检测梭菌感染后抗原特异性抗体应答的蛋白微阵列测定方法
2018年6月15日
本文介绍了一种简单的蛋白质芯片方法, 用于分析人体血清中高纯度梭菌抗原7丛细胞的体液免疫反应。该协议可推广用于测定多克隆静脉注射免疫球蛋白制剂中特异抗体的反应。
该方法可能有助于以患者特异性的方式优化和选择临床上有用的艰难梭菌感染免疫疗法，并阐明人类对艰难梭菌的免疫反应。该技术的主要优点是能够准确、同时定量多同种型和菌株特异性抗体对艰难梭菌抗原的反应。一般来说，不熟悉这种方法的人会很挣扎，因为在建立和优化一组高度纯化的抗原以及建立技术平台方面需要专业知识。
这种方法的视觉演示至关重要，因为准备微波板、阵列打印、安全程序和数据分析所涉及的方法列表类型需要注意细节。我实验室的技术人员 Sam Greenwood 将演示一些程序。首先，将艰难梭菌抗原和打印缓冲液稀释至最佳浓度。
接下来，将 10 μL 抗原溶液转移到 384 孔板中。用板密封盖住板，并在室温下以 300 倍重力离心 5 分钟。对于微阵列打印，使用手持式燃气燃烧器将硅 PIN 加热 3 次，每次 2 秒。
然后，用清水冲洗硅 PIN 3 次，每次 3 秒。将微阵列板放入阵列仪的加载盒中。弹出托盘，然后将氨基硅烷载玻片放入载玻片托盘中，按下 OK 按钮打开真空。
确保所有幻灯片都已保护，然后单击 OK（确定）。将托盘放回原点，然后合上盖子。接下来，启动相应的程序并转到 文件，然后 微阵列参数，然后 打开.选择艰难梭菌文件以一式四份打印所有抗原。
在此窗口下，打开 Source 选项卡以指示样品储存，并打开 Target 选项卡以输入微阵列详细信息。然后，打开 Options 选项卡以选择洗涤工具。在 Run Preferences 的 General 选项卡下的 TAS 应用程序套件工具栏上，选择 Wash at start of run 和 Wash at end of run。
打开"气候"选项卡，将湿度水平设置在 55% 到 60% 之间现在开始运行，并定期检查阵列器以确保正常运行。打印后，小心地将打印的载玻片放入具有 16 个多孔室的载玻片架中。然后向每个块中加入 100 微升 5% BSAT。
盖上玻片，在室温下振荡孵育 1 小时。使用 120 μL PBST 将每个块洗涤 5 次，每次 1 分钟，振荡。接下来，将艰难梭菌感染患者和健康对照者获得的血清样品在冰上解冻 20 分钟。
将市售抗体稀释剂添加到预模块中，然后将样品添加到预模块中并混合。丢弃洗涤缓冲液，向实验块中加入 100 μL 的每种稀释样品。对于阴性对照块，仅添加 100 μL 抗体稀释剂。
然后，将玻片在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。接下来，使用 120 μL PBST 将每个模块洗涤 5 次，每次振荡 3 分钟。然后向每个模块中加入 100 μL 用抗体稀释剂稀释的生物素化山羊抗人抗体。
盖上玻片，在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。使用 120 μL PBST 洗涤每个模块五次，每次振荡 3 分钟。接下来，以 1 到 2000 个块的比例加入 100 微升用 5% BSAT 稀释的链霉亲和素 SY5 偶联物。
用箔纸盖住玻片，在室温下轻轻摇动孵育 15 分钟。首先用 120 μL PBST 洗涤载玻片 5 次，每次 1 分钟，然后再用 PBS 洗涤 2 次，每次 1 分钟。要干燥载玻片，请在 300 倍重力下旋转它们 5 分钟。
扫描前 30 分钟打开激光扫描仪，使其预热。然后将载玻片放入扫描仪中，打印表面朝上，直到印版指示灯变为绿色常亮。接下来，按 个人设置 按钮。
在第一个选项卡上，确保 Automatic scrolling 和 Barcode 未选中。然后，将 像素大小 设置为 10，将 Scan Mode 设置为 Medium，将 Acquisition 设置为 635 only，将 Acquisition Mode 设置为 Manual，将增益设置为 20，并将 Power 设置为低。在第二个选项卡上，确保幻灯片类型未标记。
在第三个选项卡上，将 Focus （焦点） 设置为 Auto focus （自动聚焦）。按 import grid 按钮选择与扫描图像关联的适当阵列列表。然后，按下自动查找按钮，将网格与幻灯片上的位置对齐。
最后，按下 Quantification Process 按钮测量每个点的荧光强度。然后，以适当的格式保存结果以供进一步分析。在该方案中，将蛋白质微阵列与 ELISA 进行比较，以评估这两种技术之间的可重复性。
Spearman 相关系数分析显示，微阵列和 ELISA 在检测血清样品中的 IgG 抗毒素 A 和抗毒素 B 水平方面具有显著一致性。使用 7 名患者的血清样品计算蛋白质微阵列的 Intro 测定和测定间重现性。在两种不同的阵列载玻片上分析的样品针对毒素 A、毒素 B、SLP001、SLP002、SLP027、来自毒素 B 的毒素 B 仅产生菌株 CCUG 和 pCDTb 抗原，显示出良好的重现性。
进行蛋白质微阵列检测针对艰难梭菌毒素的同种型特异性抗体反应。患者和健康个体的血清样本用于检测仅表达菌株的艰难梭菌毒素 B 中的毒素 A、毒素 B、毒素 B 的 IgG 和 IgA 水平，以及二元毒素 B 片段的前体形式。一旦掌握，这项技术可以在 7 小时内完成。
在运行样品之前，应评估质量控制实验、不同参数，例如选择合适的表面化学、打印缓冲液、封闭缓冲液以及血清样品和二抗的稀释度。打印高质量的阵列需要对阵列或软件有很好的了解，以便根据实验方案调整参数的打印。在整个实验过程中保持阵列仪的最佳性能和无尘环境至关重要。
这项技术将为免疫学和分子生物学领域的研究人员铺平道路，以表征对感染的体液免疫反应，以及发现血清诊断抗原。不要忘记，处理受感染的血液样本和细菌毒素可能是危险的。一般来说，在实验室中，在执行此程序时应始终考虑安全和标准预防措施。
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概述
本文描述了一种用于分析人类血清中对艰难梭菌抗原的体液免疫反应的蛋白质微阵列方法。该技术可以准确地定量多种同型和株特异性抗体反应。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 微生物学
- 临床研究
背景
- 艰难梭菌是感染的重要原因。
- 了解免疫反应对开发免疫疗法至关重要。
- 目前的方法缺乏同时分析多种抗体反应的能力。
- 本研究引入了一种微阵列方法来解决这一缺口。
研究目的
- 优化艰难梭菌感染的免疫疗法选择。
- 阐明人体对艰难梭菌的免疫反应。
- 实现患者特异性治疗方法。
使用的方法
- 准备一组7种纯化的艰难梭菌抗原。
- 微阵列印刷和设置。
- 同时定量抗体反应。
- 数据分析和结果解释。
主要结果
- 该方法可以详细分析免疫反应。
- 在定量多种同型抗体方面表现出准确性。
- 有助于理解患者特异性免疫特征。
- 视觉演示增强了技术的学习。
结论
- 这种方法是免疫学研究的有价值工具。
- 它可以帮助开发针对性免疫疗法。
- 未来的研究可能扩大其在临床环境中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Profiling multi-isotype and strain-specific antibody responses enables mechanistic de-risking of immunotherapies for Clostridium difficile infection. This protein microarray assay supports target validation by quantifying functional antibody profiles across patient cohorts and therapeutic preparations. The method enhances predictive confidence in selecting clinically relevant immunotherapies through simultaneous, high-throughput serological analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring antigen-specific IgG, IgA, and IgM responses across isotypes and subclasses.
