小型化聚糖微阵列测定评定A型流感病毒血凝素的亲和力和特异性
2016年5月29日
使用打印的聚糖微阵列策略，将常规的 96 孔板检测小型化，用于分析甲型流感病毒血凝素亲和力和对含唾液酸受体的特异性。
这种小型化聚糖阵列的总体目标是分析甲型流感病毒血凝素的特异性和亲和力。该检测有助于回答有关甲型流感病毒受体结合和亲和力的关键问题。该技术的主要优点是，在一次检测中，我们可以解决特异性和相对结合亲和力问题，这通常在典型的聚糖阵列和基于板的检测中无法实现。
该方案从糖基样品的制备开始。游离寡糖的碱溶液是打印缓冲液储备液，制备后，应缓慢滴定至 pH 值 8.5，然后添加表面活性剂。使用制备好的打印缓冲液，将 PAA 偶联的游离寡糖稀释至 100 μg/mL。
然后，在打印缓冲液中将一价糖基稀释至 100 微摩尔。最后，在一微摩尔处制备胺官能化染料的工作储备液。现在将每种游离寡糖样品 10 μL 上样到 384 孔微量滴定板的孔中。
这足以打印五张幻灯片的解决方案。还将 10 微升染料标记物转移到印版的一个孔中。首先根据布局定位阵列器引脚和打印头，准备打印阵列。
在这种情况下，一个 pin 可以打印所有样本。聚糖阵列以 6 个为一组打印，四周都有一个空点。戴上手套来处理载玻片。
打开包装，用超高纯度氮气吹掉表面的碎屑。接下来，将载玻片涂层面朝上放置在阵列载物台上。然后，对 arrayer 进行编程。
在这种情况下，每次访问源板编程 27 个点。放置在聚-L-赖氨酸涂层载玻片的非阵列区域上的三个预点用于去除针尖的多余液体。每次引脚访问的其他 24 个点用于将 6 个点放置在 4 个重复阵列中。
文本协议中提供了详细信息。现在，将多孔板加载到打印机中并开始打印阵列。打印时，确保湿度保持在 55% 到 65% 之间注意聚-L-赖氨酸涂层载玻片上预斑的外观。
打印后，目视检查每张载玻片。检查特氟龙边界内斑点的正确对齐，这很重要，并检查斑点特征的数量是否正确。为了帮助使点的附着均匀化，请在制作完成后立即将打印的载玻片放入 100% 湿度的试验箱中，打印面朝上。
使用湿纸巾在容器和临时架子上铺上衬里。用塑料包裹腔室以锁住水分。半小时后，取出载玻片。
然后，用耐溶剂记号笔对载玻片进行编号，并将它们存放在干燥箱中过夜。第二天，准备新鲜的封闭缓冲液储备液，并剧烈搅拌。使用浓氢氧化钠调节 pH 值 9.2。
然后，将玻片在缓冲液中孵育一小时。要去除块，请用双蒸水冲洗载玻片。然后，将玻片转移到玻璃染色支架上，并将支架装入摆动板支架中，以 10 G 离心玻片干燥 5 分钟。
干燥后，如果需要，将玻片存放在零下 20 摄氏度的密封塑料袋中。准备时，像以前一样制作另一个加湿室。为了检测固定化的游离寡糖，在探测缓冲液中以 10 μg/mL 的浓度制备 SNA 和 ECA 生物素化凝集素，并在每个稀释液中加入每毫升 2 μg 链霉亲和素 555。
为了用血凝素染色，按照文本方案中的描述，在封闭缓冲液中以 4 比 2 比 1 的摩尔比制备每毫升 20 微克的复合前抗体溶液。将 20 微升制备的溶液转移到 384 孔板的孔中。接下来，在适当的缓冲液中连续稀释凝集素和血凝素
稀释 8 次，在每个孔中填充 10 微升样品和 10 微升缓冲液。现在，将板在冰上孵育 30 分钟。现在将每种稀释液的 8 μL 添加到打印载玻片上的 48 个微孔之一中。
然后，将准备好的玻片在加湿室中孵育 90 分钟。90 分钟后，从边缘握住玻片清洗玻片;将其浸入 PBS-T 中四次，然后浸入 PBS 中四次，最后浸入去离子水中四次。现在，像以前一样甩干载玻片。
甩干后，立即扫描载玻片。请务必小心地将载玻片以正确的方向装入扫描仪。使用 5 毫瓦的低激光功率迭代扫描载玻片，逐渐将增益从 25% 增加到 75%在优化扫描设置的同时，请记住，荧光团会随着重复扫描而漂白。
使用相关软件分析保存的图像中的结合信号。可以加载具有 spotting pattern 的数组列表。将其覆盖在扫描上，以帮助导航网格标记的位置。
然后，使用该软件分析光斑强度并将结果保存为制表符分隔的文本文件，以导出到电子表格或其他统计包中。通过计算平均信号强度减去背景来分析数据。每个样品取 6 个重复点中的 4 个平均值，省略最高信号和最低信号。
然后，生成平均平均信号减去 8 种蛋白质浓度的背景的折线图。使用非线性回归对结果线进行平滑处理。PAA 芯片用于评估甲型流感病毒血凝素的受体结合特异性。
该阵列包括相同微孔中的非唾液酸化对照。使用对印刷化合物具有已知特异性的植物凝集素作为阳性对照。与末端半乳糖 β 1-4 结合的 ECA 凝集素与anacetylglucosamine相连，如果末端半乳糖被唾液酸封端，则不与同一化合物结合。
为了测试 α 2-6 连接的唾液酸，使用了 SNA 凝集素。正如预期的那样，SNA 仅与 α 2-6 连接的唾液酸结合，但对 PAA 连接染料与非 PAA 连接染料 lacNAc 重复序列的亲和力存在显著差异。接下来，测试了源自 越南/1203/04 病毒的 H5 血凝素，该病毒仅识别 α 2-3 连接的唾液酸。
H5 血凝素的结合谱显示出预期的特异性，对 PAA 连接结构具有更高的亲和力。最后，检测了来自人类季节性 H1N1 菌株的 H1 血凝素。正如预期的那样，这种血凝素仅与 α 2-6 连接的含唾液酸的结构结合。
一旦掌握，该技术就可以在一次检测中揭示流感病毒的结合特异性和相对亲和力。该技术将大大提高流感结合测定的效率，并减少珍贵生物制品的消耗。
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概述
本研究介绍了一种微型糖蛋白阵列，旨在分析流感A病毒血凝素的特异性和亲和力。该方法允许同时评估受体结合和亲和力，这通常在标准检测中是无法实现的。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 糖生物学
- 检测开发
背景
- 流感A病毒血凝素在受体结合中起着关键作用。
- 了解受体特异性对疫苗开发至关重要。
- 传统检测通常缺乏同时测量亲和力和特异性的能力。
- 检测的微型化可以提高通量并降低试剂成本。
研究目的
- 开发用于流感A病毒分析的微型糖蛋白阵列。
- 评估血凝素对唾液酸受体的亲和力和特异性。
- 提高糖蛋白阵列检测的效率。
所用方法
- 使用库存印刷缓冲液准备糖蛋白样品。
- 将印刷缓冲液滴定至pH 8.5。
- 将PAA-结合的糖蛋白稀释至每毫升100微克。
- 使用96孔板格式进行检测。
主要结果
- 微型检测成功测量了血凝素亲和力。
- 有效分析了含唾液酸的受体特异性。
- 结果表明与传统方法相比效率提高。
- 该技术允许在单一检测中进行全面分析。
结论
- 微型糖蛋白阵列是流感研究的宝贵工具。
- 这种方法可以促进对受体相互作用的更好理解。
- 未来的应用可能会增强疫苗开发策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
This miniaturized glycan microarray enables simultaneous assessment of influenza A virus hemagglutinin specificity and avidity, addressing a critical gap in receptor-binding analysis. By reducing reagent consumption and increasing throughput, the assay supports early-stage antiviral and vaccine development with improved predictive confidence. The format allows for efficient screening of hemagglutinin variants across sialic acid linkages, informing target validation and lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates hemagglutinin binding to α2-3 and α2-6 sialic acid receptors to clarify receptor specificity and host range potential.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of PAA-linked and non-PAA-linked glycans to assess avidity differences within a single assay.
