平山准备观察斑马鱼胚胎标本染色，并通过分析全山原位杂交

该程序的总体目标是在早期发育时间点更好地可视化染色的固定斑马鱼胚胎。这是通过首先在 C two 杂交中使用 home mount 对斑马鱼胚胎进行染色来实现的。接下来，选择一个胚胎进行平面安装，并用一对细镊子在蛋黄上做一个中央切口，然后使用睫毛工具轻轻刮擦并去除剩余的蛋黄颗粒。

最后，将胚胎安装在载玻片上的甘油中，以便对标本进行适当的成像。最终，平装通过去除蛋黄并将胚胎定位在二维制备中，可以从背视图更好地观察染色胚胎。与现有方法（如在年轻发育阶段对完整胚胎进行成像）相比，该技术的主要优点是，平面安装可以去除卵黄袋，从而可以查看整个胚胎。

这种方法可以帮助回答发育领域的关键问题，例如表征胚胎中肾脏性别前场的结构域。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为这种技术需要小心翼翼地处理胚胎，而且因为学习取出蛋黄袋所需的适当压力可能需要时间。演示此程序的是我、Zoe 和 Amanda，他们是 winger 实验室的研究生。

收集、固定和染色胚胎后，根据文本方案，选择一个胚胎用一个 X-P-B-S-T 进行平面安装。将胚胎转移到塑料或玻璃培养皿中。然后在立体显微镜下将培养皿放在下，使用细镊子滚动胚胎，以便获得头端和尾端可见的侧视图。

接下来，使用细镊子保持胚胎稳定，并使用第二组镊子在蛋黄上切开，位于胚胎头部和尾部之间的中央位置。然后用细镊子从橡木细胞腔中舀出蛋黄。使用一滴 X-P-B-S-T 冲洗胚胎中的杂散蛋黄，滴一到两滴 One XPBS。

将胚胎移植到平坦的载玻片上。将胚胎拖到缓冲液的边缘，使其保持在与载玻片相抵的平坦位置。在锚定胚胎时，使用捆绑工具轻轻刮擦腹面以去除蛋黄颗粒。

如果 PBST 溶液被多余的蛋黄弄乱或开始蒸发，请添加 1 到 2 滴新鲜的液滴，然后将胚胎拖入该新鲜缓冲液中。圆满去除蛋黄后，轻轻地将胚胎转移回 PBST 培养皿中进行最后冲洗。然后将胚胎转移到含有 100% 甘油的培养皿中，孵育 5 分钟。

要将胚胎安装在载玻片上，请将其转移到干净的玻璃杯上。滑入 1 到 2 滴 100% 甘油，并将其放置在蛋黄腹侧朝向载玻片的位置。使用绑扎工具，将胚胎拖到甘油滴的边缘，使其保持在与载玻片相抵的平坦位置。

如果胚轴是弯曲的，用细镊子轻轻地在剩余的蛋黄上做小切口，以缓解紧张，使其可以平放。在幻灯片上。将小块造型粘土放在 18 x 18 玻璃盖玻片的四个角上。

慢慢地将盖玻片放在胚胎上，调整盖玻片的角度，以尽量减少甘油中的气泡。最后，在盖玻片的侧面额外添加一滴 100% 甘油以填充玻璃之间的空间并消除漂移，使用立体或复合显微镜进行成像，如图所示。使用探针组合和两种颜色的愿望来标记产生肾脏的发育中的肾祖细胞，并且胚胎在早期被平装。

因此，螨虫阶段，肾祖细胞通过它们在副中胚层周围表达 PAX 两个 A 转录本以 U 形模式划分，该转录本同时表达以红色显示的 delta C。当 delta C 与 C crox 20 共标记时，揭示了肾祖细胞的喙部亚结构域，该结构域表达 delta C，分析了 PAX 2 a、SLC 4 A 4、SLC 12 A 3 和 S-M-Y-H-C 1 在 14 处的表达。因此，螨虫阶段能够用 PAX 2 A 映射整个肾祖细胞结构域，并揭示喙部亚结构域中的细胞子集表达 SLC 4 A 4。

这与表达 SLC 12 A three 的肾祖细胞的 coddle 亚结构域不重叠。在该图中，视黄酸生物合成所需的视黄醛脱氢酶 2 基因突变的胚胎或用 DEAB 和 ALD H 抑制剂处理的胚胎分别以 WT one A 的表达减少或消除而发展，表明平面安装制备的双色愿望对于器官发生过程中的细胞结构域研究很有价值。在具有基因突变的斑马鱼中或化学接触小分子时 一旦掌握，如果作得当，这项技术可能需要 10 到 15 分钟。

按照这个程序，可以执行其他方法（如成像）来回答其他问题，例如肾段的边界在哪里。观看视频后，您应该对如何平装染色的斑马鱼胚胎有很好的了解，以便通过去除蛋黄来更好地可视化所需的结构。