作为补充，染料释放法具有更高的灵敏度和可重复性，可为评估和比较影响蛋白质类抗菌物质水解活性的环境因素提供定量分析平台。通过使用雷马素亮蓝R染料标记特定的热灭活细胞培养底物，可进一步拓展该方法的应用范围，使其能够针对性地表征目标酶活性。

微载玻片扩散实验和定量染料释放实验是筛选和初步测定新型蛋白类抗菌物质的有效方法。每种实验方法均有其优势与局限性；然而，当两者结合使用时，可实现对抗菌物质的快速初步筛选及基本表征。
微载玻片扩散实验可高效快速筛选产生蛋白质类抗菌物质的微生物文库。当关注酶浓度水平时，检测灵敏度的限制可能会影响该实验，需要向反应孔中添加比染料释放实验更多的酶量。如图1所示，该实验的定性特性使观察者能够比较各孔中相对酶量的多少。
在裂解发展区（如图1A所示，酶量为25 µg）中，该区域的前沿表现为底物裂解浑浊或不完全，而靠近加样孔区域的底物裂解则更为彻底。这一现象是由于扩散酶在前沿处浓度逐渐降低所致，从而增加了准确测量裂解区直径的难度。观察图1中的加样孔B（15 µg）、C（10 µg）、D（5 µg）、E（1.0 µg）和F（0.1 µg）可见，完全裂解区的直径随酶量减少而逐渐减小直至消失。在F组条件（0.1 µg）下，琼脂糖中的酶浓度已低于可检测限，导致扩散中的酶在穿过琼脂糖并水解底物时无法被可视化。本研究还采用纯化的Bacillus subtilis肽聚糖作为底物进行了显微载片扩散实验（图2）。尽管由于肽聚糖在琼脂糖中难以均匀悬浮，导致裂解区轮廓不如使用完整Salmonella enterica细胞时清晰，但未知抗菌酶对肽聚糖的水解作用仍然明显可见。
染料释放实验比微载玻片扩散实验更灵敏且更具灵活性，可实现更低的检测限，并可调节影响酶反应的环境因素。在代表性实验中，通过改变温度以确定抗菌酶的最适反应温度，在PBS缓冲液中确定为35 °C（图3）。该最适温度在反应上清液中表现为蓝色加深（图3B），也可通过在595 nm处测得的吸光度计算出的酶活性单位来体现（图3A）。染料释放实验的灵活性使研究人员不仅能够调整温度，还可改变反应缓冲液及其组分，从而快速确定特定酶的最适孵育条件。
在确定的最适孵育温度35 °C下，使用PBS缓冲液，以经RBB标记的热灭活Bacillus subtilis为底物，测定了未知抗菌酶（图4）和α-胰凝乳蛋白酶对照酶（图5）的活性水平。比较图4与图5的结果表明，该未知抗菌酶对B. subtilis底物的亲和力约为对照酶的两倍。此外，α-胰凝乳蛋白酶对照在孔内未能完全消化热灭活的B. subtilis底物（数据未显示）。α-胰凝乳蛋白酶对照的活性在酶量达到约0.3 µg时开始趋于平缓，而未知抗菌酶在所有酶用量范围内，其活性单位均持续上升（图4和图5）。这一现象可能表明，该未知酶具有更强的持续活性，或在B. subtilis底物中存在更多可供该酶作用的切割位点。
<img alt="抗生素敏感性试验，PBS对照，扩散区分析，纸片法，细菌抑制。" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：未知蛋白抗菌物质对鼠伤寒沙门氏菌全细胞底物的酶活性。采用微载玻片扩散法，定性评估一种未知蛋白抗菌物质对热灭活的鼠伤寒沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp. enterica，ATCC 10708）的活性。将不同质量的该未知抗菌蛋白溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，分别加入载玻片上的各孔，其蛋白质量分别为25 µg（A孔）、15 µg（B孔）、10 µg（C孔）、5 µg（D孔）、1 µg（E孔）和0.1 µg（F孔）。实验以仅含PBS的孔作为阴性对照。在37°C孵育6小时后观察并拍摄裂解区图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡：粗糙表面上的弹珠实验装置；概念演示。" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：对 Bacillus subtilis 肽聚糖细胞壁的酶活性。采用微载玻片扩散法对一种未知蛋白质抗菌物质针对 Bacillus subtilis 168 肽聚糖的活性进行定性评估。将 10 µg 未知抗菌物质悬浮于 20 µl PBS 中，加入微载玻片的 A 孔。仅使用 PBS 作为该实验的阴性对照（B 孔）。在 37 °C 下孵育 6 小时后拍摄溶菌圈图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示温度梯度测定结果的温度依赖性酶活性图。" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：一种蛋白质抗菌剂的最适反应温度。 染料释放测定法的灵活性允许改变物理和化学参数（如孵育温度和缓冲液），以确定这些因素对目标酶活性的影响6。如本图所示，在一系列孵育温度下，使用PBS缓冲液评估了未知蛋白质抗菌剂（1 µg）对RBB标记的热灭活Bacillus subtilis的作用活性。在（A）中以活性单位（AU）表示，通过微孔板分光光度计在595 nm处测定水解后释放到上清液中的RBB结合产物的吸光度。在每种温度条件下，均设置未添加酶的反应作为对照，以扣除因不同温度孵育导致的染料非特异性释放的影响。在进行吸光度测定之前，对对应各孵育温度的反应上清液进行了成像（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抗菌酶活性图谱及检测结果；酶浓度与活性单位的关系。" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：一种蛋白质类抗菌物质的活性范围。 通过BCA蛋白测定法测定，在加入0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1,000 ng蛋白抗菌物质并过夜孵育后，检测其活性单位，从而确定该未知蛋白抗菌物质的活性范围（A）。在这些反应中，RBB标记的B. subtilis底物浓度被提高至在595 nm处的光密度达到5.0，以确保在反应孵育期间，酶量最高（1,000 ng）的反应不会完全水解所有可用底物。未添加酶的对照反应用于扣除仅因孵育本身导致染料释放所产生的影响。在进行吸光度测定之前，对每种酶量对应的反应上清液进行了成像（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="糜蛋白酶活性曲线、酶活性测定结果、显示活性单位与酶量关系的图表。" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5：α-糜蛋白酶的活性范围。 α-糜蛋白酶的活性范围通过测定0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1,000 ng酶在过夜孵育后的活性单位来确定（A）。在这些反应中，RBB标记的B. subtilis底物浓度被提高至在595 nm处的光密度达到5.0，以确保在最高酶量（1,000 ng）的反应中，孵育期间不会完全水解所有可用底物。未添加酶的对照反应用于扣除仅因孵育导致的染料释放影响。在进行吸光度测定之前，对每种酶量对应的反应上清液进行了成像（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了快速筛选和表征具有抗菌活性酶的实验方案。微载玻片扩散法和染料释放法利用目标细菌作为底物，分别对酶活性进行定性和定量评估。

