Name: 小型化聚糖微阵列测定评定A型流感病毒血凝素的亲和力和特异性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 了解利用小型化聚糖微阵列同时测定A型流感病毒血凝素与唾液酸受体结合的亲和力和特异性。该方法可在单一实验中高效评估受体结合特性，有助于疫苗研发。

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本工作部分得到了斯克里普斯微阵列核心设施以及美国疾病控制中心（J.C.P.）合同的支持。RPdV 获得了荷兰科学研究组织（NWO）Rubicon 和 VENI 基金的资助。由 NIGMS 基金 GM62116（J.C.P.）资助的功能糖组学联盟（http://www.functionalglycomics.org/）提供了本研究中使用的多种糖链。本文为斯克里普斯研究所第 29113 号出版物。

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。&#160;
1. 芯片构建
<ol>
	<li>聚糖制备与板设置
	<ol>
		<li>制备打印缓冲液储备液。首先配制500 ml的150 mM二碱式磷酸钠储备溶液，同时配制50 ml的150 mM单碱式磷酸钠储备溶液。将二碱式磷酸钠溶液置于烧瓶中，使用磁力搅拌子和pH计，缓慢滴加单碱式磷酸钠溶液，直至pH达到8.5。然后加入Tween-20至终浓度0.005%。</li>
		<li>准备聚糖样品。将PAA偶联的聚糖（diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA)、3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) 和6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA)（图1A））用步骤1.1.1中的打印缓冲液稀释至100 µg/ml。单价聚糖diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-(CH2)3NH2)、3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-(CH2)3NH2) 和6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-(CH2)3NH2) 用步骤1.1.1中的打印缓冲液稀释至100 µM。最后，准备氨基功能化染料，用于作为网格标记/着陆指示点。染料标记点以1 µM浓度打印。 
		注意：本实验中使用Atto488-NHS染料。但任何可被芯片扫描仪读取的氨基功能化染料均适用于此目的。</li>
		<li>将每种聚糖样品各10 µl转移至384孔微孔板中，用于打印机器人。未使用的聚糖样品应保存在密封管中，置于打印缓冲液中，-20 °C保存。将10 µl染料标记物转移至打印板中。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打印 
	注意：所有涉及接触或移动玻片的步骤均需佩戴手套操作。
	<ol>
		<li>根据正确的布局配置，将点样针安装到打印头中。本布局使用一根针打印所有样品和阵列。以每组六个点的方式打印聚糖，在每侧跳过一个特征点（特征点定义为某种化合物的单个点），确保相同样品的点不直接相邻打印。 
		注意：最终用户需自行决定具体配置。&#160;</li>
		<li>从包装袋中取出玻片，打开盒子，并用超高纯度氮气吹扫每张玻片表面，去除灰尘颗粒或微小塑料碎片。将所需数量的玻片（涂层面向上）放置于点样仪载物台上。</li>
		<li>编程点样仪，设置每次访问源板时打印27个点，使用3个&#34;预点样&#34;步骤，在聚-L-赖氨酸涂层玻片上清除点样针尖端多余的液体。
		<ol>
			<li>打开MPU（主电源单元）和气候控制单元。在计算机上启动Tiling Analysis软件。</li>
			<li>选择要打印的布局。选择“选项”→“用于打印阵列的针具”，选择1×1打印工具——单根针。选择“目标”标签页→“工具阵列定义”→“打印模式”，输入间距（点与点之间的距离）、行数和列数以容纳待打印样品，并设定样品的打印模式（本阵列采用8×8打印模式，间距为340 µm，共7个样品）。</li>
