Name: 肿瘤微环境下免疫细胞种群的可视化、定量和映射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习可视化、定量和映射肿瘤组织中免疫细胞种群的方法。该技术整合成像与数字分析，用于识别组织免疫特征并预测免疫治疗反应，助力癌症生物学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢研究参与者。感谢HBP生物样本库协调员Louise Rousseau在组织样本及其所有相关临床信息收集方面提供的帮助，以及CRCHUM分子病理学和细胞成像核心设施和Visiopharm的Michael Persch在技术上的出色支持。经费来源：本研究获得了加拿大肝脏基金会、魁北克卫生研究基金会（FRQS）艾滋病与传染病网络（Réseau SIDA-MI）以及加拿大丙型肝炎网络（CanHepC）的资助。CanHepC由加拿大卫生研究院（CIHR）（NHC-142832）与加拿大公共卫生署联合倡议资助。M.F.M.获得了蒙特利尔大学、Gabriel Marquis奖学金以及FRQS的博士后奖学金。T.F.获得了CIHR和CanHepC的博士奖学金。S.T.现任蒙特利尔大学Roger-Des-Groseillers肝胆胰肿瘤外科讲席教授。
作者贡献：M.F.M. 设计并实施实验，以及分析数据。T.F. 设计实验。A.C-B. 提供技术指导。G.S. 完成本研究对象的全部病理学评估，并对研究中所有病理学相关方面提供意见。L.M. 完成H&amp;#38;E染色，优化并执行图像采集。M.N.A. 完成PSR染色，并提供宝贵的技术建议。N.B. 参与图像分析。S.T. 是HBP生物样本库的首席研究员，负责监督生物样本库的整体运行，同时对本项目的各个方面及其临床意义提供了极为宝贵的指导。M.F.M.、T.F. 和 N.H.S. 构思并设计了本研究。N.H.S. 监督研究工作并获得经费支持。M.F.M.、T.F.、A.C-B 和 N.H.S. 撰写论文。所有作者均审阅并批准了最终稿件。