对大型微生物文库进行初步筛选以寻找潜在的新型抗菌蛋白生产者时，需要同时采用定性和定量方法。

这些实验的总体目标是快速筛选和表征具有抗菌活性的酶。微载玻片扩散法和染料释放法可用于功能性发现针对特定靶标（如目标致病菌）具有裂解活性的新型抗菌物质。这些技术的主要优势在于操作简便，实验参数可灵活调整，并且仅需大多数微生物学实验室常见的实验设备即可完成。在开始微载玻片扩散实验之前，应根据制造商的说明书，使用BCA蛋白检测试剂盒测定待评估抗菌酶的浓度。使用PBS作为反应缓冲液，对抗菌酶进行系列稀释。将蛋白分装至各微量离心管中，并用PBS调节体积至20毫升。接下来，通过将0.25克琼脂糖溶解于50毫升PBS中，制备0.5%的琼脂糖溶液。加热该溶液至沸腾，直至琼脂糖完全溶解。通过称重确定熔化过程中损失的水量，并将损失的水补回溶液中。为抑制检测孵育过程中污染性细菌的生长，向琼脂糖溶液中加入15微升10%叠氮化钠水溶液，并将溶液温度在水浴中调节至50摄氏度。若使用活细胞作为底物，则琼脂糖溶液中不添加叠氮化钠。将热灭活的细菌底物置于冰上解冻。将细菌基质重悬于12毫升琼脂糖溶液中，使其浊度大致相当于2.0麦氏浊度标准。通过观察溶液后方白色背景上的黑色线条来比较溶液浊度，并继续向琼脂糖溶液中添加细菌基质，直至达到相近的浊度。立即但小心地用移液器将3毫升琼脂糖基质溶液加入每张微载玻片中，确保溶液不会溢出微载玻片。载玻片凝固后，使用直径为4.8毫米的打孔器在每个微载玻片的琼脂糖基质层上打三个孔。将每种经调整的蛋白系列稀释液各20微升加入相应孔中。阴性对照孔中加入牛血清白蛋白。作为阳性对照，使用针对底物已知的溶菌酶，例如溶菌酶。将载玻片置于湿度 chamber 中，在 37 摄氏度或酶的最适活性温度下孵育。孵育时间的长短取决于抗菌酶的浓度和比活性。典型的反应时间约为16小时。孵育完成后，在散射光下观察玻片，并拍摄正在发育的检测图像。使用配备60毫米镜头的数码单反相机，焦距约为30厘米。在下一节将演示的染料释放实验中，底物共价连接至活性 Brilliant Blue R 染料（Remazol Brilliant Blue R，RBB）。首先配制 200 毫摩尔的 RBB 溶液，将 1.25 克 RBB 溶解于新配制的氢氧化钠溶液中。接下来，将热灭活的细菌细胞重悬于30毫升RBB溶液中，浓度为0.5克湿重。对于纯化的肽聚糖，将肽聚糖重悬于30毫升RBB溶液中，浓度为0.3克湿重。由于后续步骤相同，无论使用何种底物，以下仅以细菌细胞为例进行说明。将反应混合物置于37摄氏度的旋转平台上，轻柔混匀孵育六小时。六小时后，将反应混合物转移至4摄氏度的培养箱中，继续轻柔混匀孵育12小时。孵育完成后，于3000 × g 离心30分钟，收集染色后的底物。将染料溶液从底物沉淀中倾倒出去。用I型水充分重悬沉淀，随后进行离心。以该方式对染料标记的细胞洗涤三至五次，以去除底物上非共价结合的可溶性染料。进行最终洗涤时，将用于染料释放实验的沉淀部分转移至1.5毫升微量离心管中。最后一次洗涤的上清液应澄清，而底物仍保持蓝色。