			<li>选择“目标”→“玻片布局”，设置块间距离，以便将每个重复阵列打印至48孔（4×12）玻片模板中。选择“源”并添加源取样次数（使用单针时每个样品取样1次）（本次打印将使用7次源取样，以容纳6个样品孔和1个染料标记孔）。 
			注意：源对话框应变为绿色，表示源访问次数与打印模式中的样品数量匹配。</li>
			<li>选择“目标”→“适配板与玻片布局”，调整玻片数量（本次打印每次同时打印5张玻片，并包含1张预点样玻片）。</li>
			<li>点击T1按钮释放托盘，激活托盘后将所需数量的玻片放入托盘中，特别注意预点样玻片（蓝色）和&#34;实际&#34;玻片的位置。</li>
			<li>在其余所有真空口上放置普通玻璃片以阻断真空，点击“确定”启动真空。检查所有玻片是否固定到位，点击“确定”将托盘返回原位。</li>
			<li>将打印板装入板架中，确保支架正确就位。点击“开始”，启动打印过程。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在每个阵列中以每阵列6个点的形式重复打印剩余的24个点（每次源访问打印4个阵列）。</li>
		<li>将384孔板装入打印机并开始打印。在整个打印过程中维持相对湿度在55%至65%之间。打印机在完成5张玻片打印后停止。&#160; 
		注意：尽管本实验中的微阵列采用特定的8×8打印模式，但不同的微阵列打印机器人需要设备专用的编程设置以实现所需布局。最终用户应根据其设备的技术规格确定最合适的打印模式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加湿/固定化 
	注意：玻片打印完成后，需进行临时固定步骤，也称为加湿处理。打印后的加湿有助于通过重新润湿点样区域使样品附着均匀，并确保完全封闭。
	<ol>
		<li>打印完成后立即将玻片放入100%湿度的加湿室中，持续30分钟。可通过在大玻璃皿底部平铺非常湿润的纸巾，将玻片（打印面向上）置于试管架等支架上，并用塑料膜密封以锁住湿气来构建加湿室。</li>
		<li>使用耐酒精/溶剂的标记笔对玻片编号，并存放在干燥盒中。室温下干燥过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>编号、封闭与储存
	<ol>
		<li>配制封闭缓冲液——50 mM乙醇胺溶于50 mM硼酸盐缓冲液中。首先，在含磁力搅拌子的烧瓶中，将硼酸溶于ddH2O中，终浓度为50 mM。在搅拌板上剧烈搅拌，直至所有固体完全溶解。在持续搅拌下，从16.54 M的乙醇胺储备液中加入适量乙醇胺，使终浓度达到50 mM。加入浓氢氧化钠调节pH至9.2。</li>
		<li>将打印好的玻片浸入封闭缓冲液中，孵育1小时。</li>
		<li>1小时后，用ddH2O冲洗玻片，去除残留的封闭缓冲液。将废弃的封闭缓冲液倒入适当的废液容器中。</li>
		<li>将玻片转移至玻璃染色架中并离心干燥。将玻片放入配备摆动板架的离心机中，以10 × g转速离心5分钟进行干燥。</li>
		<li>玻片干燥后，可立即进行孵育或储存。储存条件为-20 °C，置于密封塑料袋中。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分析糖结合蛋白
<ol>
	<li>准备一个可加湿的杂交孵育室，确保待杂交的芯片能够放入其中。一个简单的孵育室可由一个Pyrex培养皿构成，底部铺有浸湿的纸巾，并放置一个支架，用于承载玻片。</li>
	<li>使用生物素标记的凝集素SNA（Sambuca nigra 凝集素）和ECA（Erythrina cristagalli 凝集素）在探针缓冲液（PBS + 0.01% Tween-20）中，浓度为 10 μg/ml，同时加入 2 µg/ml 的链霉亲和素-555 染料。对于 HA（本示例中为 A/Vietnam/1203/04 H5N1 和 A/KY/07 H1N1），起始浓度使用 20 μg/ml 预复合物，具体方法如前所述 34简而言之，用封闭缓冲液（PBS + 3% BSA + 0.01% Tween-20）配制HA:Mouse-α-Strep:Goat-α-Mouse-Alexa647混合物，摩尔比为4:2:1。 
