Name: 内髂动脉注射显微骨转移的效率和选择性建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学习内髂动脉注射技术，在小鼠模型中高效建立乳腺癌骨转移模型，研究肿瘤细胞与骨微环境的相互作用。该方法选择性高、组织损伤小，成功率可达90%以上，为癌症骨转移机制研究提供重要工具。

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张实验室的研究工作得到了以下资助：X. H.-F. Z. 获美国国家癌症研究所（NCI）CA151293、CA183878 项目、乳腺癌研究基金会、美国国防部 DAMD W81XWH-13-1-0195 项目、CA149196-04 项目的试点奖、麦克奈尔医学研究所，以及 H.W. 获美国国防部 DAMD W81XWH-13-1-0296 项目的支持。

所有动物实验均按照贝勒医学院的动物护理指南进行。
1. 细胞准备
注意：根据研究目的，可使用不同的癌细胞系进行IIA注射。在我们的研究中，已使用乳腺癌细胞系MCF7、4T1、4T07、MDA-MB-361、MDA-MB-231、MDA-MB-436以及前列腺癌细胞系C4-2。我们通常同时使用表达GFP和萤火虫荧光素酶的标记癌细胞进行研究，并在此展示来自GFP-荧光素酶标记的MCF7细胞系的部分数据。
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清和0.1 mg/ml青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养细胞。</li>
	<li>在IIA注射前，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液消化80–90%汇合度的细胞。用预冷的PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于10 ml PBS中进行计数。通过在800 × g离心5分钟去除PBS。</li>
	<li>将细胞重悬于预冷的PBS中，浓度为5 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>每只小鼠IIA注射使用100 µl表达GFP和荧光素酶标记的癌细胞。 
	注意：因此每只动物接受的细胞数量为5 × 105。该数量可能需要根据细胞系的侵袭性进行调整。</li>
	<li>将细胞悬液置于冰上保存。 
	注意：每隔几分钟可能需要轻微振荡以防止细胞聚集。对于某些细胞系（如MDA-MB-231），可能需要更严格的处理步骤（例如，通过45 µm细胞筛网过滤）以防止聚集。请注意，血管堵塞可能导致组织坏死，从而干扰实验结果。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>用于动物镇痛管理，术前至少24小时开始，以5 mg/kg/天的剂量将卡洛芬（或其它镇痛药）与饮食补充剂一同给予小鼠。手术前60分钟，皮下注射0.1 mg/ml的丁丙诺啡。注意：可选操作为将雌二醇药丸植入动物背部，以提供额外的雌二醇，这将促进ER+癌细胞的生长例如，MCF-7 细胞）9.</li>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（80 - 100 mg/kg）和赛拉嗪（10 - 12.5 mg/ml），对一只4至6周龄的小鼠（体重约20 g）进行麻醉。</li>
	<li>通过脚趾夹捏以及观察到呼吸频率降低50%和黏膜呈粉红色，确认20 g小鼠达到适当的镇静水平例如， 小鼠耳部皮肤和足部皮肤）。手术期间每15分钟持续监测这些生命体征。注意：动物无任何活动表明其已充分麻醉，可进行手术。</li>
	<li>使用兽医用眼膏以防止眼睛干涩。</li>
	<li>剃除小鼠下腹部的毛发，尤其是手术和注射将要进行的右侧腹股沟区域。 
	注意：如果使用裸鼠（athymic nude mice），则无需此步骤。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，使其四肢处于自然位置，并用胶带将脚趾固定在可移动的解剖纸板上。</li>
	<li>用浸有70%异丙醇的无菌棉签擦拭右侧腹股沟区域，随后多次使用聚维酮碘外科擦洗剂进行消毒。</li>
</ol>
3. 髂总静脉和动脉的位置与分离
<ol>
	<li>在第4肋间做一长度为1.0 - 1.2 cm的皮肤切口th 和 5th 使用无菌的#10碳钢手术刀片（安装于3号刀柄）在右下腹部切开乳头。然后用无菌手术巾覆盖动物身体，仅暴露切口部位。</li>
	<li>将动物转移至标准台面解剖显微镜下。注射时使用4倍放大倍率。</li>
	<li>在解剖显微镜4倍放大倍数下，将钝性分离镊插入脂肪组织与腹膜之间，向两侧推开组织以暴露髂血管和神经（参见 图1). 
	注意：位于中线主动脉与动脉分支下部之间的动脉称为髂总动脉，此处为注射部位。</li>
