Name: 流感血凝素特异抗体诱导的 Fc 介导效应函数的一种评估方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: 了解评估流感血凝素特异性抗体诱导Fc介导效应功能的方法。本方案使用人胚肾293细胞转染技术，可在24小时内完成抗体依赖性细胞介导的细胞毒性检测，为疫苗开发和免疫学研究提供高效工具。

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本项目部分资金来自美国卫生与公共服务部、美国国立卫生研究院、国家过敏与传染病研究所的联邦基金，合同编号为CEIRS P01AI097092-04S1（P.E.L.）。

本手稿中进行的实验均遵循西奈山医学院的机构伦理准则和规定。
1. 通过转染或感染表达流感病毒血凝素
转染：
<ol>
	<li>将人胚胎肾（HEK 293T）细胞以每孔 2 × 104 个细胞的密度接种于经组织培养处理的白色 96 孔板中，并在 37 °C 培养箱（含 5% CO2）中静置 4 小时。</li>
	<li>每孔加入编码病毒血凝素的 100 ng DNA 和 0.2 μL 转染试剂，总体积为 50 μL，对细胞进行转染。 
	注意：质粒和转染试剂均用 1×&#160;Opti-最低必需培养基（MEM）减血清培养基稀释。</li>
	<li>将培养板在 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育 18 小时后，移除转染培养基。</li>
</ol>
2. 感染
<ol>
	<li>将 A549 细胞或 Madin Darby 犬肾细胞以每孔 2 × 104 个细胞的密度接种于经组织培养处理的白色 96 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养至少 18 小时。</li>
	<li>用 1x&#160;MEM 稀释病毒，并在 37 °C、5% CO2 的培养箱中以感染复数（MOI）为 3、1 或 0.33 的条件感染细胞 1 小时。总体积应为 100 μL。 
	注意： 上述用于病毒稀释的 1x&#160;MEM 工作液是通过将 10x&#160;MEM 用水稀释制备而成。</li>
	<li>感染后，移除接种液，并向每孔加入 100 μL 不含胰蛋白酶的 1x&#160;MEM。</li>
	<li>将感染后的细胞在 37 °C、5% CO2 的培养箱中继续培养 18 至 24 小时。</li>
</ol>
3. 通过单克隆抗体或血清评估FcRg/NFAT介导的荧光素酶活性激活
<ol>
	<li>首先，将转染或感染细胞的培养基更换为 25 µL 检测培养基（含 4% (vol/vol) 低 IgG 胎牛血清的 1x&#160;RPMI 1640）。</li>
	<li>在另一个 96 孔板中，使用检测培养基将目标抗体从 30 μg/mL 开始进行四倍系列稀释。每种稀释液设三个复孔，示例板布局见图 1A。务必设置不含抗体的对照（无抗体对照）以及背景对照（仅检测缓冲液）。 
	注意：对于“无抗体”对照和背景对照，均加入 25 µL 检测缓冲液代替抗体。</li>
	<li>将步骤 3.2 中系列稀释的抗体各 25 μL 转移至转染细胞或感染细胞板的相应孔中。</li>
	<li>将板置于 37 °C 培养箱（含 5% CO2）中孵育 15 分钟。</li>
	<li>每孔加入 25 μL 表达小鼠 FcgRIV 或人 FcgRIIIa 的改良效应 Jurkat 细胞（每孔 75,000 个细胞）。每孔总体积应为 75 µL，抗体的起始终浓度为 10 µg/mL（图 1B）。 
	注意：对于背景对照，加入 25 µL 检测缓冲液代替效应细胞。若需检测抗体依赖性细胞介导的吞噬作用，可使用表达人 FcgRIIa 的改良 Jurkat 细胞。</li>
	<li>将板置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育 6 小时。</li>
	<li>使用前，在 37 °C 水浴中解冻并预热荧光素酶底物缓冲液约 1 小时。 
	注意：配制荧光素酶底物缓冲液时，将冻干的荧光素酶检测试剂溶解于所提供的检测缓冲液中。配制后的底物缓冲液可在 -30 °C 至 -10 °C 条件下保存最多六周。</li>
	<li>除背景对照孔外，其余各孔均加入 75 μL/孔的荧光素酶底物缓冲液。</li>
	<li>使用化学发光仪读数。</li>
	<li>按以下公式计算诱导倍数：诱导倍数 = (诱导值 - 背景值) / (无单抗值 - 背景值)。</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
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<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
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<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
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<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
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<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
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<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述方法可用于检测针对HA的单克隆抗体与小鼠FcγRIV结合的能力。靶抗原流感病毒血凝素在病毒感染或质粒DNA转染细胞后表达于细胞表面。该检测方法还可适用于将其他表面表达的病毒蛋白与不同的FcγR（人源或小鼠源）联合使用。此外，我们曾利用血清样本评估多克隆抗体诱导Fc效应功能的能力（数据未显示），这在研究感染或疫苗接种所诱导的适应性免疫应答时可能提供更具相关性的信息。我们还推测，可通过将可溶性蛋白直接包被于酶标板上，对该检测方法进行改进以测量识别病毒内部蛋白的抗体的诱导情况。然而，该方法尚未经过严格验证。
抗体依赖性效应功能的诱导可能受到多种因素的影响，包括但不限于效应细胞与靶细胞的比例（每孔加入的效应细胞数量）、所用抗体的浓度、效应细胞与靶细胞共孵育的时间，以及检测缓冲液中所用低IgG血清的浓度。
传统上，测量抗体或多种抗体血清的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性的标准检测方法涉及从供体采集的原代自然杀伤（NK）细胞。FcγR的结合及细胞内信号通路的激活通常通过检测活化标志物CD107a和/或IFN-γ的表达来...

