定性和定量测定为检测和蛋白质抗菌药物的表征
2016年4月10日
在这里，我们提出了快速筛选和表征酶抗菌活性的方案。微玻片扩散测定和染料释放测定利用靶细菌底物进行定性和定量酶活性评估。
这些实验的总体目标是快速筛选和表征酶的抗菌活性。微玻片扩散和染料释放测定可用于发现对特定靶标（如感兴趣的病原菌）具有裂解活性的新型抗菌剂的功能发现。这些技术的主要优点是易于执行，为实验参数的变化提供了灵活性，并且可以使用大多数微生物实验室中常见的实验室设备进行。
在开始微玻片扩散测定之前，应根据制造商的方案使用 BCA 蛋白测定试剂盒测定待评估的抗菌酶的浓度。使用 PBS 作为反应缓冲液，对抗菌酶进行连续稀释。将蛋白质分配到单独的微量离心管中，并使用 PBS 将体积调节至 20 mL。
接下来，通过将 0.25 克琼脂糖溶解在 50 毫升 PBS 中来制备 0.5% 琼脂糖溶液。将此溶液加热至沸腾，直到琼脂糖完全溶解。按重量测定熔化过程中损失的水分，然后加回溶液中。
为了在测定孵育过程中抑制污染细菌的生长，向琼脂糖溶液中加入 15 微升 10% 叠氮化钠的水中，并在水浴中将溶液温度调节至 50 摄氏度。如果使用活细胞作为底物，则省略琼脂糖溶液中的叠氮化钠。在冰上解冻热灭活的细菌底物。
将细菌底物重悬于 12 mL 琼脂糖溶液中，以大致匹配 2.0 McFarland 等效浊度标准品的浊度。通过溶液在白色背景上显示一条黑线来比较溶液的浊度，向琼脂糖中加入细菌底物，直到达到近似的浊度。立即但小心地将 3 毫升琼脂糖底物溶液移液到每个微载玻片中，确保溶液不会溢出微载玻片。
载玻片凝固后，使用直径为 4.8 毫米的软木钻孔器在每个微载玻片的琼脂糖底物层中打入三个孔。将 20 微升每种调整后的蛋白质连续稀释液添加到相应的孔中。在阴性对照孔中使用牛血清白蛋白。
作为阳性对照，使用适合底物的已知溶菌酶，例如溶菌酶。将载玻片在 37 摄氏度或酶的最佳活性温度下的湿度室中孵育。孵育时间长短取决于抗菌酶的浓度和比活性。
典型的反应时间约为 16 小时。孵育完成后，在间接光下观察载玻片，并捕获显影测定的图像。使用带有 60 毫米镜头、焦距约为 30 厘米的数码单镜头反相机。
在下一个片段中证明的染料释放测定中，底物与 Remazol Brilliant Blue R 染料或 RBB 共价连接。通过制备 200 毫摩尔 RBB 溶液开始此协议。将 1.25 克 RBB 溶解在新鲜制备的氢氧化钠溶液中。
接下来，将浓度为 0.5 克湿重的热灭活细菌细胞重悬于 30 毫升 RBB 溶液中。对于纯化的肽聚糖，将肽聚糖以 0.3 克湿重的浓度重悬于 30 毫升 RBB 溶液中。由于后续步骤相同，因此无论使用何种底物，都将仅针对细菌细胞进行标记。
将反应混合物在旋转平台上于 37 摄氏度下孵育 6 小时，并轻轻混合。6 小时后，将反应混合物转移到 4 摄氏度的培养箱中，再孵育 12 小时，轻轻混合。孵育完成后，以 3000 x g 离心 30 分钟，收获染色的底物。
从底物沉淀中倒出染料溶液。将沉淀在 I 型水中彻底重悬，然后离心。以这种方式对染料标记的细胞进行水 3 到 5 次，以从底物中去除非共价连接的可溶性染料。
对于最终洗涤，将用于染料释放测定的沉淀部分转移到 1.5 ml 微量离心管中。最后一次洗涤的上清液应该是透明的，而底物保持蓝色。将染色的基材悬浮在 20 摄氏度的少量水中储存，直到准备好使用。
为了准备染料释放测定，让冷冻染色的底物恢复到室温，并用经验测定的酶测定缓冲液洗涤两次。在这种情况下使用 PBS。通过将 200 μL 反应体积乘以要进行的染料释放测定的次数来计算所需的底物悬浮液的体积。
要制备底物悬浮液，首先将染色的底物添加到适当体积的 PBS 中。进行一对一稀释，并使用 PBS 作为空白，对 595 纳米的光密度进行初始测量。向悬浮液中加入逐渐增加的染色底物，直到在 595 纳米处达到 2.0 的光密度。
在本演示中，染料释放测定将用于确定蛋白质抗菌剂的最佳孵育条件。首先，按照方案文本中的说明，使用 PBS 将浓度调节至 1 毫克/毫升，制备原蛋白抗菌悬浮液。然后将原液蛋白抗菌悬浮液稀释至每微升 100 纳克的浓度。
该浓度得到的最终反应质量为每体积添加到测定反应中 1 μg 蛋白质。在 0.5 ml 微量离心管中进行反应测定，以评估要评估的热范围。对于每种热条件，将 10 微升原液蛋白添加到 200 微升制备的底物悬浮液中。
在热循环仪中孵育 8 小时，每小时倒置混合一次。孵育后，向每个微量离心管中加入 25 μL 乙醇以阻止反应。要去除未消化的不溶性底物，请以 3000 x g 离心 2 分钟。
之后，在注意不要破坏未消化底物沉淀的同时，将每种反应混合物的 150 微升反应上清液转移到 96 孔平底微孔板中。为了量化酶活性，使用微孔板分光光度计测量 595 纳米处上清液的吸光度。从标记底物释放到上清液中的可溶性染料增加的吸光度是酶活性的定量测量。
微玻片扩散试验用于定性评价未知蛋白质抗菌剂对热灭活肠道沙门氏菌全细胞底物的活性。从 A 到 F 孔中增加抗菌剂的量，PBS 用于阴性对照。6 小时后，观察每口井周围形成的透明水解带的大小。
高酶活性与较大的区域有定性关系，而低酶活性与较小的区域有定性关系。染料释放定量测定法用于确定蛋白质抗菌剂的最佳反应温度。从反应上清液中蓝色的量以及从 595 纳米处的吸光度测量得出的活性单位可以看出，35 摄氏度是最佳温度。
染料释放测定还用于确定一种未知蛋白质抗菌剂对枯草芽孢杆菌热灭活底物的活性范围。与 α-胰凝乳蛋白酶的活性范围进行比较后发现，未知的抗菌酶对底物的亲和力几乎是其两倍。此外，虽然 α-胰凝乳蛋白酶的活性开始稳定在 0.3 μg 左右，但未知酶的活性在所有酶量中继续上升。
一旦掌握，微玻片扩散测定可在 30 分钟内完成。染料释放测定可在 1 小时内完成。每次测定的孵育时间将取决于酶活性及其浓度。
在这些程序的基础上，可以修改染料释放方法，通过纵反应的各个方面（如缓冲液 pH 值和盐度）来确定影响抗菌酶酶活性的化学影响。观看本视频后，您应该对如何使用微玻片扩散和染料释放分析快速筛选和表征酶的抗菌活性有很好的了解。
概述
本文介绍了使用微滑片扩散和染料释放测定法快速筛选和表征具有抗菌活性的酶的方法。这些方法允许对特定细菌目标进行酶活性的定性和定量评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 酶学
- 抗菌研究
背景
- 抗菌药物耐药性是医疗保健领域日益关注的问题。
- 快速筛选方法对于发现新的抗菌剂至关重要。
- 酶测定可以提供潜在抗菌药物溶菌活性的见解。
- 常见的实验室设备可以用于这些测定。
研究目的
- 开发筛选具有抗菌性质的酶的方法。
- 评估这些酶对特定致病细菌的有效性。
- 为研究人员提供一种灵活且直接的方法。
使用的方法
- 微滑片扩散测定法用于定性评估。
- 染料释放测定法用于酶活性的定量测量。
- 制备细菌基质和酶稀释液。
- 使用对照来验证测定结果。
主要结果
- 成功表征了酶对目标细菌的活性。
- 证明了染料释放测定法的有效性。
- 确定了酶活性的最佳条件。
- 通过成像对测定结果进行可视化记录。
结论
- 所开发的方法对筛选抗菌酶是有效的。
- 这些方法可以适用于各种实验室环境。
- 进一步的研究可以在这些发现基础上发现新的抗菌药物。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