	<li>使用一对直头精细镊子，在靠近血管处，穿透血管与神经之间的结缔组织（类似膜状结构）。</li>
	<li>将直头精细镊子换至左手。用右手取一把弯头精细镊子。将右手的镊子插入之前已分离结缔组织的位置，并将镊子从血管下方穿过。</li>
	<li>同时，将左手镊子插入血管左侧的结缔组织中，引导右手镊子穿过。</li>
	<li>当右手镊子到达血管下方后，尝试进一步将血管与周围组织稍作分离，然后使其保持在右手镊子的上方。</li>
	<li>用左手镊子将4-0丝线缝线的线端传递至右手镊子，然后轻柔缓慢地将缝线从血管下方穿过。注意：此时缝线已将颈总静脉和颈总动脉一同提起（见 图2).</li>
</ol>
4. 注射及注射后护理
<ol>
	<li>使用31 G胰岛素注射器准备待注射的细胞。每次注射使用100 µl PBS中的细胞悬液。务必反复吹打数次以充分分散细胞，避免细胞聚集，确保注射时细胞不会堵塞针头或阻断血流。</li>
	<li>用左手持斜角镊子，沿缝线引导将镊子置于血管下方，然后张开镊子两臂，使血管轻柔地被固定在镊子之间。 
	注意：镊子两臂之间的间隙即为注射部位。</li>
	<li>右手持装有100 µl细胞悬液的31 G针头，针尖斜面朝上，准备进行注射。</li>
	<li>将针头插入动脉管腔（血液会进入针尖），然后缓慢推注细胞悬液以完成注射。细胞悬液将推动血管内的红细胞向前移动。操作时应尽量避免损伤血管或导致细胞悬液外漏。</li>
	<li>注射完成后，轻柔地撤出针头，并继续用左手镊子夹住血管以防止出血，随后移除缝线。</li>
	<li>移开左手镊子，立即用棉签按压动脉切口部位以止血。 
	注意：通常持续按压5–10分钟即可有效止血。</li>
	<li>止血后，使用皮肤胶闭合手术区域的皮肤切口边缘，并进行耳标标记，随后检测生物发光信号以评估注射细胞的分布情况。 
	注意：成功的注射应获得与图3相似的成像结果。
	<ol>
		<li>通过眼眶静脉窦注射100 µl浓度为15 mg/ml的荧光素酶底物（luciferin）PBS溶液（剂量为75 mg/kg小鼠体重），检测生物发光信号。
		<ol>
			<li>进行眼眶静脉注射时，用手指轻压小鼠眼球两侧，施加压力使眼球轻微突出于眼眶，将28 G胰岛素注射针头插入眼球与鼻部之间的间隙，然后缓慢推动注射器注入荧光素酶底物。 
			注意：当针头位置正确时，在触及硬组织（骨骼）前应能插入2–3 mm深度。</li>
			<li>在注射后5分钟内将小鼠放入成像系统，进行in vivo整体动物成像，持续10–60秒（参见图3）。 
			注意：可选步骤为在动物背部植入雌二醇缓释丸，以提供额外的雌二醇，促进ER+癌细胞（例如，MCF-7细胞）的生长15。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠置于温热的加热垫上直至其苏醒。术后密切观察出血、肿胀、切口裂开及疼痛等体征。将小鼠放回笼中，并给予镇痛支持（建议使用卡洛芬饮食补充剂）直至无疼痛表现。术后7天内需对动物进行密切监护和护理。</li>
</ol>
5. 监测转移性生长
<ol>
	<li>组织形态计量学：
	<ol>
		<li>取带瘤骨组织，用4%多聚甲醛固定24小时，然后在pH 7.0的14% EDTA溶液中脱钙3–5天，并按先前所述方法进行石蜡包埋14。</li>
		<li>将石蜡包埋的骨组织切片至厚度3 µm，按先前所述方法进行标准的苏木精/伊红染色14。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学：
	<ol>
		<li>对带瘤骨组织的石蜡切片进行免疫组织化学染色，用于不同目的，操作步骤如前所述14。简言之，使用抗GFP抗体对MCF7癌细胞进行免疫染色，分别使用抗Osterix抗体和抗碱性磷酸酶（ALP）抗体对成骨细胞（前成骨细胞和成骨细胞）进行免疫染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管注射癌细胞的靶血管仅为髂动脉，但我们建议将双侧髂静脉和髂动脉从周围组织中分离出来，并作为一束一同提起。这是因为静脉与动脉之间存在广泛的接触，且静脉管壁较薄，容易破裂。因此，尽管仅需向动脉内注射癌细胞，但将两根血管一同提起可为成功注射节省时间和操作难度。如图2所示，可使用4-0丝线缝合来辅助此操作。该缝合线也可在发生出血时帮助止血。
IIA注射的大部分步骤需要在解剖显微镜下进行。小鼠的血管柔软且细小，这使得操作具有挑战性。然而，经过充分练习后，据我们的经验，成功率可达90 - 100%。
利用该技术，研究人员可以建立其感兴趣的癌细胞模型的骨定植模型，包括那些传统上被认为&#34;非转移性&#34;的细胞模型，MCF-7细胞即为一个典型例子。事实上，当MCF-7细胞进入骨微环境后，会经历短暂的休眠期，随后开始增殖并定植。在携带原位MCF-7异种移植瘤的动物中，极少能检测到自发性骨转移。然而，这种检测失败很可能源于播散性肿瘤细胞残留数量极少、定植启动缓慢，以及原位肿瘤更具侵袭性的生长（导致动物在...