季节性流感疫苗所提供的免疫效果传统上通过血凝抑制（HI）试验进行评估1，该方法用于检测靶向血凝素受体结合位点的抗体。这些具有血凝抑制活性的抗体可提供完全免疫保护，但其保护范围通常较窄，仅对少数几种流感病毒株有效。分离并表征可识别血凝素（HA）的广谱反应性单克隆抗体，提示通用型流感疫苗的研发已接近实现。2,3,4,5,6,7,8通用流感疫苗的主要目标之一是诱导针对流感病毒保守区域的强效抗体反应9,10,11,12,13,14,15,16广泛反应性抗体，可识别这些由中和性与非中和性抗体组成的保守表位17,18，已被证明需要 Fc-FcγR 相互作用以实现最佳保护效果 体内 并强调 Fc 介导的免疫在流感病毒整体免疫应答中的作用19,20.
保护性相关因素在评估感染免疫中至关重要。这些指标使科学家和临床医生能够估算疫苗的有效性、数据的显著性以及治疗方案的走向。目前唯一确立的针对流感病毒感染的保护性相关指标是血凝抑制试验。抗体滴度为1:40时，与患病风险降低50%相关。1,21 ——反映了靶向HA球状头部受体结合位点、从而抑制凝集的抗体的存在。然而，也应注意，在老年人中，T细胞应答可能是流感病毒感染保护作用更佳的相关指标。有趣的是，最近有报道称，神经氨酸酶抑制活性可能是预测流感免疫力的更佳指标。22幸运的是，典型的 体外 中和试验或神经氨酸酶抑制试验等检测方法可测定针对HA茎部或神经氨酸酶特异性抗体。大多数这些传统方法 体外 然而，这些检测方法仅考虑抗体抗原结合区的功能，而未测量 Fc 区域的作用。此外，通过 Fc 受体结合发挥保护作用的非中和抗体的贡献 体内 未被检测到17,18为了测量由诱导Fc介导免疫（如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC）的抗体所提供的保护作用，需要一种可靠的 体外 需要进行检测。
以下所述方法通过使用经基因改造、表达激活型小鼠 I 型 Fc 受体 FcγRIV 的 Jurkat 细胞系，评估小鼠单克隆抗体诱导 Fc 介导功能的能力。抗体与 FcγR 的结合可转导细胞内信号，从而触发活化 T 细胞核因子（NFAT）介导的荧光素酶活性。该检测方法相较于传统技术具有多项优势，传统方法需分离和培养原代效应细胞，并使用流式细胞术检测 Fc 介导效应功能的激活19,23,24,25,26。首先，本文所述方案可轻松适用于不同病毒靶标、FcγR 以及来自不同物种（人源和小鼠）的抗体。其次，使用经改造的 Jurkat 细胞系，其表达的 FcγR 与受活化 T 细胞核因子（NFAT）启动子调控的荧光素酶报告基因相连，从而实现高通量检测，可通过测量发光强度的酶标仪轻松分析结果。在此方法中，传统原代效应细胞的激活被抗体与 Jurkat 细胞表面 FcγR 结合后诱导 NFAT-荧光素酶表达所替代。该 96 孔板检测格式可同时检测最多四种不同样本，每种设三个复孔，共七个稀释梯度——若采用传统技术，此类样本量将极为繁琐。此外，本检测中尚有若干需考虑的因素，可能影响实验设计与数据解读。病毒靶标必须在细胞表面表达，才能被抗体识别。为缓解此限制，可将靶抗原（例如 内部病毒蛋白）直接包被于培养板表面。然而，该方法尚未经过严格验证。另外，经改造的 Jurkat 细胞系仅表达一种激活型 FcγR，且不表达任何抑制型 FcγR，而原代细胞系则在生理条件下表达全部受体。
我们此前已利用该检测方法证明，在多克隆背景下，表位特异性在调控 Fc 介导的效应功能中起着关键作用，且抗体依赖性细胞介导的应答的最适激活需要两个结合位点27,28。本文中，我们描述了一种评估茎部特异性单克隆抗体结合并激活小鼠激活型 FcγRIV 能力的方法。尽管存在例外情况29,30，但大量广谱反应性抗体靶向血凝素抗原保守的茎部区域，因此在通用流感疫苗的开发中发挥着重要作用。