从蒙特利尔大学医院中心（CHUM）肝胰胆肿瘤临床数据库与生物样本库（HBP 生物样本库）获取了三例经手术切除的乙型肝炎病毒（HBV）相关人肝细胞癌的连续FFPE切片。参与该组织库的患者均已签署知情同意书。本研究经机构伦理委员会批准（方案编号 09.237），并按照《赫尔辛基宣言》的规定进行。
1. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色方案
注意：苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色由蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）分子病理学核心设施使用Shandon多功能程序化全自动切片染色仪，并按照以下程序完成。
<ol>
	<li>脱蜡：将切片浸入二甲苯替代品中，每次2.5分钟，共3次。 
	警告：二甲苯替代品易燃，对皮肤有刺激性，吸入有害。</li>
	<li>复水：将切片浸入100%乙醇中，每次2.5分钟，共3次。用双蒸水（ddH2O）洗涤1分钟以完成复水。</li>
	<li>苏木精孵育1分钟。用ddH2O洗涤3次，每次1分钟。</li>
	<li>伊红孵育5秒。用95%乙醇洗涤30秒。用100%乙醇洗涤2次，每次1分钟。 
	警告：乙醇易燃，对眼睛有刺激性。伊红对眼睛有刺激性。</li>
	<li>脱水：将切片浸入二甲苯替代品中，每次1.5分钟，共3次。手动封片。 
	注：执行本部分操作预计耗时30分钟。</li>
</ol>
2. 用于FFPE切片的多重免疫荧光染色方案
注意：本方案改编自 Robertson 等人17。
<ol>
	<li>脱蜡与复水 
	注意：在对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行免疫组化（IHC）或多重免疫荧光（mIF）染色前，必须去除石蜡。若石蜡未充分去除，会导致染色效果不佳。
	<ol>
		<li>将4 μm厚的FFPE组织切片置于玻璃切片架中。在通风橱内，将切片浸入盛有37°C预热二甲苯的考普林瓶中，孵育10分钟。 
		注意：二甲苯易燃，对皮肤有刺激性，吸入有害。</li>
		<li>每2分钟手动振荡切片10秒，更换新鲜二甲苯后重复一次，再孵育5分钟。</li>
		<li>在化学通风橱中，依次将切片浸入以下溶液中各5分钟：1）二甲苯:乙醇（1:1 v/v）；2）100%乙醇；3）70%乙醇；4）50%乙醇；5）30%乙醇；6）磷酸盐缓冲液（PBS）。 
		注意：切片应始终保持在PBS中，直至进行抗原修复。脱蜡后的组织切片必须始终处于水合状态，干燥会导致非特异性抗体结合，从而产生高背景染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加热诱导抗原修复 
	注意：福尔马林固定可能导致抗原表位被掩盖，从而阻碍抗体结合及后续可视化。使用抗原修复缓冲液和相应处理步骤可部分恢复表位的天然构象，进而恢复抗体识别能力。抗原修复缓冲液的类型及处理时间应根据具体实验条件（如靶标、抗体、组织类型等）进行优化。
	<ol>
		<li>将脱蜡后的切片浸入盛有抗原修复液的考普林瓶中（配方见材料表）。</li>
		<li>将密封的考普林瓶放入电压力锅内的自来水中。水位不应超过瓶子高度的一半，以防止水与抗原修复液混合。</li>
		<li>关闭压力锅盖和压力阀，选择高压模式加热10分钟并启动。完成后拔掉电源，释放压力，打开锅盖，并将考普林瓶留在锅内静置30分钟，使切片自然冷却。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭非特异性结合位点
	<ol>
		<li>将载有切片的支架转移至盛有PBS的考普林瓶中，用PBS冲洗2次，每次5分钟，以去除残留的抗原修复液。</li>
		<li>用PAP笔在组织周围画圈，形成疏水屏障。将切片浸入含0.1 M甘氨酸的PBS溶液的考普林瓶中，在室温（RT）下孵育15分钟。 
		注意：甘氨酸可饱和抗原修复过程中产生的醛基，这些基团可能非特异性地结合一抗或二抗。</li>
		<li>用PBS洗涤2次，每次5分钟，以去除甘氨酸溶液。将切片放入湿盒中，加入足量封闭液覆盖所有组织区域，避免溢出疏水圈。在室温下孵育30分钟。 
		注意：封闭液配方见材料表。封闭液应含有蛋白质（如BSA）以阻断非特异性结合位点。也可加入Triton X-100或Tween 20等去垢剂，以减少抗体与组织之间的疏水相互作用，提高抗原识别的特异性。加入来源于组织来源物种的10%总血清可封闭Fc受体，从而减少非特异性抗体结合。最后，加入来源于二抗制备物种的10%血清，可最大限度减少二抗直接非特异性结合到组织切片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光标记
	<ol>
		<li>用PBS-Tween（0.1% v/v）洗涤2次，每次5分钟，然后将切片放回湿盒中。</li>
		<li>加入用封闭液重悬的一抗混合液，在4 °C下孵育过夜。本研究所使用的一抗和二抗列于材料表中。 
		注意：一抗混合液应包含来自不同物种的抗体，或来自同一物种但不同同种型的抗体。有关本研究中使用的一抗-二抗配对列表，请参见表2。所有抗体的详细信息见材料表和表2。</li>
		<li>用PBS-Tween（0.1% v/v）洗涤3次，每次5分钟，然后将切片放回湿盒中。在避光条件下加入二抗混合液，在室温下孵育1小时。 
		注意：当一抗来自不同物种时，应选择每种二抗仅特异性结合对应的一抗，而不与其他二抗交叉反应。通常可通过使用同一物种来源的二抗实现，前提是该物种与一抗来源物种不同。若一抗来自同一物种但具有不同同种型，则应使用同种型特异性的二抗。</li>
		<li>用PBS-Tween（0.1% v/v）洗涤3次，每次5分钟。再用&#160;ddH2O冲洗一次。吸去多余液体后，用含DAPI的封片剂封片。封片剂用量取决于组织大小，通常40 μL足以覆盖标准显微镜载玻片的表面。</li>
		<li>盖上盖玻片，轻轻挤压以排出多余封片剂，避免产生气泡。将切片在避光条件下于室温干燥20分钟，随后在4 °C保存，直至成像。</li>
		<li>使用全片扫描仪获取所有通道的图像（见材料表）。 
		注意：抗体通过人肝细胞癌组织作为阳性对照进行验证。针对每种一抗，制备三张连续切片，分别进行以下处理：仅加一抗、加同种型对照抗体、仅加封闭液，其余染色步骤保持一致。通过比较图像以确认染色的特异性。当一抗孵育切片中的信号呈现预期分布模式且明显区别于背景时，视为特异性染色。若一抗导致背景信号过高，或在同种型对照及无一抗对照切片中出现组织成分标记，则视为非特异性染色。完成本部分实验预计耗时2天。必需的对照包括：（1）同种型对照，用于评估一抗非特异性结合对背景信号的贡献。该对照切片的处理方式与其他样本相同，但使用与一抗同种型和来源相同、但靶向组织中不存在抗原的抗体；若无合适同种型对照抗体，可用与一抗相同来源物种的总IgG替代；（2）无一抗对照（即阴性对照），用于验证染色特异性，并评估二抗非特异性结合对背景信号的贡献。该对照切片处理方式与其他切片相同，但不添加一抗；（3）阳性对照，用于确认染色体系有效。该对照使用已知表达目标标志物的组织切片进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 苦味酸-天狼星红（PSR）/快绿染色方案
注意：本染色的目的是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片中可视化纤维状胶原蛋白I型和III型。本方案改编自Segnani等人的研究18。所有步骤均在通风橱中进行。
<ol>
	<li>对标本切片进行脱蜡和水化处理，步骤类似于FFPE组织切片的多重免疫荧光染色方案（第2.1节）。 
	注意：如果待染色切片此前已用于免疫荧光标记且石蜡已被去除，则脱蜡-水化步骤有助于去除封片剂。DAPI在此过程中不会被去除，但不会明显干扰PSR染色结果。</li>
	<li>将切片浸入含有苦味酸-天狼星红/快绿溶液的染色缸中（配方见材料表），室温孵育30分钟（超过30分钟会导致肝细胞核出现非特异性染色）。</li>
	<li>用ddH2O快速洗涤切片（5次浸洗），然后用100%乙醇快速洗涤（5次浸洗）。在二甲苯-100%乙醇（1:1 v/v）中洗涤30秒，再在二甲苯中洗涤30秒。在二甲苯完全蒸发前使用封片剂（见材料表）进行封片（有助于顺利封片）。 
	注意：执行本部分操作的预计时间为1小时。</li>
</ol>
4. 从组织切片中洗脱抗体
注意：为了在连续标记实验中重复使用组织切片，必须完全去除一抗和二抗。结合的抗体按先前所述方法去除13。
将水浴锅预热至 56 °C。将切片放入含有脱蜡缓冲液的容器中（配方见材料表），盖上盖子，并用石蜡膜密封，以防止振荡过程中泄漏。
<ol>
	<li>将玻璃罐放入水浴中，30 分钟孵育并持续振荡。</li>
	<li>在室温下用 ddH2O 洗涤 4 次，每次 15 分钟。用 PBS-Tween（0.1% v/v）冲洗。</li>
	<li>在准备使用第二轮一抗重新孵育切片之前，始终将切片保存在 PBS-Tween 或水中以保持其湿润。 
	注意：执行本部分方案的预计时间为 2 小时。</li>
	<li>验证抗体洗脱程序的效率。 
	注意：在将该方案用于连续标记实验中的抗体洗脱之前，应先验证一抗和二抗的去除效率。
	<ol>
		<li>按照石蜡包埋组织切片多重免疫荧光染色方案（第 2.1–2.4.6 节）所述，对一个切片使用特定的一抗-二抗组合进行染色并获取图像。</li>
		<li>图像采集完成后，按照第 4.1–4.3 节所述方法，对组织结合的一抗-二抗复合物进行洗脱处理。</li>
		<li>使用与步骤 2.4.3 相同的二抗及相同条件孵育切片。</li>
		<li>按照第 2.4.4–2.4.6 节所述进行洗涤、封片和图像采集。</li>
		<li>并排比较洗脱前后获取的图像，以确定特异性信号是否已消失。 
		注意：通过比较抗体去除前后的图像可验证洗脱程序的效率。然而，所有通道的背景信号升高以及 DAPI 扩散是正常现象。这限制了在同一组织切片上可执行的洗脱轮次，最多约为三轮。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 图像采集
<ol>
	<li>使用全切片扫描仪生成图像。</li>
	<li>使用20倍、0.75NA的物镜，分辨率为0.3225 μm/像素。</li>
</ol>
6. 图像分析
注意：此处所述方法针对当前示例。请参考表1及正文内容，以调整适用于其他特定样品。
<ol>
	<li>使用图像分析软件中的 Tissualign 模块（本方案中为 VIS，参见材料表）进行组织对齐。
	<ol>
		<li>打开图像分析软件，点击Tissuealign选项卡。</li>
		<li>通过进入文件 | 数据库，选择要对齐的第一幅图像，将其导入载玻片托盘中。返回到Tissuealign选项卡，点击载玻片托盘中的加载按钮以加载图像。图像将显示在载玻片托盘和工作区中。 
		注意：仅应将感兴趣的图像堆栈加载到载玻片托盘中。</li>
		<li>按对齐顺序对所有图像重复步骤 6.1.2，逐个加载。当所有感兴趣的图像均加载到载玻片托盘后，点击功能区中工作流程步骤的下一步按钮以链接图像。</li>
		<li>接下来，将第二幅图像拖放到第一幅图像之上。第一幅和第二幅图像现在已链接。以有序方式逐个对其他待对齐图像重复此步骤。第一幅图像的名称将发生变化，表明其已与其他图像链接。同时，已链接的图像将在载玻片托盘右侧的工作区中显示。</li>
		<li>此时，可通过自动对齐、半自动对齐或手动对齐方式对图像进行对齐。始终建议优先尝试自动对齐。如需自动对齐，请点击功能区中工作流程步骤（步骤 3）的下一步按钮。</li>
		<li>通过浏览组织的不同位置，并目视验证不同图像中对应结构在图像的两个维度上是否排列一致，来检查自动对齐结果。</li>
		<li>如果自动对齐结果不理想，可通过使用标记点（每幅图像至少使用三个标记点）指示已链接图像中的同源组织特征来优化对齐效果。在已链接图像的同源位置放置标记点后，用户有两种选择：半自动对齐或手动对齐。如需半自动对齐，请点击功能区中的自动对齐按钮；如需手动对齐，请点击功能区中的应用标记点按钮。</li>
		<li>当对齐结果满意后，点击工作流程步骤中的下一步按钮，并将合成图像保存至数据库。 
		注意：在所展示的分析中，对六张切片（涵盖 11 种标记物以及 H&amp;#38;E 和 PSR 图像）进行对齐耗时 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用用户自定义协议分析协议包 1（APP 1，表 1）进行组织检测。
	<ol>
		<li>点击功能区中的图像分析选项卡，打开软件的图像分析模块。</li>
		<li>通过进入文件 | 数据库，选择感兴趣的图像，然后返回图像分析选项卡，导入合成（已对齐）图像。</li>
		<li>点击打开 APP图标，打开 APP 选择对话框，并选择要使用的分析协议包（APP）。本例中选择APP 1用于组织检测。</li>
		<li>打开 APP 1 后，前往选定的组织位置并点击预览按钮，确认 APP 1 是否正常工作。若结果满意，则进入下一步。</li>
		<li>点击运行 APP 1，并使用所选 APP 处理图像。</li>
		<li>分析完成后，点击文件/导出导出数据（例如图像、测量值等）。 
		注意：APP 1 创建一个划定组织区域的兴趣区域（ROI）（ROI 组织），并计算组织面积。</li>
		<li>通过进入文件 | 保存，保存包含新创建 ROI 的修改后图像。 
		注意：在所述图像分析工作站中，使用 APP 1 检测组织并创建 ROI 耗时 5 分钟。所处理组织的面积为 3.2 cm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 APP 2（表 1）将组织分割为间质和实质。 
	注意：APP 2 作用于预定义的 ROI 组织。APP 2 将组织分割为间质 ROI 和实质 ROI。
	<ol>
		<li>点击功能区中的图像分析选项卡，打开图像分析模块。</li>
		<li>通过进入文件 | 数据库，选择在步骤 6.2.7 中保存的包含 ROI 组织的图像。返回图像分析选项卡，点击载玻片托盘中的加载按钮以加载图像。图像将显示在载玻片托盘和工作区中。</li>
		<li>使用 APP 选择对话框打开 APP 2，方法同 6.2.3。</li>
		<li>在选定视野中预览 APP 2 的处理结果。若结果满意，点击运行按钮对整幅图像执行 APP 2。APP 2 的输出结果为：ROI 组织被分割为间质和实质 ROI，并确定各自的面积。结果导出方式同 6.2.6。修改后图像的保存方式同 6.2.7。 
		注意：在所述分析工作站中，使用 APP 2 将组织分割为间质和实质耗时 4 小时。所处理组织的面积为 3.2 cm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用用户自定义协议 APP 3（表 1）识别并量化 FoxP3hiCD4+ 细胞。 
	注意：APP 3 作用于预定义的间质和实质 ROI。
	<ol>
		<li>打开图像分析模块，并按照 6.3.1 和 6.3.2 的方法导入包含间质和实质 ROI 的图像。使用 APP 选择对话框打开 APP 3，方法同 6.2.3。</li>
		<li>在 FoxP3hiCD4+ 细胞富集的选定视野中预览 APP 3 的处理结果。若结果满意，对整幅图像运行 APP 3。APP 3 的输出结果为：所有单个 FoxP3hiCD4+ 目标均被标记，并存储其组织坐标。将确定间质和实质 ROI 中 FoxP3hiCD4+ 目标的密度。结果导出方式同 6.2.6。</li>
		<li>对 FoxP3hiCD4+ 标记目标进行组织热图分析。
		<ol>
			<li>使用 APP 选择对话框打开用户自定义协议 FoxP3hiCD4+ MAP，方法同 6.2.3。 
			注意：FoxP3hiCD4+ MAP 利用 FoxP3hiCD4+ 标记目标的坐标生成密度热图。在所述图像分析工作站中，使用 APP 3 识别和计数 FoxP3hiCD4+ 标记目标耗时 25 分钟。所处理组织的面积为 3.2 cm2。</li>
			<li>点击运行按钮执行 FoxP3hiCD4+ MAP。点击文件 | 导出 | 工作区导出组织热图。 
			注意：在所述图像分析工作站中，使用 FoxP3hiCD4+ MAP 对 FoxP3hiCD4+ 标记目标进行热图映射耗时 5 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别使用用户自定义协议 APP 4、APP5、APP6、APP7 和 APP 8，按照第 6.4 至 6.4.3.2 节的方法，识别并量化 CD8+、CD68+、MPO+、αSMA 和 CD34+ 目标，在每种情况下加载相应的 APP（表 1）。 
	注意：APP 4 至 APP 8 作用于预定义的间质和实质 ROI。</li>
</ol>