转移灶导致了超过90%的实体瘤患者死亡。骨骼是多种癌症类型转移最常见的器官，尤其是乳腺癌和前列腺癌。临床诊断时，骨转移通常已进入晚期阶段，表现为溶骨性或成骨性骨质改变，并常伴有神经系统症状。
既往研究主要集中在明显的溶骨性骨转移1-3，然而目前对于溶骨过程发生前骨骼中的微转移灶仍缺乏深入了解。这至少部分归因于缺乏合适的实验模型和研究方法。乳腺癌基因工程小鼠模型常发生肺转移，但骨转移效率较低4。同样，原位移植的肿瘤很少自发形成骨转移，仅有少数嗜骨性的4T1乳腺癌亚克隆以及过表达MSP的PyMT转基因小鼠模型为例外5-7。胫骨内钻孔可将癌细胞递送至骨骼8-10，但该方法同时会造成局部组织损伤和炎症反应。目前，心内注射乳腺癌细胞系是研究骨定植的主要方法11-13。然而，将癌细胞注入左心室后，仅有少量细胞最终到达骨骼和骨髓，因此难以以可量化的方式追踪微小转移灶。
本研究建立了一种称为髂内动脉（IIA）注射14的技术，可将癌细胞选择性地递送至后肢组织，从而在不损伤局部组织的情况下，使癌细胞在骨组织和骨髓中富集。由于该方法具有骨组织特异性，还可为惰性癌细胞的定植提供充足时间，使其在动物因原发性肿瘤或其他重要器官转移灶死亡之前完成定植过程。结合生物发光成像、免疫荧光染色和骨组织形态计量学等多种技术，IIA注射法在骨转移相关研究中具有广泛的应用前景，尤其适用于追踪单个癌细胞发展为多细胞微转移灶的动态过程。我们特别证明，IIA注射技术能够帮助我们可视化观察癌细胞与骨微环境中多种邻近细胞之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 两性霉素B</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-745E</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 溶液</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>45 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>VWR International Laboratory</td><td>195-2545</td><td></td></tr><tr><td>含卡洛芬的 MediGel CPF&amp;nbsp;</td><td>贝勒医学院兽医护理部门管控物品</td><td></td><td>用于疼痛管理</td></tr><tr><td>丁丙诺啡&amp;nbsp;</td><td>贝勒医学院兽医护理部门管控物品</td><td></td><td>用于疼痛管理</td></tr><tr><td>雌二醇缓释丸</td><td>Innovative Research of America</td><td>SE-121</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮和赛拉嗪</td><td>贝勒医学院兽医护理部门管控物品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兽用软膏</td><td>贝勒医学院兽医护理部门管控物品</td><td></td><td>防止眼睛干涩</td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>Oster</td><td>78005-050</td><td>适用于有毛小鼠</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>ACROS</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘外科洗手液</td><td>贝勒医学院兽医护理部门管控物品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10 手术刀片</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>549-3CS-10</td><td>多个</td></tr><tr><td>3 号刀柄</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>541-31</td><td>需高压灭菌</td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>Sai Infusion Technology</td><td>PSS-SD1</td><td></td></tr><tr><td>直头镊子&amp;nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5132</td><td>需高压灭菌</td></tr><tr><td>直头精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td>需高压灭菌</td></tr><tr><td>带齿精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td>需高压灭菌</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 丝线缝合线</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson Health Care</td><td>J214H</td><td></td></tr><tr><td>31 G 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>328418</td><td>多个</td></tr><tr><td>棉签（无菌）</td><td>VWR International Laboratory</td><td>89031-272</td><td></td></tr><tr><td>皮肤粘合剂</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>31477</td><td>用于手术部位皮肤闭合</td></tr><tr><td>耳标钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-00</td><td></td></tr><tr><td>耳标</td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-50</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK</td><td>避光并置于冰上</td></tr><tr><td>28 G 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329410</td><td>用于眶内注射</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>用于组织固定</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>OmniPur</td><td>4050</td><td>用于骨组织脱钙</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica S6E 立体显微镜</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II 成像系统</td><td>Advanced Molecular Vision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗-GFP 抗体 (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>抗-ALP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab108337</td><td></td></tr><tr><td>抗-Osterix 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td></td></tr></tbody></table>