将染色后的底物悬浮于少量水中，于20摄氏度保存，直至使用。进行染料释放实验前，先将冷冻的染色底物恢复至室温，并用针对该酶经实验确定的缓冲液洗涤两次。本实验中使用 PBS 缓冲液。通过将 200 微升的反应体积乘以拟进行的染料释放实验次数，计算所需底物悬浮液的体积。为制备底物悬液，首先将染色底物加入适当体积的磷酸盐缓冲液（PBS）中。进行1:1稀释后，以PBS作为空白对照，测定595纳米处的初始光密度值。随后向悬液中逐量加入染色底物，直至595纳米处的光密度达到2.0。在此实验中，将采用染料释放法测定蛋白抗菌剂的最佳孵育条件。首先，根据方案文本中的描述，使用 PBS 将蛋白抗菌剂原液的浓度调节至 1 毫克/毫升。然后将该原液稀释至浓度为 100 纳克/微升。该浓度可使加入检测反应中的每体积样品含有1微克的蛋白质，最终反应体系中的蛋白质量为1微克。在评估温度范围时，应在0.5毫升微量离心管中进行反应检测。针对每个温度条件，将10微升的储备蛋白溶液加入200微升已制备的底物悬浮液中。在热循环仪中孵育八小时，每小时翻转混匀一次。孵育结束后，向每根微量离心管中加入25微升乙醇以终止反应。为去除未消化的不溶性底物，在3000 × g离心两分钟。随后，小心操作以免扰动未消化底物形成的沉淀，将每种反应混合物中的150微升反应上清液转移至96孔平底微孔板中。为定量酶活性，使用微孔板分光光度计在595纳米处测定上清液的吸光度。上清液中来自标记底物释放的可溶性染料导致吸光度升高，该变化可定量反映酶活性。采用微载玻片扩散法对抗未知蛋白质抗菌物质对热灭活的伤寒沙门菌全细胞底物的活性进行定性评估。从 A 到 F 孔依次加入递增量的抗菌物质，以 PBS 作为阴性对照。六小时后，观察各孔周围形成的透明水解圈的大小。酶活性较高时，对应的区域较大；酶活性较低时，对应的区域较小。采用定量染料释放法测定蛋白质抗菌剂的最适反应温度。根据反应上清液中蓝色的深浅以及由595纳米处吸光度测量值计算出的活性单位可知，35°C为最适温度。染料释放实验还用于测定未知蛋白质抗菌物质对经热灭活的枯草芽孢杆菌底物的作用活性范围。与α-胰凝乳蛋白酶的活性范围相比，该未知抗菌酶对底物的亲和力几乎高出一倍。此外，α-胰凝乳蛋白酶的活性在酶量约为0.3 µg时开始趋于平稳，而未知酶的活性则在所有测试酶量范围内持续上升。掌握之后，微载玻片扩散实验可在30分钟内完成。染料释放实验可在一小时内完成。每种实验的孵育时间将取决于酶的活性及其浓度。在上述实验流程的基础上，可通过改变反应条件（如缓冲液的 pH 值和盐浓度），对染料释放法进行改进，以测定化学因素对抗菌酶酶活性的影响。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用微载玻片扩散法和染料释放法，快速筛选和表征具有抗菌活性的酶。

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科研

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