<ol><li>Greten, F. R., Grivennikov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+Cancer%3ATriggers%2C+Mechanisms%2C+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences.</a> Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Binnewies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+tumor+immune+microenvironment+%28TIME%29+for+effective+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy.</a> Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%3A+an+official+journal+of+the+United+States+and+Canadian+Academy+of+Pathology%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).</li>
<li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+intratumoral+immune+cells+reveal+the+immune+landscape+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+introduction+of+the+%27Immunoscore%27+in+the+classification+of+malignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours.</a> The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).</li>
<li>Finotello, F., Eduati, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Omics+Profiling+of+the+Tumor+Microenvironment%3A+Paving+the+Way+to+Precision+Immuno-Oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology.</a> Frontiers in Oncology. 8, 430(2018).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-cytometry%3A+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Giesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+tumor+tissues+with+subcellular+resolution+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry.</a> Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).</li>
<li>Porta Siegel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging+and+Integration+with+Other+Imaging+Modalities+for+Greater+Molecular+Understanding+of+Biological+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology+%3A+MIB%3A+the+official+publication+of+the+Academy+of+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging and Integration with Other Imaging Modalities for Greater Molecular Understanding of Biological Tissues.</a> Molecular Imaging and Biology : MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 20 (6), 888-901 (2018).</li>
<li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging%3A+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elution+of+High-affinity+%28%3E10-9+KD%29+Antibodies+from+Tissue+Sections%3A+Clues+to+the+Molecular+Mechanism+and+Use+in+Sequential+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Elution of High-affinity (>10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).</li>
<li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunoenzyme+staining%3A+methods+and+visualizations+for+the+observation+with+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labeling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9, 13(2008).</li>
<li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Detection+of+Collagen+Fibers+by+Sirius+Red%2FFast+Green+Is+More+Sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+Alone+in+Normal+and+Inflamed+Rat+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon.</a> PloS One. 10 (12), 0144630(2015).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

