定性与定量检测及表征蛋白质类抗菌物质的实验方法

这些实验的总体目标是快速筛选和表征具有抗菌活性的酶。微载玻片扩散法和染料释放法可用于功能性发现针对特定靶标（例如目标致病菌）具有裂解活性的新型抗菌物质。这些技术的主要优势在于操作简便，实验参数可灵活调整，并且仅需使用大多数微生物学实验室中常见的实验设备即可完成。

在开始微载玻片扩散实验之前，应根据制造商的说明，使用BCA蛋白检测试剂盒测定待评估抗菌酶的浓度。使用PBS作为反应缓冲液对抗菌酶进行系列稀释。将蛋白分装至各个微量离心管中，并用PBS调节体积至20毫升。

接下来，通过将0.25克琼脂糖溶解于50毫升PBS中，制备0.5%的琼脂糖溶液。加热该溶液至沸腾，直至琼脂糖完全溶解。通过称重确定熔化过程中损失的水量，并将损失的水加回溶液中。

为防止检测孵育过程中污染性细菌生长，向琼脂糖溶液中加入15微升10%叠氮化钠水溶液，并将溶液温度在水浴中调节至50摄氏度。若使用活细胞作为底物，则应在琼脂糖溶液中省略叠氮化钠。将热灭活的细菌底物置于冰上解冻。

将细菌基质重悬于12毫升琼脂糖溶液中，使其浊度大致相当于2.0麦氏（McFarland）浊度标准。通过观察溶液后方白色背景上的黑色线条来比较溶液的浊度，并继续向琼脂糖溶液中添加细菌基质，直至达到相近的浊度。随后立即但小心地用移液器将3毫升琼脂糖基质溶液加入每张微载玻片中，确保溶液不会溢出微载玻片。

载玻片凝固后，使用直径为 4.8 毫米的打孔器在每个微载玻片的琼脂糖基质层上打三个孔。将 20 微升每种调整浓度的蛋白系列稀释液分别加入对应的孔中。在阴性对照孔中使用牛血清白蛋白。

作为阳性对照，使用针对底物的已知溶菌酶，例如溶菌酶。将载玻片置于湿度 chamber 中，在 37 摄氏度或酶的最适活性温度下孵育。孵育时间的长短取决于抗菌酶的浓度和比活性。

典型的反应时间约为16小时。孵育完成后，在散射光下观察玻片，并拍摄正在发育的检测图像。使用配备60毫米镜头的数码单反相机，焦距约为30厘米。

在下一节将要演示的染料释放实验中，底物共价连接至丽丝胺亮蓝R染料（Remazol Brilliant Blue R dye）或简称RBB。本实验方案首先配制200毫摩尔的RBB溶液。将1.25克RBB溶解于新配制的氢氧化钠溶液中。

接下来，将热灭活的细菌细胞重悬于30毫升RBB溶液中，浓度为0.5克湿重。对于纯化的肽聚糖，将肽聚糖重悬于30毫升RBB溶液中，浓度为0.3克湿重。由于后续步骤相同，无论使用何种底物，以下仅以细菌细胞为例进行说明。

将反应混合物置于37摄氏度的旋转平台上，轻柔混匀孵育六小时。六小时后，将反应混合物转移至4摄氏度的培养箱中，继续轻柔混匀孵育12小时。孵育完成后，于3000 × g 离心30分钟，收集染色后的底物。

将染料溶液从底物沉淀中倾倒出去。用 I 型水充分重悬沉淀，随后进行离心。以该方式对染料标记的细胞洗涤三至五次，以去除底物上非共价结合的可溶性染料。

进行最终洗涤时，将用于染料释放实验的沉淀部分转移至1.5毫升微量离心管中。最后一次洗涤后的上清液应澄清，而底物仍保持蓝色。将染色后的底物悬浮于少量水中，于20摄氏度保存，直至使用。

为进行染料释放实验，先将冷冻的染色底物恢复至室温，并用针对该酶经实验确定的检测缓冲液洗涤两次。本实验中使用的是 PBS。通过将 200 微升的反应体积乘以拟进行的染料释放实验次数，计算出所需底物悬液的体积。

为制备底物悬浮液，首先将染色底物加入适量体积的磷酸盐缓冲液（PBS）中。进行1:1稀释后，以PBS作为空白对照，测定595纳米处的初始光密度值。随后逐步向悬浮液中添加染色底物，直至595纳米处的光密度达到2.0。

在本实验中，将采用染料释放法测定一种蛋白质抗菌剂的最佳孵育条件。首先，根据方案文本中的描述，使用 PBS 将蛋白质抗菌剂原液的浓度调节至 1 毫克/毫升。然后，将该原液稀释至浓度为 100 纳克/微升。

该浓度可使加入检测反应中的每体积样品含有最终反应质量为一微克的蛋白质。在0.5毫升微量离心管中进行反应检测，以评估所需的温度范围。针对每种热处理条件，将10微升的储备蛋白质溶液加入200微升已制备的底物悬浮液中。

在热循环仪中孵育八小时，每小时翻转混匀一次。孵育结束后，向每个微量离心管中加入25 µL乙醇以终止反应。为去除未消化的不溶性底物，在3000 × g离心两分钟。

随后，小心操作以免扰动未消化底物形成的沉淀，将每种反应混合物中的150微升反应上清液转移至96孔平底微孔板中。为定量酶活性，使用微孔板分光光度计在595纳米处测定上清液的吸光度。上清液中由标记底物释放出的可溶性染料导致吸光度升高，该变化可作为酶活性的定量指标。

采用微载玻片扩散法对未知蛋白质抗菌活性进行定性评估，底物为经加热灭活的伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）全菌细胞。抗菌物质从A孔至F孔依次递增添加，以磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照。六小时后，观察各孔周围形成的透明水解圈大小。

酶活性较高时，对应的区域较大；酶活性较低时，对应的区域较小。采用定量染料释放法测定蛋白质抗菌剂的最适反应温度。根据反应上清液中蓝色的深浅以及在595纳米处吸光度测量值计算出的活性单位，可知最适温度为35摄氏度。

染料释放实验还用于测定一种未知蛋白质抗菌物质对经热灭活的枯草芽孢杆菌底物的作用活性范围。与α-胰凝乳蛋白酶的活性范围相比，该未知抗菌酶对底物的亲和力几乎高出一倍。此外，α-胰凝乳蛋白酶的活性在酶量约为0.3 µg时开始趋于平缓，而未知酶的活性则在所有测试的酶量范围内持续上升。

一旦掌握，微载玻片扩散实验可在30分钟内完成，而染料释放实验可在1小时内完成。每种实验的孵育时间将取决于酶的活性及其浓度。

在上述实验步骤的基础上，可通过改变反应条件（如缓冲液的 pH 值和盐浓度），对染料释放法进行改进，以确定影响抗菌酶酶活性的化学因素。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用微载玻片扩散法和染料释放法快速筛选和表征具有抗菌活性的酶。