	注意：使用凝集素探针对芯片进行检测，以确认糖链已被固定并可被检测到（图1B).</li>
	<li>将20 µl凝集素-抗体混合溶液转移至384孔板中，置于冰上孵育30分钟。用相应的缓冲液对凝集素和HA样品进行连续8次1:1梯度稀释，每次将10 µl样品与10 µl缓冲液混合。</li>
	<li>将8 µl样品加入微孔表面，置于密封的湿化（100% RH）孵育室内，孵育90分钟。</li>
	<li>一次取一张载玻片，捏住边缘，先在 PBS 与 0.05% Tween 的混合液中浸洗四次，再在 PBS 中浸洗四次，最后在去离子 H₂O 中浸洗四次2O. 采用封闭步骤中所述的相同干燥程序，在离心机中以10 × g离心5分钟，将芯片干燥。</li>
</ol>
3. 扫描与数据分析 
注意：糖芯片的扫描参数可根据芯片扫描仪制造商的不同而有所调整。通过调节激光功率和分辨率，仪器可在其动态范围内获得尽可能多的信号图像（图1C）。
<ol>
	<li>使用荧光玻片扫描仪，在糖结合蛋白孵育后立即扫描芯片。注意确保玻片正确插入扫描仪中。
	<ol>
		<li>打开扫描软件。点击“开始”以启动程序。连接至扫描仪：扫描仪 → 连接，或扫描仪导航面板菜单中的绿色按钮。</li>
		<li>打开扫描仪的自动进样器门。按照特定顺序将载玻片放入自动进样器的插槽中。关闭自动进样器门。单击 &#34;读取加载器&#34; 在工具导航面板中，使用自动检测功能识别扫描仪中的载玻片。</li>
		<li>设置扫描参数：扫描仪 → 根据实验需求选择适当的扫描参数例如 635 激光功率调至高，检测增益设为 50%。扫描载玻片：选择“Scanner → scan”。在开始扫描前，先创建文件夹以保存扫描图像，并为每个扫描文件命名。每张载玻片均需重复此操作。点击“OK”开始扫描。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用扫描仪软件设置仪器并扫描载玻片。将扫描仪设置为以低激光功率（5 mW）进行逐步扫描，增益设置依次为25%、50%和75%。 &#160; 
	注意：可以对设置进行测试和优化，但需注意每次扫描都可能因光漂白而导致染料的荧光信号减弱。
	<ol>
		<li>开源数据采集与分析软件，例如 Mapix 软件。单击“开始”以启动程序。打开扫描图像：文件 → 打开图像。打开 GAL 文件：分析 → 打开网格，并选择相应的 GAL 文件。</li>
		<li>进入区块模式：图像 → 区块模式，以移动网格。使用网格标记将网格调整至载玻片上的相应位置。根据需要调整各个区块，使其与打印的阵列对齐。</li>
		<li>进入点模式：图像 → 点模式，以调整方块内各个点的位置和大小。待所有方块和点均调整到位后，通过分析 → 光度计算测量信号强度。保存输出文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描完成后，使用已安装的图像处理程序对图像进行结合信号分析。图 1D-G)。进行图像分析时，将 GAL（基因阵列列表）文件加载到扫描的 TIFF 图像上。 
	注意：GAL 文件包含点阵布局模式以及每个点位的身份信息。阵列的 GAL 文件由打印机软件使用制表符分隔的文本文件生成，该文件包含样品的身份信息及其在 384 孔源板中的位置。</li>
	<li>使用微阵列上印制的网格标记/定位灯来正确放置GAL网格。个别点可能需要单独移动，但打印良好的阵列通常可轻松完成网格内各区块的定位。完成网格定位后，通过软件采集各点的信号强度，并保存为制表符分隔的文本文件（.txt）。 &#160;
	<ol>
		<li>使用电子表格程序打开扫描仪输出的文件。从文件夹位置打开相应的宏文件。点击“视图”→“宏”→“运行宏”。 &#160; 
		注意：预设程序将复制原始输出数据，删除不必要的行和列，按样本对数据进行排序，计算平均信号值减去背景值，并将结果绘制成图表，显示在电子表格工作表中，包含芯片上检测的六个样本中每个样本的图形。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