为了描绘癌症及其他免疫相关疾病中的免疫图谱，亟需简单、易获取且易于实施的多重检测技术，以实现组织切片中免疫细胞的空间分辨。本文介绍了一种整合了广泛可用的标记和数字分析技术的策略，以扩展成像检测的多重检测能力和多维评估能力12,13,17,19。通过对三张连续组织切片进行不同标志物的染色，并利用剥离与重新探针技术重复使用切片，我们实现了除H&amp;#38;E和PSR染色外共11个参数的可视化。来自这些切片的六幅图像通过组织对齐模块实现了自动对齐。对于来自同一张切片的图像，其对齐精度达到单细胞水平；对于来自相邻切片的图像，其对齐结果也高度一致。虚拟多重检测技术使我们能够确定在一个切片中可视化的标志物与在相邻连续切片中可视化的其他标志物之间的空间关系。部分染色标记了关注细胞（COIs），而另一些则标记了组织区域（TCs），从而可量化不同组织区域中的关注细胞。利用软件工具对关注细胞进行自动化定量，极大简化并加速了图像处理流程。此外，数字分析应用于整张组织切片而非选定的视野区域，从而实现了肿瘤微环境（TME）的无偏表征。同时，由于关注细胞的组织坐标已被记录，因此可生成组织热图。
本方案中有多个环节可能需要进行问题排查。首先，抗原修复效果不佳会影响多重免疫荧光（mIF）的染色质量，因此应针对所使用的特定检测方法或生物标志物条件，优化抗原修复缓冲液的类型及修复时间。其次，封闭溶液的选择应根据组织类型、抗原特性以及一抗和二抗的物种来源进行调整。在我们的实验中，加入来源于组织来源物种的10%总血清可有效阻断Fc受体，从而减少非特异性抗体结合；而加入二抗来源物种的10%血清则可最大限度地减少二抗与组织切片之间的直接非特异性结合。第三，必须使用适当的阳性和阴性对照来验证一抗和二抗的特异性。第四，某些荧光通道中自发荧光增强，以及在去除一抗过程中DAPI发生扩散，也是常见问题。为应对自发荧光增强的情况，我们选用的抗体组合需确保特异性信号强度至少为背景信号的5倍以上。最后，某些高亲和力抗体无法通过常规剥离程序有效去除。在此情况下，建议将此类抗体用于最后一轮标记。用户可能需要尝试不同的染色顺序，以确定目标抗体的最佳组合方案。在进行第二轮或第三轮标记之前，必须确认抗体剥离的效率。
该策略的主要局限性和挑战在于为感兴趣的标志物找到合适的初级和次级荧光抗体组合。由于商业可获得性的限制，很难找到由不同物种产生或具有不同同种型、可同时使用的初级抗体。大多数全切片扫描仪配备的光源和滤光片仅支持最多五个通道的成像，而针对特定物种并带有合适荧光染料的次级抗体并不总是可获得。我们通过连续染色和顺序标记的方法部分克服了这些限制。可能需要测试多种抗体组合，才能确定针对目标标志物的最佳组合。另一个局限性在于DAPI染色的质量，因为去染和重新探针处理并不总能实现细胞核的有效分割。
组织对齐模块对用户几乎无需培训，且不要求具备编程技能。该软件理论上可对无限数量的图像进行对齐。然而，精确对齐依赖于切片之间的相关性，组织学上越接近且越一致的相邻切片，其对齐精度越高。我们使用 VIS 的 Author 模块来生成 APPs。创建 APPs 需要具备基本的图像分析知识，但这与使用其他任何图像分析软件时的要求相同。与其它图像分析软件相比，VIS 的独特优势包括能够自动对采用不同方法制备的切片图像进行对齐（例如，IF、组织化学、IHC），从而可通过虚拟多重化实现多种目标标记物的共定位研究。此外，APPs 具有灵活且用户友好的设计，支持针对特定用户需求进行定制。自动定量分析与图谱生成，以及可处理整张组织切片的能力，相比通过肉眼观察进行人工计数，可节省时间并减少偏差。
该策略作为癌症和自身免疫背景下组织免疫学研究的一种工具非常有用，但尚未经过临床应用的验证。通过进一步的标准化和验证，未来可将其用于多种应用场景（例如，绘制癌症中的免疫图谱，以预测和监测对免疫治疗药物的反应）。该方法也可适用于不同的炎症性疾病（例如，炎症性肠病），将病理学评估与预后生物标志物相结合。
本方案中的主要关键步骤包括标记的效率/特异性以及所设计的APP针对预期用途或生物标志物的稳健性。因此，在设计新的APP后，尤其需要通过目视检查进行常规验证。在同一组织切片上高效地进行多轮 stripping 和重新探针检测，或使用不同类型的染色方法，是关键环节，且可能因组织或切片而异。在开展大规模批次分析之前，验证这些流程的有效性至关重要。
综上所述，我们提供了一种策略，可最大限度地获取来自珍贵临床组织样本的定量和空间信息。实施该方法所需的资源、设备和知识均广泛可及。我们建议将此方法作为规划检测方案的有用指南，以期在肿瘤微环境（TME）中识别、定量并绘制免疫细胞群体的分布图谱。