- Scientific Value: Uses plant lectins (SNA, ECA) as positive controls to validate array functionality and ensure reliable readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports serial dilution of hemagglutinins across eight concentrations to generate binding curves for avidity estimation.
- Operational Value: Miniaturized format prints 48 arrays per slide, equivalent to 18 conventional 96-well plates, significantly reducing sample and reagent use.
- Scientific Value: Allows simultaneous testing of six glycan-binding proteins at eight dilutions across six different glycans, including non-sialylated controls.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Assesses binding profiles of hemagglutinins from avian (H5) and human seasonal (H1N1) strains to evaluate receptor adaptation trends.
- Operational Value: Enables rapid comparison of binding specificity and relative avidity between viral strains to inform preclinical risk assessment.
- Scientific Value: Includes non-sialylated controls in each microwell to distinguish specific from nonspecific binding, improving data interpretability.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from early target validation to lead identification, providing quantitative binding data that supports go/no-go decisions in influenza therapeutic and vaccine programs.
- Discovery Biology: Tests hemagglutinin-receptor interactions to clarify mechanistic basis of viral entry and host specificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence readouts after blocking, incubation, washing, and scanning steps.
- Analytics: Generates signal intensity data averaged from replicate spots, enabling nonlinear regression and avidity modeling.
- Translational Research: Links in vitro binding data to phenotypic outcomes such as receptor adaptation and cross-species transmission potential.
- Enterprise Reuse: The printed slide format allows for storage, batch processing, and reuse across multiple hemagglutinin screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides dual readouts of specificity and avidity, reducing mechanistic ambiguity in hemagglutinin-receptor interactions.
- Operational Value: Standardizes glycan presentation via PAA conjugation and controlled printing, enhancing assay reproducibility.
- Strategic Value: Accelerates screening timelines and reduces costs, improving capital efficiency in early influenza research.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of hemagglutinin targets based on receptor binding profiles and avidity metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in glycan chemistry, microarray printing, and fluorescence detection.
- Dependent on arrayer precision, humidity control (55–65% during printing), and proper slide handling to ensure spot integrity.
- Necessitates standardized blocking, probing, and washing protocols to minimize background and ensure specific signal detection.
- Requires calibration of scanning settings (low laser power, incremental gain) to avoid fluorophore bleaching while maximizing sensitivity.
- Limited to soluble glycan-binding proteins; not suitable for intact virions or membrane-bound complexes without adaptation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Glycan Preparation and Plate Setup
1:56
Printing the Arrays
3:49
Humidifying, Numbering, and Blocking the Arrays
5:10
Analyzing Glycan Binding Proteins
6:55
Slide Scanning and Analysis
8:21
Results: Polyacrylamide (PAA) Array Specificity and Discrimination
10:00
Conclusion