评估流感病毒（IAV）受体特异性是分析禽类病毒大流行潜力的重要步骤。病毒对唾液酸的识别与其多种生物学特性相关，例如与细胞的结合及从细胞释放的过程。明确禽类病毒获得结合α2-6受体能力并跨越物种屏障所需的关键氨基酸突变，有助于大流行的预防与准备。目前有多种检测方法用于确定受体特异性，但这些方法均存在局限性，例如仅能测量结合强度（avidity）而无法准确反映特异性 反之亦然.
本文介绍了一种基于广泛应用且公认的ELISA技术的新型微型化工具，该工具使用与聚丙烯酰胺（PAA）连接的复杂糖链的末端片段。通过使用4种明确的凝集素——其中2种来源于植物，2种来源于甲型流感病毒——我们证明了该方法能够保持特异性和相对亲和力。
当我们将ELISA微型化至糖阵列芯片上时，计算所减少的化学品和生物试剂用量，会得到显著巨大的差异。首先，对于生物试剂：我们使用的检测体积减少了10倍，并在6个重复中使用6种测试化合物，这相当于96孔板中的36行。结果是，我们使用的生物试剂减少了360倍。关键步骤包括正确的打印操作，以及使用未纯化的糖...

野生水禽是甲型流感病毒（IAV）的天然宿主，但IAV能够跨越物种屏障感染家禽和哺乳动物，包括人类。禽类IAV识别α2-3连接的唾液酸（禽型受体），而人类病毒则结合α2-6连接的唾液酸（人类型受体）。为了能够在人类之间高效复制和传播，禽类IAV需要结合人类型受体1。
根据血清学特征，甲型流感病毒（IAVs）被划分为不同亚型，这些特征主要针对其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）两种包膜糖蛋白的抗原性。HA 能够结合唾液酸，而 NA 则在病毒生命周期的另一端发挥受体破坏酶的作用，可切割唾液酸2。所有感染人类的病毒，包括 H1N1、H2N2 和 H3N2，均起源于禽类3。在过去二十年中，已发生多起禽类病毒向人类传播的事件，其中以 H5N1、H7N7 和 H7N9 最为知名；然而，其他亚型也偶有感染人类的报道（如 H6N1、H7N1、H7N2、H9N2、H10N7、H10N8）4。幸运的是，目前尚无证据表明这些病毒能够完全适应人类类型的 α2-6 连接唾液酸受体5-8。若禽类或其他人畜共患病毒获得在人类宿主中有效复制和传播的能力，将对人类健康造成灾难性影响。因此，提前了解这些病毒如何进化以结合人类类型受体，将有助于全球对新发流感病毒的监测。
受体偏好的测定最初是利用不同物种的红细胞进行的，至今仍是流感研究人员常用的检测方法9-12。禽类病毒识别α2-3连接唾液酸、人类病毒识别α2-6连接唾液酸的发现，最初基于使用经酶法改造、分别含有这两种连接方式的红细胞进行血凝试验13,14。尽管该方法的读数为血凝现象——这是病毒学家的标准检测手段——但其所依赖的糖链结构并未完全明确，仅限于末端连接方式的鉴定。此外，用于重新唾液酸化细胞的唾液酸转移酶来源有限，也限制了该方法的应用15-18。随后，研究人员开发了其他测定受体结合偏好的方法，例如在基于微孔板的实验中，将唾液酸化的糖链结构连接至聚丙烯酰胺（PAA）或聚谷氨酸（PGA）载体上进行检测19,20。该类方法可通过将糖链或病毒包被于微量滴定板上形成多种变体，每种均能建立稳定、可靠且高度敏感的ELISA型检测体系21-23。此外，也可使用生物素标记的糖链替代PAA/PGA，并将其偶联至链霉亲和素包被的微孔板上2,24。尽管某些检测可能需要特定抗血清，但ELISA技术已属常规，且多种连接PAA的糖链已可通过商业或非商业渠道获得（功能糖组学联盟（http://www.functionalglycomics.org））。
聚糖微阵列技术已成为确定受体特异性的宝贵工具，该技术通过点样多种不同的聚糖，可在单次实验中评估与多种不同结构的结合能力25-29。流感病毒（IAV）与这些结构的结合有助于更深入理解IAV优先识别的聚糖结构30-33。聚糖微阵列进行结合实验所需的样品体积较小，且每点所用聚糖量极微（2 nl）。然而，这些阵列通常仅用于评估聚糖受体的特异性。由于所需载玻片数量较多，对多种病毒或血凝素蛋白在多个浓度范围内的分析可能受到限制。此外，迄今为止，尚未开发出基于聚糖阵列技术的相对亲和力检测方法。
为了结合聚糖微阵列技术所需的低样品量优势以及PAA标记聚糖在基于ELISA的检测中的高灵敏度，我们致力于开发一种多孔聚糖微阵列，以实现与传统基于ELISA的检测方法相比具有相似甚至更高分辨率的高通量分析。同时，我们希望尽量减少生物样品和报告分子试剂的消耗。最终成果是一种微型亲和力检测方法，专为监测流感病毒（IAV）特异性而设计，同样适用于评估其他聚糖结合蛋白。该方法采用经聚四氟乙烯（Teflon）掩膜将玻璃载片分割为48个微孔的结构，每个微孔内点样6种不同的聚糖，每种重复6次。该微阵列平台所呈现的受体结合趋势与传统的宏观ELISA方法一致，但具备多项优势：（I）仅需微量样品即可实现每种化合物六次重复点样，而传统方法需在微孔板中包被多行，每孔消耗100 µl；（II）单个微孔内可同时分析多种不同化合物，并包含对照；（III）孵育体积大幅减少；（IV）采用荧光信号读出，动态范围更宽。单张载片的检测通量相当于18块96孔板。
采用以下方案，任何具备制备和分析点阵微阵列能力的实验室均可制备这种微型化的ELISA格式。