癌症的发生是恶性细胞与肿瘤微环境（TME）之间发生多步骤、相互作用的结果。除了肿瘤细胞外，TME 还包含非恶性细胞、基质细胞、免疫细胞群体以及细胞外基质（ECM）1。肿瘤组织中不同细胞和结构成分的空间分布，以及癌细胞与邻近非癌细胞之间的动态交流，最终调控着肿瘤的进展及对治疗的反应2,3,4。研究表明，癌症中的免疫反应受到时空上的精确调控5,6。浸润至肿瘤病变及其周围组织的不同免疫细胞群体表现出独特的空间分布模式，以及不同的活化和分化状态，这些状态与其功能（例如促肿瘤或抗肿瘤）密切相关。这些不同的免疫细胞群体及其特征会随着时间与肿瘤和基质区域共同演化。
能够进行单细胞多组学分析的技术出现后，我们对调控癌变及肿瘤进展的众多细胞和分子网络的理解呈指数级增长。然而，大多数基于单细胞的高通量分析工具需要对组织进行破坏和单细胞分离，导致细胞空间组织结构及细胞间相互作用的信息丢失7。由于特定免疫细胞在肿瘤微环境（TME）中的位置和排列具有诊断和预后价值，能够实现空间分辨的技术成为基于单细胞免疫分析技术不可或缺的补充。
传统上，免疫组织化学（IHC）和多重免疫荧光（mIF）等成像技术仅限于同时可视化少量生物标志物。这一限制阻碍了对肿瘤浸润性免疫细胞时空动态的研究，而这类细胞通常由多种表型标志物共同定义。近年来，成像和分析工具的进步拓展了多重检测的可能性。基于抗体的新标记技术，如组织细胞计量学（histo-cytometry）和成像质谱流式技术（imaging mass cytometry），已分别实现对多达12种和32种生物标志物的空间分辨8,9。质谱成像技术无需标记，具有在单个组织切片中同时检测数千种生物标志物的潜力10,11。尽管这些技术已在解析肿瘤组织免疫微环境方面展现出巨大潜力，但其依赖高度复杂且昂贵的设备与软件，大多数研究人员难以获得。
此外，通过使用连续成像、多轮连续标记以及光谱成像技术，传统免疫组化（IHC）和多重免疫荧光（mIF）的多重检测能力得到了扩展7,12,13,14,15,16。这些技术可从相同或连续的组织切片中生成多幅图像，并可通过图像分析软件整合为虚拟的多参数切片。因此，能够同时可视化和分析的标志物数量显著增加。
本文提出了一种利用市售试剂、经济型显微镜设备和用户友好型软件进行组织多重检测合理设计的策略（图1）。该方法结合了连续成像、顺序多重标记、全组织成像和组织对齐技术，生成可用于组织切片中免疫细胞自动定量与定位的虚拟多参数切片。利用该策略，我们构建了一个包含11种生物标志物以及两种常用组织学染色——苏木精-伊红染色（H&amp;#38;E）和天狼星红染色（PSR）的虚拟切片。通过组织热图解析，可在不同组织区域中识别、定位并定量多种免疫细胞群体。该策略最大限度地提高了从有限临床样本中获取的信息量，适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的存档组织样本，包括全组织、穿刺活检组织和组织微阵列。我们建议将该方法作为在肿瘤微环境（TME）中设计用于免疫细胞群体识别、定量和定位的定制化检测方案的实用指南。