Rapid screening of microbial libraries for novel antimicrobial proteins requires complementary qualitative and quantitative assays to efficiently prioritize targets for downstream development. The microslide diffusion assay enables fast, visual detection of proteolytic activity, while the dye-release assay provides reproducible, quantitative data to assess environmental influences on enzyme function. Together, these methods support early target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables qualitative assessment of antimicrobial enzyme activity against diverse bacterial substrates to interrogate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Supports rapid screening of large microbial libraries using minimal reagent volumes and standard microbiology equipment.
- Predictive Value: Provides initial activity readouts that help triage candidates before investing in resource-intensive characterization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The dye-release assay generates quantitative, absorbance-based measurements that enable comparison of enzymatic activity across conditions.
- Operational Value: Uses covalently labeled substrates (e.g., Remazol brilliant blue R) to increase sensitivity and reduce variability in activity readouts.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening of enzyme variants or environmental modifiers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Characterizes enzyme activity against clinically relevant pathogens (e.g., Salmonella enterica, Bacillus subtilis) to align with disease models.
- Mechanistic De-risking: Determines optimal reaction conditions (e.g., temperature, pH, salinity) to predict in vivo performance and formulation stability.
- Activity Profiling: Enables comparison of unknown antimicrobials to benchmark enzymes (e.g., alpha-chymotrypsin) to assess relative affinity and activity range.
Pipeline & Workflow Integration
The microslide diffusion and dye-release assays function as complementary early-stage tools in the antimicrobial discovery continuum, supporting progression from initial hit identification to lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by rapidly evaluating lytic activity against target pathogens to clarify mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative output generation for hit-to-lead progression.
- Analytics: Provides absorbance-based readouts at 595 nm that allow teams to quantify and compare enzymatic activity under varying conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by defining optimal enzymatic conditions that inform formulation and delivery strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening antimicrobial enzymes across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by delivering both qualitative activity zones and quantitative kinetic data.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized substrate labeling (RBB dye) and controlled incubation parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of enzyme affinity, activity range, and environmental robustness.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on characterized activity profiles and optimal conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques, including substrate preparation, turbidity standardization, and aseptic handling.
- Depends on standard laboratory equipment such as incubators, centrifuges, microplate spectrophotometers, and thermal cyclers.
- Necessitates cross-team standardization of substrate labeling protocols (e.g., RBB conjugation) to ensure assay comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the dye-release assay to different substrates (e.g., purified peptidoglycan vs. whole cells).
- Includes practical limitations such as the need for optimization of incubation times based on enzyme-specific activity and concentration.