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&amp;reg; Slide H MPX-48&amp;nbsp;</td><td>Schott</td><td>1091525</td><td>微孔载玻片</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>已停产</td><td>共聚焦微阵列扫描仪</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL 扫描仪/Mapix 软件</td><td>Innopsys</td><td>-</td><td>共聚焦微阵列扫描仪</td></tr><tr><td>MicroGrid II&amp;nbsp;</td><td>Digilab</td><td>-</td><td>微阵列点样仪</td></tr><tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&amp;nbsp;</td><td>植物凝集素</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&amp;nbsp;</td><td>植物凝集素</td></tr><tr><td>Anti-Strep 抗体</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&amp;nbsp;</td><td>HA 结合用抗体</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>HA 结合用抗体</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&amp;nbsp;</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td>点样缓冲液组分</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>229903&amp;nbsp;</td><td>点样缓冲液组分</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Sigma</td><td>P8920&amp;nbsp;</td><td>点样前处理载玻片组分</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>点样前处理载玻片组分</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>493546</td><td>点样前处理载玻片组分</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>孵育/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>SMP4B 点样针</td><td>Telechem</td><td>SMP4B</td><td>点样针</td></tr><tr><td>压缩氮气（5级）</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>通用吹扫/干燥工具</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>载玻片封闭试剂</td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>载玻片封闭试剂</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>芯片上的网格标记物</td></tr><tr><td>PAA-LNLN</td><td>功能糖组学联盟</td><td>PA368</td><td>点样的糖类</td></tr><tr><td>PAA-3SLNLN</td><td>功能糖组学联盟</td><td>PA362</td><td>点样的糖类</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>功能糖组学联盟</td><td>PA343</td><td>点样的糖类</td></tr><tr><td>LNLN</td><td>功能糖组学联盟</td><td>Te98</td><td>点样的糖类</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>功能糖组学联盟</td><td>Te175</td><td>点样的糖类</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>功能糖组学联盟</td><td>Te176</td><td>点样的糖类</td></tr><tr><td>384孔微孔板</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>点样板</td></tr><tr><td>VWR 实验室标记笔</td><td>VWR</td><td>52877-150</td><td>载玻片编号</td></tr><tr><td>Wheaton 载玻片染色缸</td><td>Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>封闭与干燥</td></tr></tbody></table>