<table><tbody><tr><td>抗原修复液：柠檬酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% v/v Tween 20，pH 6.0）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>封闭液：1% BSA，10% 过滤人血清，10% 过滤驴血清，0.1% Tween 20 和 0.3% Triton 溶于 PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Multicell</td><td>800-095-EG</td><td></td></tr><tr><td>Coplin 染色缸（EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM）</td><td>Newcomersupply</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545E 22*50</td><td></td></tr><tr><td>直接红 80（Direct Red 80）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr><tr><td>驴血清（Donkey Serum）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电压力锅</td><td>Salton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>伊红（Eosin）</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801600</td><td>警告：引起眼部刺激</td></tr><tr><td>快绿 FCF（Fast Green FCF）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td>警告：吸入、摄入或经皮肤吸收有害</td></tr><tr><td>石蜡包埋组织切片（4&amp;mu;m）载玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 中含 0.1 M 甘氨酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏木精染色液，Gil 1. 配方，常规浓度</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3535-32</td><td></td></tr><tr><td>染色缸架（EasyDip Staining Jar Holder）</td><td>Newcomersupply</td><td>5300RK</td><td></td></tr><tr><td>人血清（Human Serum）</td><td>Gemini</td><td>22210</td><td></td></tr><tr><td>湿盒（Humidity chamber）</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z670138-1EA</td><td></td></tr><tr><td>免疫组化笔（Pap pen）</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-Tween 20（0.1% v/v）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permount 封片介质（Permount Mounting Media）</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>1.3% 苦味酸（Picric Acid）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6744</td><td>警告：引起皮肤和眼部刺激</td></tr><tr><td>苦味酸-天狼星红/快绿染液：0.1% w/v 快绿 + 0.2% w/v 天狼星红溶于 1.3% 苦味酸溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一抗：抗-&amp;alpha;SMA 抗体</td><td>小鼠 IgG2a 1A4</td><td>Sigma A2547</td><td>稀释比例 1/100</td></tr><tr><td>一抗：抗-CD34 抗体</td><td>小鼠 IgG1 HPCA1/763</td><td>Novus Biologicals NBP2-44568</td><td>稀释比例 1/250</td></tr><tr><td>一抗：抗-细胞角蛋白 8/18 抗体</td><td>兔 EP17/EP30</td><td>Agilent IR09461-2</td><td>即用型</td></tr><tr><td>一抗：抗-CD68 抗体</td><td>小鼠 KP1</td><td>Abcam ab955</td><td>稀释比例 1/200</td></tr><tr><td>一抗：抗-结蛋白（Desmin）抗体</td><td>兔多克隆</td><td>Invitrogen PA5-16705</td><td>稀释比例 1/200</td></tr><tr><td>一抗：抗-CD4 抗体</td><td>小鼠 N1UG0</td><td>Affymetrix 14-2444</td><td>稀释比例 1/250</td></tr><tr><td>一抗：抗-FoxP3 抗体</td><td>兔 1054C</td><td>R &amp; D MAB8214</td><td>稀释比例 1/100</td></tr><tr><td>一抗：抗-MPO 抗体</td><td>山羊多克隆</td><td>R &amp; D Systems AF3667</td><td>稀释比例 1/250</td></tr><tr><td>一抗：抗-CD3 抗体</td><td>兔 SP7</td><td>Abcam ab16669</td><td>稀释比例 1/200</td></tr><tr><td>一抗：抗-CD8 抗体</td><td>小鼠 C8/144B</td><td>Invitrogen 14-0085-80</td><td>稀释比例 1/200</td></tr><tr><td>二抗：驴抗小鼠 A488</td><td>多克隆</td><td>Invitrogen A-21202</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>二抗：驴抗兔 A488</td><td>多克隆</td><td>Invitrogen A-21206</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>二抗：驴抗山羊 A568</td><td>多克隆</td><td>Invitrogen A-11057</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>二抗：驴抗兔 A647</td><td>多克隆</td><td>Invitrogen A-31573</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>二抗：大鼠抗小鼠 IgG1 A647</td><td>RMG1-1</td><td>Biolegend 406618</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>二抗：山羊抗小鼠 IgG2a CF568</td><td>多克隆</td><td>Sigma Aldrich SAB4600315</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>二抗：驴抗小鼠 DyLight 755</td><td>多克隆</td><td>Invitrogen SA5-10171</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>二抗：驴抗兔 DyLight 755</td><td>多克隆</td><td>Invitrogen SA5-10043</td><td>稀释比例 1/500</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioShop</td><td>SDS001,500</td><td>警告：口服、皮肤和眼部毒性</td></tr><tr><td>Shandon 多程序自动化玻片染色仪</td><td>LabX</td><td>11384903</td><td></td></tr><tr><td>Shandon 二甲苯替代液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CA89413-336</td><td>警告：易燃，引起皮肤和眼部刺激，吸入有害</td></tr><tr><td>摇床水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 SlowFade Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>1545801</td><td>警告：引起眼部刺激</td></tr><tr><td>脱抗体缓冲液：将 20 ml 10% w/v SDS 与 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）和 67.5 ml 超纯水混合。在通风橱内加入 800 μL 2-巯基乙醇（终浓度为 114.4 mM）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BioShop</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>VIS 软件</td><td>Visiopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>全片扫描仪 Olympus BX61VS</td><td>Olympus</td><td></td><td>显微镜：Olympus Slide Scanner BX61VS，5 片扫描仪，电动载物台，自动对焦。相机：光源：Xcite-120。滤光片：BrightLine&amp;reg; Sedat 滤光片组（# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000，Semrock）</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736-4L</td><td>警告：易燃，引起皮肤和眼部刺激，吸入有害</td></tr><tr><td>二甲苯：乙醇溶液（1:1 v/v）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>警告：摄入、吸入有害，经皮肤吸收可致死。引起眼部刺激。需在通风橱中使用</td></tr></tbody></table>