<table><tbody><tr><td>A549 细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>人肺腺癌肺泡基底上皮细胞</td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>人胚胎肾细胞</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11668019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM 减血清培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>白色组织培养处理的 96 孔板</td><td>Corning, Inc.&amp;nbsp;</td><td>3917</td><td>检测用板</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>表达小鼠 FcgRIV 的 Jurkat 细胞</td><td>Promega</td><td>M1201</td><td>试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清</td></tr><tr><td>表达人 FcgRIIIa 的 Jurkat 细胞</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清</td></tr><tr><td>表达人 FcgRIIa 的 Jurkat 细胞</td><td>Promega</td><td>G9901</td><td>试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清</td></tr><tr><td>荧光检测仪</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Multi-Mode reader</td><td>发光板读数仪</td></tr><tr><td>Bio-Glo 荧光素酶检测系统</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>包含荧光素酶检测缓冲液和荧光素酶检测底物</td></tr><tr><td>Madin Darby 犬肾细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>犬肾细胞</td></tr></tbody></table>

一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的fc介导效应功能的方法

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

抗体通过其抗原结合域和Fc区，在针对病毒病原体的先天免疫与适应性免疫应答的耦联中发挥关键作用。本文介绍如何利用经基因工程改造、表达激活型I型Fc-FcγR的Jurkat细胞系，检测靶向流感病毒血凝素的单克隆抗体对Fc效应功能的激活作用。通过该方法，可确定免疫球蛋白介导的特定Fc-FcγR相互作用的贡献。 体外 检测

我们证明，一种针对茎部的单克隆抗体6F12（而非针对头部的单克隆抗体PY102）能够通过上调CD107a和干扰素γ来激活原代自然杀伤细胞19。为了模拟茎部特异性抗体激活原代人自然杀伤（NK）细胞的能力，我们显示，茎部特异性单克隆抗体6F12可强烈激活表达小鼠FcγRIV的改造型Jurkat细胞，激活程度约为对照的14倍。相比之下，头部特异性单克隆抗体PY102和对照IgG则无此激活作用（图2）28。
为了研究感染复数（MOI）是否会影响表达小鼠 FcγRIV 的 Jurkat 细胞的激活，我们将 MDCK 细胞以 MOI 为 3、1 或 0.33 的条件感染 X31 病毒（一种重配的甲型流感病毒，表达 A/Hong Kong/1/68 (H3N2) 病毒的血凝素和神经氨酸酶，以及 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 病毒的内部基因片段）。24 小时后，将表达小鼠 FcγRIV 的 Jurkat 细胞与单克隆抗体 ...