一种用于评估甲型流感病毒血凝素亲和力与特异性的微型化聚糖微阵列检测方法

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

甲型流感病毒（IAV）的血凝素通过识别细胞表面的唾液酸作为功能性受体，从而进入细胞。野生水禽是IAV的天然宿主，但IAV可跨越物种屏障感染家禽、猪、马和人类。禽类病毒识别通过α2-3糖苷键连接至倒数第二个半乳糖的唾液酸（禽型受体），而人类病毒则优先识别具有α2-6糖苷键的唾液酸（人型受体）。为了监测禽类病毒是否正在适应人型受体，可采用多种方法。目前越来越多地使用包含多样化合成唾液酸寡糖库的糖芯片技术来评估受体特异性。然而，该技术不能用于测量结合强度（avidity）。结合强度的测定通常是通过检测系列稀释的血凝素或病毒与吸附在传统聚丙烯96孔板上的糖链之间的结合来实现。在此类实验中，含有α2-3或α2-6唾液酸的糖链可被偶联至生物素并吸附到链霉亲和素包被的孔板上，或偶联至聚丙烯酰胺（PAA）后直接吸附于塑料表面。我们已对该方法进行了显著微型化改进，将PAA偶联的唾液酸寡糖及其非PAA偶联的对应物直接打印在微孔玻璃载片上。这种设置可在单张载片上容纳48个阵列，能够同时对6种糖链结合蛋白在8个稀释度下检测其与6种不同糖链的结合情况，其中包括两个非唾液酸化的对照。其通量相当于传统96孔板法的18块板。糖芯片格式显著减少了化合物和生物试剂的消耗，从而大幅提高了实验效率。

打印、扫描与数据分析
为确保正确打印，必须使点样网格在聚四氟乙烯（Teflon）掩膜内的位置准确对齐，该掩膜用于界定芯片上每个微阵列的区域。在打印过程中，由于聚四氟乙烯涂层的特性，点样后的信号在MPX芯片上无法通过肉眼直接观察。因此需重点关注预先点样在聚-L-赖氨酸（poly-L-Lysine）包被芯片上的预点样外观。打印完成后，应立即肉眼检查每张芯片，确认每个点样化合物的存在，其可见性源于缓冲液中的盐分在点样处干燥后形成的残留物。同时需检查微阵列中各点样位点是否位于聚四氟乙烯边界的正确位置，并确认点样特征的数量是否正确。
载玻片采用从低到高扫描功率的逐级扫描方式，以避免光漂白，并实现对高亲和力与低亲和力结合蛋白的比较，二者在输出信号上分别表现为较强和较弱的荧光强度。扫描完成后，使用成像软件测量输出图像中每个点的荧光强度。每个芯片均...