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

肿瘤微环境（TME）的免疫格局是决定癌症进展及治疗反应的关键因素。特别是TME中免疫细胞的密度和空间定位具有重要的诊断和预后价值。TME的多组学分析极大地加深了我们对调控肿瘤发生与进展的多种细胞和分子网络的理解。然而，这些技术无法提供有关细胞空间分布或细胞间相互作用的信息。目前亟需经济、易获取且操作简便的多重检测技术，以实现组织切片中免疫细胞的空间分辨，从而补充基于单细胞的高通量技术。本文介绍了一种整合连续成像、顺序标记和图像配准的策略，用于生成全组织切片的虚拟多参数图像。随后，通过用户自定义的分析流程对虚拟切片进行自动化分析，从而实现目标细胞群体的识别、定量和空间定位。本研究中采用Tissuealign、Author和HISTOmap分析模块完成图像分析。我们展示了一个成功将该策略应用于临床样本的实例，最大限度地从有限的组织样本中获取信息，并全面、无偏倚地呈现整个组织切片中TME的特征。

本文介绍一种简单且易于实施的策略，用于对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片中的免疫细胞进行可视化、定量和定位分析。该方法结合了现有的成像技术和数字分析手段，旨在拓展成像检测的多重检测能力和多参数分析水平。

肿瘤微环境（TME）的免疫格局是决定癌症进展及治疗反应的关键因素。具体而言，密度……

肿瘤微环境中免疫细胞的空间分布具有临床价值。该策略可轻松用于可视化、定量和绘制肿瘤组织内免疫细胞的分布图。免疫治疗已彻底改变了癌症治疗方式。然而，并非所有患者都能产生良好应答。该策略可用于定义能够预测良好抗肿瘤反应的组织-免疫特征。在开展实验之前，应在对照组织上测试抗体组合及 stripping 技术，并验证 APPs 在检测目标标志物时的准确性。由于图像分析方法的文字描述通常使用复杂的术语，将文字与视频相结合有助于更好地理解并复制该方法。对于福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织切片的抗原修复，需将脱蜡后的组织样本浸入盛有抗原修复液的Coplin瓶中，并将该瓶置于装有自来水的电压力锅内。水位不应超过瓶子高度的一半，以防止水与抗原修复液混合。关闭压力锅的盖子和压力阀，对切片进行高压处理10分钟。处理结束后，拔掉电源，释放压力，然后打开盖子。切片在压力锅中冷却30分钟后，将样本转移至新的考普兰染色缸中，用新鲜的PBS溶液洗涤两次，每次五分钟。随后使用疏水笔在每张组织切片周围画出隔离屏障。接下来，将切片浸入含0.1摩尔甘氨酸的PBS溶液中，室温孵育15分钟，然后按所示方法用PBS冲洗切片两次。第二次洗涤后，将切片转移至湿盒中，并用封闭液覆盖每张组织切片。室温孵育30分钟后，用新鲜的PBS-Tween溶液冲洗切片两次，每次5分钟，随后在避光条件下向每张切片加入用封闭液稀释的特异性一抗。孵育结束后，用新鲜的PBS-Tween溶液将切片冲洗三次，每次五分钟，然后在室温下用相应的二抗孵育切片一小时。孵育结束后，再次用新鲜的PBS-Tween溶液将切片冲洗三次，每次五分钟，随后用双蒸水冲洗一次。吸去每张切片上的多余水分，使用含DAPI的封片剂和盖玻片对组织进行封片。挤去多余的封片剂后，将切片置于室温避光条件下干燥20分钟，然后使用全片扫描仪采集所有通道的图像。扫描完成后，在图像分析软件中打开图像，点击Tissuealign标签页。要将待对齐的图像导入到幻灯片托盘中，请从数据库中选择第一张待对齐的图像。当所有图像加载完成后，单击工作流程步骤中的“下一步”以链接图像，并将所有待对齐的图像拖放至第一张图像上。当所有图像均已正确链接后，每张图像至少使用三个标记点，指示链接图像中的同源组织特征。使用针来追踪第一幅图像，以检查所得配准的质量。如果已获得满意的配准效果，单击“下一步”以查看图像层并将合成图像保存到数据库中。要使用用户自定义的协议 APP 1 进行组织检测，请打开“图像分析”选项卡，并在图像分析模块中打开合成图像。点击“打开应用程序”图标，并选择合适的应用程序。为确认应用程序正常工作，请导航至选定的组织位置并点击“预览”。如果结果令人满意，请点击以使用选定的应用程序处理图像。在处理过程中，应用程序将判断像素是否与组织相关，从而将所有与组织相关的像素转换为感兴趣区域。新创建的感兴趣区域可被转移至任意一幅已配准的图像中。分析结束后，单击“文件”并选择“保存”，以保存包含新创建感兴趣区域的修改后图像。为了将组织分割为间质和实质，打开图像分析选项卡，并从数据库中选择感兴趣的文件。打开APP 2，APP 2利用PSR染色图像进行组织分割。通过在选定的视野中处理图像来预览APP 2。如果结果满意，单击“运行”以在整幅图像上处理 APP 2。组织的兴趣区域将被分割为间质和实质，并确定各自的面积。新创建的间质和实质兴趣区域可转移至配准后的图像，然后按演示方法导出并保存修改后的图像。为了识别并定量目标细胞群体，将目标分割图像导入图像分析模块。调整颜色后，打开 APP 3。APP 3 将在实质和间质中检测目标细胞群体并对其进行定量。如果结果满意，则在整张图像上运行 APP 3。所有目标单个细胞将被标记，其组织坐标将被保存，并确定间质和实质区域中目标细胞的密度。随后可按照演示方法保存修改后的图像。为了对标记的目标细胞进行组织热图分析，请在APP选择窗口中打开相应的用户自定义协议，然后点击“运行”，以提示APP利用抗体标记目标的坐标生成热图。热点区域以红色突出显示，表示目标细胞群体密度最高，而深蓝色区域则表示密度最低。特定细胞群体的热图可叠加到配准后的图像上，以提供有关这些细胞在肿瘤微环境中的空间分布情况的额外信息。然后导出并保存组织热图。必须验证标记的特异性、所设计的APPs的准确性，以及在同一组织切片上不同染色的剥离和重新探针检测效率。通过整合连续成像、顺序标记和组织对齐，可以在有限的临床样本中同时可视化更多标志物，并提取更丰富的信息。对切除的肿瘤组织切片进行苏木精和伊红（H&E）染色，可评估组织结构、细胞形态以及临床相关参数，如恶性肿瘤类型、肿瘤分级和整体免疫细胞浸润情况。CD34染色可用于检测内皮细胞。细胞角蛋白8/18染色可显示上皮细胞的存在，而抗α-平滑肌肌动蛋白染色则可用于鉴定成纤维性活化的肝星状细胞。使用抗 CD68 和抗结蛋白（Desmin）抗体进行复染，可分别检测巨噬细胞和肌成纤维细胞。为了更全面地表征肿瘤免疫浸润情况，可进行T细胞标记物和髓过氧化物酶的染色。此外，还可进行天狼星红（Picro Sirius Red）染色以显示纤维状胶原，有助于间质与实质的分割。通过识别染色切片中与组织相关的像素，可实现对特定感兴趣区域内不同区室的分割。随后可在每个区域内识别出目标细胞群体，从而生成组织图谱，其中特定细胞群体密度较高的区域以热点显示，密度相对较低的区域则以冷点显示。这种用于在组织样本中识别、定量和定位免疫细胞的方法可根据具体的研究问题和目标标志物进行调整和验证。该策略可应用于组织微阵列，以进行高通量分析。也可与原位杂交结合，同时检测原位蛋白质和基因表达。我们已采用该策略在肝纤维化患者肝组织中原位鉴定并定位产生IL-17A的细胞。如实验方案所述，多种试剂具有化学危险性，相关操作应在化学通风橱中进行，并使用适当的个人防护装备和采取必要的预防措施。

