用于整体染色斑马鱼胚胎标本观察与分析的平铺制备 原位 杂交

本实验的总体目标是在斑马鱼胚胎发育早期阶段更清晰地观察经染色固定的斑马鱼胚胎。首先使用C2杂交法中的原位杂交染色技术对斑马鱼胚胎进行染色，以实现这一目标。随后选取一个胚胎进行平展封片，并用一对精细镊子在卵黄上做一中央切口，然后使用睫毛工具轻轻刮除并去除残留的卵黄颗粒。

最后，将胚胎置于载玻片的甘油中进行封片，以便对样本进行适当的成像。最终，通过去除卵黄并将胚胎置于二维平面上进行平展封片，可从背侧更清晰地观察染色后的胚胎。与现有的方法（如在较早发育阶段对完整胚胎进行成像）相比，该技术的主要优势在于平展封片能够去除卵黄囊，从而实现对整个胚胎的全面观察。

该方法有助于回答发育生物学领域的一些关键问题，例如对胚胎中肾前体细胞区域的特征进行表征。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到一定困难，因为该技术需要对胚胎进行精细操作，而且掌握去除卵黄囊所需施加的适当压力也需要一定学习过程。本次实验操作将由我、Zoe 和 Amanda 演示，我们均为 Winger 实验室的研究生。

按照文本方案收集、固定并染色胚胎后，选择一个带有X-P-B-S-T标记的胚胎进行平展封片。将胚胎转移至塑料或玻璃培养皿中。然后在体视显微镜下，用精细镊子轻轻滚动胚胎，使其呈现侧视角度，能够同时看到头部和尾部末端。

接着，使用精细镊子固定胚胎，并用另一把镊子在胚胎头部与尾部之间的中心位置对卵黄进行切口。然后用精细镊子将卵黄细胞腔内的卵黄挖出。使用一滴至两滴 XPBS，用一支 X-P-B-S-T 冲洗胚胎上散落的卵黄。

将胚胎转移至一块平的玻璃载片上。将胚胎拖至缓冲液边缘，使其保持紧贴玻璃载片的平展状态。在固定胚胎的同时，使用睫毛工具轻轻刮擦其腹面，以去除卵黄颗粒。

如果PBST溶液中出现过多卵黄残留或开始蒸发，可添加一到两滴新鲜PBST溶液，并将胚胎移入此新鲜缓冲液中。在卵黄被充分去除后，轻柔地将胚胎转移回盛有PBST的培养皿中进行最终漂洗。随后，将胚胎转移至含有100%甘油的培养皿中，孵育五分钟。

将胚胎置于载玻片上时，将其转移至干净的玻璃载片，加入一到两滴100%甘油，并使胚胎的腹侧卵黄面朝向载玻片。使用睫毛工具将胚胎拖至甘油滴边缘，使其紧贴载玻片并保持平展状态。

如果胚胎轴弯曲，可用精细镊子在残留的卵黄上轻轻做几个小切口，以释放张力，使其能够平展地放置在载玻片上。在18×18 mm的玻璃盖玻片的四个角上，各放置一小块造型粘土。

将盖玻片缓慢放置在胚胎上，倾斜盖玻片以尽量减少甘油中的气泡。最后，在盖玻片的一侧再加一滴100%甘油，以填充玻璃之间的空隙并防止样本漂移，使用体视或复合显微镜进行成像，如图所示。实验中联合使用了多种探针，并采用双色标记以示踪发育中的肾源性前体细胞，这些前体细胞将形成肾脏；胚胎在早期阶段即被平铺封片。

在14体节期，肾祖细胞通过表达PAX2a转录本呈现出U形分布模式，包围着同时表达delta C（红色显示）的旁侧中胚层。当delta C与Ccrox20共标记时，揭示出肾祖细胞中一个表达delta C的头侧亚区。通过分析PAX2a、SLC4a4、SLC12a3和S-M-Y-H-C1在14体节期的表达情况，可利用PAX2a对整个肾祖细胞区域进行定位，并发现头侧亚区中有一部分细胞表达SLC4a4。

这与表达 SLC12A3 的肾前体细胞的 coddle 结构域不重叠。在本图中，视黄酸生物合成所必需的视黄醛脱氢酶2基因（Retinaldehyde dehydrogenase 2）发生突变的胚胎，或经DEAB和ALDH抑制剂处理的胚胎，分别表现出WT1A表达减少或完全缺失，表明采用整体封片进行双色WISH对于研究器官发生过程中的细胞区域具有重要价值。在斑马鱼中，无论是存在基因突变还是化学暴露于小分子的情况下，一旦掌握该技术，若操作得当，可在10至15分钟内完成。

完成此操作后，可进行其他方法如成像，以回答更多问题，例如肾脏节段的边界位于何处。观看视频后，您应能充分理解如何通过去除卵黄来平铺固定染色的斑马鱼胚胎，以便更清晰地观察目标结构。