采用打印的聚糖微阵列策略，将传统的96孔板检测方法微型化，用于分析甲型流感病毒血凝素对含唾液酸受体的结合强度和特异性。

甲型流感病毒（IAV）的血凝素通过识别细胞表面的唾液酸作为功能性受体，从而进入细胞。野生水禽是……

该微型糖芯片的总体目标是分析甲型流感病毒血凝素的特异性和结合强度。该检测方法有助于解答有关甲型流感病毒受体结合特性及结合强度的关键问题。该技术的主要优势在于，单次实验即可同时评估结合特异性及相对结合强度，而这一点通常无法在传统的糖芯片或基于微孔板的检测中实现。本方案首先进行糖链样品的制备。糖链的基础溶液为储存用点样缓冲液，配制后应缓慢滴定至 pH 8.5，并加入表面活性剂。使用配制好的点样缓冲液，将PAA偶联的糖链稀释至每毫升100微克。然后，用点样缓冲液将单价糖链稀释至100微摩尔。最后，将胺基功能化的染料配制成1微摩尔的工作液。现在，将每种糖链样品各10微升加入384孔微孔板的孔中。这些溶液足以打印五张载玻片。同时，将十微升染料标记物转移至打印板的一个孔中。准备打印微阵列时，首先根据布局调整阵列点样针和打印头的位置。在此情况下，一个点样针即可打印所有样品。糖链阵列以六个为一组进行打印，每组周围各留一个空白位点。操作载玻片时需戴上手套。用超高纯度氮气吹扫其表面，去除任何残留物。接着，将有涂层的一面朝上放置在点样仪载台上。然后，对点样仪进行编程。本案例中，每次接触源板时，程序会生成27个点样位点。在聚-L-赖氨酸包被的载玻片的非阵列区域预先放置3个点，用于去除针尖多余的液体。每次针头接触的其余24个点，则用于在四个重复阵列中各放置6个点。具体细节请参见文本方案。现在将多孔板装入打印机，并开始打印阵列。打印过程中，确保湿度保持在55%至65%之间。注意观察聚-L-赖氨酸包被载玻片上预点样的外观。打印完成后，目视检查每张载玻片。检查点样区域在聚四氟乙烯（Teflon）边框内的位置是否对齐，这一点至关重要；同时检查点样特征的数量是否正确。为了促进点样斑点的均匀附着，载玻片打印完成后应立即正面朝上放入100%湿度的孵育 chamber 中。使用湿润的纸巾铺在容器和临时支架上。用塑料膜包裹孵育室以保持湿度。半小时后，取出载玻片。然后，使用耐溶剂标记笔对载玻片进行编号，并将其置于干燥箱中过夜。次日，通过剧烈搅拌配制新鲜的封闭缓冲液。使用浓氢氧化钠将pH值调节至9.2。然后，将切片在缓冲液中孵育1小时。为去除封闭液，用双蒸水冲洗切片。接着，将切片转移至玻璃染色架中，并将染色架放入摆动式板架内，以10 G的离心力旋转5分钟使切片干燥。干燥后，如需保存，请将载玻片置于密封的塑料袋中，并在零下20摄氏度条件下储存。准备过程中，按前述方法再制备一个湿化室。为检测固定化的糖链，用探针缓冲液将SNA和ECA生物素化凝集素配制成每毫升含10微克的溶液，并在每种稀释液中加入每毫升2微克的链霉亲和素555。使用血凝素染色时，按照文本方案中所述的4:2:1摩尔比，用封闭缓冲液配制每毫升含20微克的预复合抗体溶液。将20微升配制好的溶液转移至384孔板的孔中。接着，用相应的缓冲液对凝集素和血凝素进行1:1的系列稀释。进行八次稀释，每个孔中加入10微升样品和10微升缓冲液。然后将酶标板置于冰上孵育30分钟。接着将每种稀释液各取8微升，分别加入打印好的载玻片上的48个微孔之一中。然后，将制备好的载玻片放入湿化 chamber 中孵育 90 分钟。90 分钟后，从载玻片边缘持握进行洗涤；将其在 PBS-T 中浸洗 4 次，再在 PBS 中浸洗 4 次，最后在去离子水中浸洗 4 次。接着，像之前一样进行甩干。离心干燥后，立即扫描载玻片。务必以正确的方向小心地将载玻片放入扫描仪中。使用5毫瓦的低激光功率对载玻片进行逐次扫描，并逐步将增益从25%提高至75%。在优化扫描参数时需注意，反复扫描会导致荧光染料发生漂白。使用相关软件分析保存的图像中的结合信号。可加载包含点样模式的阵列列表，并将其叠加到扫描图像上，以辅助定位网格标记的位置。然后，使用软件分析斑点强度，并将结果保存为制表符分隔的文本文件，以便导入电子表格或其他统计软件包。通过计算平均信号强度减去背景值来分析数据。对每个样本的六个重复斑点取其中四个的平均值，排除信号最高和最低的两个斑点。然后，绘制平均信号强度减去背景值后对八种蛋白浓度的折线图。使用非线性回归法对所得折线进行平滑处理。PAA阵列用于评估甲型流感病毒血凝素的受体结合特异性。该芯片在同一微孔中包含了非唾液酸化的对照。使用已知对打印化合物具有特异性的植物凝集素作为阳性对照。ECA凝集素可结合末端半乳糖β-1-4连接的N-乙酰氨基葡萄糖，但如果末端半乳糖被唾液酸封闭，则不与相同化合物结合。为了检测α2-6连接的唾液酸，使用了SNA凝集素。正如预期，SNA仅结合α2-6连接的唾液酸，但对PAA连接与非PAA连接的染料标记lacNAc重复单元表现出显著的亲和力差异。接下来，测试了一种来源于越南/1203/04病毒的H5血凝素，该血凝素仅识别α2-3连接的唾液酸。H5血凝素的结合谱显示了预期的特异性，对PAA连接的结构具有更高的亲和力。最后，测试了一株人季节性H1N1毒株的H1血凝素。正如预期，该血凝素仅与含有α2-6连接唾液酸的结构结合。一旦掌握，该技术可在单次实验中揭示流感病毒的结合特异性及相对亲和力。该技术将显著提高流感病毒结合实验的效率，同时减少珍贵生物试剂的消耗。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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使用流感抗原微阵列测量血清抗体对不同病毒亚型的广度

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