visualization-quantification-mapping-immune-cell-populations-tumor

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

肿瘤微环境下免疫细胞种群的可视化、定量和映射

本视频演示了一种 原位 利用荧光多光谱成像技术分析肿瘤组织中不同亚群的浸润性T细胞。将肾细胞癌组织冷冻切片用抗体处理，标记表达特定抑制性受体并呈现免疫治疗耐受表型的CD8+ T细胞。通过多光谱显微镜观察标记后的切片，以鉴定不同的CD8+...

多重免疫荧光成像分析对免疫治疗耐药的T细胞亚群

通过使用转基因报告小鼠和可注射的荧光标记物，长期活体旋转盘共聚焦显微镜技术能够直接观察ApcMin/+...

使用旋转盘共聚焦显微镜对 ApcMin/+ 小肠肿瘤中髓系细胞动态的实时成像

本方案描述了一种在小鼠肿瘤模型中对肿瘤微环境内白细胞亚群进行详细评估的方法。将表达chemerin的B16黑色素瘤细胞皮下植入同源小鼠体内。随后对来自肿瘤微环境的细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析，从而实现对白细胞亚群的详细分析。...

皮下肿瘤模型中肿瘤浸润白细胞亚群的评估

研究肿瘤微环境可能发现用于预测免疫治疗临床反应的预后或预测性生物标志物。本文介绍了一种基于 原位 荧光多光谱成像用于自动分析和计数CD8的不同亚群+...

多重免疫荧光分析与肿瘤内 PD-1+ Tim-3+ CD8+ T 细胞的定量

本文介绍一种分离和富集已建立的皮下肿瘤中肿瘤免疫及非免疫微环境组分的方法。该技术可分别分析肿瘤免疫浸润细胞和非免疫肿瘤组分，从而实现对肿瘤免疫微环境的全面表征。...

在已建立的小鼠皮下肿瘤中富集与表征肿瘤免疫及非免疫微环境

本文通过分子与信息学实验方案，描述了利用基于RNA的方法对实体瘤组织进行定量免疫谱分析，并借助临床队列开展肿瘤免疫学生物标志物发现的研究策略。...

实体瘤的预测性免疫建模

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代，癌症生物学需要新型的体外和计算工具，以在适当的时空背景下研究肿瘤-免疫界面。本文介绍了在二维和三维条件下利用肿瘤-免疫微流控共培养的实验方案，可兼容对细胞功能进行动态、多参数的监测。...

用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。...

利用质谱成像技术分析福尔马林固定石蜡包埋组织样本以拓展对肿瘤微环境的理解

本文介绍了一种手动酪胺信号放大（TSA）多重免疫荧光（mIF）染色结合图像分析与空间分析的实验方案。该方案可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，每张切片可检测两至六种抗原，具体数量取决于实验室所配备的切片扫描仪。...

多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床与生物学评估

本方案详细描述了如何利用多重免疫组织化学对肿瘤微环境中的免疫细胞进行表征。...

肿瘤微环境中空间免疫细胞格局的多重免疫组织化学分析

学习可视化、定量和映射肿瘤组织中免疫细胞种群的方法。该技术整合成像与数字分析，用于识别组织免疫特征并预测免疫治疗反应，助力癌症生物学研究。

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

探索更多视频