我们描述了一种用于检测靶向流感病毒血凝素的抗体激活Fc介导效应功能的方法。该检测方法也可经调整后用于评估靶向其他病毒表面糖蛋白的单克隆抗体或多克隆血清诱导Fc介导免疫应答的能力。

一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的Fc介导效应功能的方法

抗体通过其抗原结合域在连接针对病毒病原体的固有免疫与适应性免疫反应中发挥关键作用，……

本方案的总体目标是评估抗体或血清样本激活Fc介导效应功能的能力。该方法通过检测抗体依赖性Fc介导免疫的激活情况，有助于回答免疫学和疫苗学领域的关键问题。该技术的主要优势在于，从材料准备到数据分析可在24小时内完成。本实验操作由 Peter Palese 实验室的研究生 Mark Bailey 演示。为通过转染诱导流感病毒血凝素的表达，首先将人胚胎肾 293 细胞以每孔 2 × 10⁴ 个细胞的浓度接种于白色组织培养处理的 96 孔板中。在 37°C 及 5% CO₂ 条件下孵育 4 小时后，每孔加入编码病毒血凝素的 100 纳克 DNA、0.2 微升转染试剂，总体积为 50 微升的 1× Opti-MEM 低血清培养基，对细胞进行转染。将DNA-脂质体复合物加入每个孔中以进行转染，并将培养板放回培养箱中继续孵育18小时。为通过感染诱导流感病毒血凝素的表达，将A549细胞以每孔2×10⁴个细胞的浓度接种于白色组织培养处理的96孔板中，在37°C和5%CO₂条件下至少孵育18小时。孵育结束后，用100 µL 1×MEM培养基将流感病毒稀释至每个孔的感染复数（MOI）为3，然后在细胞培养箱中感染A549细胞1小时。孵育结束时，移除接种物，加入100微升不含病毒的新鲜1× MEM培养基，将细胞放回培养箱继续孵育18至24小时。为评估特定目标抗体对表达血凝素细胞的靶向能力，将病毒感染细胞培养物的上清液替换为25微升抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）检测培养基。接着，在另一块96孔板中，用新鲜ADCC培养基对目标抗体进行连续四次三倍稀释，起始浓度为每毫升10微克，按照示意图操作，并注意设置背景对照和无抗体对照。当所有抗体稀释完成后，取25 µL稀释后的抗体加入实验细胞板中相应的孔内，并将该板放入细胞培养孵育箱中。15分钟后，每孔加入25 µL ADCC培养基中含有7.5 × 10⁴个表达相应Fc受体的改造效应Jurkat细胞，使每孔ADCC培养基的终体积为75 µL。将板放回细胞培养孵育箱中孵育6小时，并在孵育的最后1小时期间，将荧光素酶底物缓冲液在37 °C水浴中解冻。当缓冲液准备就绪后，除背景对照孔外，向所有孔中加入 75 µL 荧光素酶底物缓冲液，并在发光仪上读取数值。随后可计算转染或感染细胞培养物中抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的诱导倍数。在本实验中，与头部特异性单克隆抗体和对照 IgG 抗体相比，一种针对特定抗原表位的单克隆抗体显著激活并修饰了表达小鼠 Fc gamma 受体 4 的 Jurkat 细胞，诱导倍数约为 14 倍。观看本视频后，您应能充分了解如何设计实验，以评估特定目标抗体激活 Fc 介导免疫反应的能力。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

流感血凝素特异抗体诱导的 Fc 介导效应函数的一种评估方法

本研究建立了一种简单的槽点印迹法，利用针对流感病毒血凝素和神经氨酸酶最保守序列的通用抗体，对其进行定量分析，这些保守序列通过生物信息学分析确定。该创新方法可能为所有病毒血凝素和神经氨酸酶的定量测定提供一种有用的替代方案。...