髂内动脉注射法用于高效选择性建立微小骨转移模型

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

髂内动脉（IIA）注射是一种在动物体内建立多种癌细胞转移病灶的有效方法。与广泛使用的经心腔注射和经胫骨注射相比，IIA注射具有多项优势。首先，它可将大量癌细胞特异性地输送至后肢骨骼，从而实现时空同步的早期定植事件，便于对播散性肿瘤细胞进行可靠定量和快速检测。其次，IIA注射将癌细胞注入血液循环系统，而不损伤局部组织，从而避免了炎症反应和伤口愈合过程对骨定植过程的干扰。第三，IIA注射在非骨器官中几乎不引起转移性生长，可防止动物因其他重要器官的转移而死亡，从而实现对惰性骨病变的持续监测。这些优势对于研究单个癌细胞向多细胞微转移灶的进展过程尤为有用，而这一过程在过去一直难以观察。当结合前沿的生物成像技术和骨组织学方法时，IIA注射可广泛应用于与骨转移相关的各类研究。

图1展示了髂总动脉（红色）和髂总静脉（蓝色）的解剖位置及其相互关系。
图2显示了在解剖显微镜下髂血管与神经的相对位置。如图2A所示，这些血管和神经位于腹膜壁正下方，在皮肤切开并推开腹膜后即可暴露。左侧为髂总静脉，相较于动脉更大且颜色更深；动脉位于中间，呈粉红色，虽比静脉细，但肌层更厚。静脉与动脉彼此平行且紧密相连。更靠右侧的是白色的腰骶干神经。图2B显示髂总血管已从周围结缔组织、肌肉和神经中分离出来，并用4-0丝线提起。图中同样标示了髂总静脉、动脉以及腰骶干神经。
图3 显示代表性结果 体内 和 离体 经髂动脉注射后的动物生物发光...