- Operational Value: Supports biological de-risking through simultaneous quantification of strain-specific antibodies to toxins A and B, SLPs, and binary toxin precursors.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by correlating microarray results with toxin neutralization efficacy and ELISA data for antitoxin IgG levels.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing a 7-plex panel of purified C. difficile antigens for simultaneous detection.
- Reproducibility: Demonstrates intra- and inter-assay reproducibility using patient serum samples against multiple antigens, enabling reliable compound or immunotherapy evaluation.
- Scalability: Highlights platform reuse potential for profiling antibody responses in vaccinated or infected humans, supporting assay standardization across clinical sample types.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase immune profiling to preclinical validation by detecting significant differences in antibody levels between patient groups, commercial IVIg, and pre/post-therapy sera.
- Biomarker Alignment: Enables identification of serological correlates of protection through multi-isotype, strain-specific antibody profiling linked to functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing correlations between microarray signals and toxin neutralization, informing immunotherapy selection.
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from early immune profiling to lead identification, supporting hypothesis testing and biological de-risking prior to preclinical advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying multi-isotype antibody responses to C. difficile antigens, clarifying immune pathways involved in infection and therapy response.
- Screening: Describes assay readiness through standardized printing, blocking, and detection steps that yield quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Highlights measurable readouts such as fluorescence intensity and Spearman correlation with ELISA, enabling teams to compare antibody levels across conditions and samples.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by profiling antibody responses in sera from infected individuals and those receiving IVIg, informing biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Positions the microarray platform as a reusable capability for profiling humoral responses across diverse antigens, sample types, and therapeutic contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in immune-mediated protection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multi-antigen, multi-isotype antibody detection.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on serological profiling of functional antibody responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antigen purification, panel optimization, and microarray platform setup and maintenance.
- Dependent on specialized instrumentation including arrayer, laser scanner, and environmental controls for humidity and dust-free operation.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, blocking, washing, and detection protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending the panel to new antigens, sample matrices (e.g., plasma, supernatants), or clinical cohorts.
- Limited by the need for highly purified antigens and careful optimization of printing buffers, surface chemistry, and antibody dilutions to maintain array quality and signal integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Preparing a Microarray Plate and Printing with a Contact Robot
3:06
Array Probing
5:19
Array Scanning
6:36
Results: Validation of Protein Microarray to Detect Isotype Specific Antibody Response to Clostridium difficile Toxins and Its Reproducibility
8:01
Conclusion