使用通用抗体通过简易槽印迹法对所有A型流感病毒血凝素和神经氨酸酶进行定量分析

本方法描述了利用基于红外染料的成像系统，以高灵敏度检测感染小鼠支气管肺泡灌洗（BAL）液中的H1N1病毒。该方法可在96孔或384孔板中进行，所需检测样品体积小于&lt;10...

高通量流感病毒检测方法

该视频演示了用于检测血清中针对特定抗原的抗体的血凝抑制试验。通过不同的视觉模式，可确认检测孔中出现血凝抑制现象，而对照孔中出现血凝现象。该试验在病毒学和免疫学领域中对于评估免疫反应、疫苗有效性以及研究病毒感染具有重要作用。...

检测血清中针对目标抗原抗体的血凝抑制试验

本视频展示了一种检测抗体介导的T细胞效应功能激活的实验方法。将针对流感病毒血凝素（HA）的特异性单克隆抗体加入表达HA的转染哺乳动物细胞中，可形成与HA的免疫复合物。当引入表达Fc受体和荧光素酶报告基因的工程化T细胞后，抗体-HA复合物可激活T细胞，通过添加荧光素酶底物并检测产生的生物发光信号，即可检测T细胞的激活程度。...

测量HA抗体介导的Fc效应功能的激活

本视频展示了一种用于测定血清样本中流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制性抗体滴度的检测方法。将含有抗NA抗体的血清样本加入包被有胎球蛋白（fetuin）的微孔板中。加入病毒后，抗体可阻止病毒NA切割胎球蛋白并暴露其半乳糖基团。随后加入辣根过氧化物酶标记的凝集素，该凝集素可结合暴露的半乳糖。通过比色法测定NA抑制性抗体滴度，即固定化的凝集素偶联过氧化物酶催化过氧化物酶底物产生显色反应。...

一种用于测定流感病毒神经氨酸酶抑制抗体滴度的检测方法

采用打印的聚糖微阵列策略，将传统的96孔板检测方法微型化，用于分析甲型流感病毒血凝素对含唾液酸受体的结合强度和特异性。...

一种用于评估甲型流感病毒血凝素亲和力与特异性的微型化聚糖微阵列检测方法

我们描述了一种用于测定血清中流感病毒神经氨酸酶（NA）抑制抗体滴度的酶联凝集素检测法（ELLA）。该检测方法利用花生凝集素来定量当神经氨酸酶从包被有胎球蛋白的96孔板上去除唾液酸后暴露出的半乳糖残基。...

通过酶联凝集素法测定流感病毒神经氨酸酶抑制抗体滴度

本文所述实验方案介绍了如何通过血凝抑制试验定量流感疫苗接种者血清样本中针对流感病毒的特异性抗体滴度。第一项试验通过血凝试验确定最佳病毒抗原浓度；第二项试验通过血凝抑制试验定量流感病毒特异性抗体滴度。...

一种优化的血凝抑制（HI）检测法用于定量流感特异性抗体滴度

甲型流感病毒（IAVs）是重要的人类呼吸道病原体。为了理解IAVs的致病性并进行新型疫苗策略的临床前测试，需要采用模拟人类生理特征的动物模型。本文描述了利用小鼠感染模型评估IAV致病机制、体液免疫应答及疫苗效力的技术方法。...

流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

我们介绍一种利用蛋白质微阵列的实验方案，该微阵列通过将流感病毒抗原点样至硝酸纤维素包被的载玻片上构建而成，可同时检测血清中针对超过250种来自不同病毒株抗原的多种抗体同种型，从而实现对血清抗体在不同病毒亚型间广度的测量。...

使用流感抗原微阵列测量血清抗体对不同病毒亚型的广度

本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中评估Tfh和生发中心B细胞反应的实验方案。...

小鼠甲型流感病毒感染期间滤泡辅助性T细胞与生发中心反应的评估

了解评估流感血凝素特异性抗体诱导Fc介导效应功能的方法。本方案使用人胚肾293细胞转染技术，可在24小时内完成抗体依赖性细胞介导的细胞毒性检测，为疫苗开发和免疫学研究提供高效工具。

一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的Fc介导效应功能的方法

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