本文提供了经髂内动脉（IIA）注射的详细操作步骤，该技术可将癌细胞特异性地递送至后肢组织（包括骨骼），以建立实验性骨转移模型。尽管该方法最初是针对乳腺肿瘤模型建立的，但本方案可轻松扩展应用于其他类型的癌症。

髂内动脉（IIA）注射是一种在动物体内引入多种癌细胞转移病灶的有效方法。与广泛使用的……相比

本实验的总体目标是通过髂动脉内注射，将癌细胞直接递送至后肢组织（包括骨骼），从而建立实验性骨转移模型。该方法有助于我们回答关于乳腺癌骨定植的关键问题，尤其是在该过程的早期阶段，乳腺癌细胞如何与骨微环境中的细胞相互作用。今天我们进行了髂动脉注射。该技术的主要优势在于，它能够高效且选择性地为多种癌症类型建立实验性显微骨转移模型，同时不会造成局部组织损伤。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为在显微镜下准确定位髂动脉注射位置需要一定练习，才能使注射成功率超过百分之九十。首先通过夹捏五至六周龄、体重二十克小鼠的脚趾来确认其镇静程度是否合适。涂抹眼药膏后，用无菌的70%异丙醇棉签反复擦拭剃毛的右侧腹股沟区域，依次进行多次擦拭，随后进行聚维酮碘外科擦洗。接下来，用无菌手术巾覆盖小鼠全身。然后，使用无菌的10号碳钢手术刀片和3号刀柄，在右下腹部第四与第五乳头之间的区域做1至1.2厘米的皮肤切口。将动物转移至标准的台式解剖显微镜下。在4倍物镜下，将钝性分离镊插入脂肪组织与腹膜之间的切口，向两侧推开组织，以暴露髂血管和神经。接着，使用直头精细镊子刺穿血管与邻近血管的神经之间的结缔组织。然后，将弯头镊子穿过结缔组织并置于髂血管下方，同时将直头镊子插入血管另一侧的结缔组织中，以引导弯头镊子穿过组织。我们建议在此步骤中将髂骨边缘和动脉作为整体束状结构分离并提起。尽管肿瘤细胞仅注射入动脉，但将两条血管一并分离可节省时间和操作难度。当斜角镊放置到位后，进一步将髂静脉和髂动脉与周围组织分离，并在解剖过程中使血管保持在斜角镊的上方。当血管清晰暴露后，使用直镊将一根4-0丝线缝线的末端送至斜角镊处，并缓慢轻柔地将缝线从血管下方穿过。此时，髂总静脉和髂总动脉应均由该缝线提起。当血管准备就绪后，将肿瘤细胞上下吹打数次，以重悬为单细胞溶液并分散任何细胞团块。然后，用31号胰岛素注射器每只小鼠吸取100微升细胞悬液。接着，以缝线为引导，将斜角镊子重新滑入血管下方，并打开镊子，使血管轻轻置于镊尖上。另一只手将针尖斜面朝上插入镊子尖端之间动脉管腔内。缓慢按压推杆以注入细胞，细胞悬液将推动血液流经血管。当所有细胞输送完毕后，轻轻拔出针头，同时用镊子夹住血管使其保持抬高状态，以防止出血。然后，移除缝线。最后，迅速取下镊子，并用棉签按压切口处 5 至 10 分钟，以止住出血。在此，展示了经髂内动脉注射5 × 10⁵个GFP荧光素酶标记的MCF-7乳腺癌细胞后，再通过眶后静脉窦注射D-荧光素酶底物，获得的代表性整体动物生物发光图像。注射后第14天，从经髂内动脉注射侧的后肢骨骼中检测到强烈的生物发光信号，而对侧对照骨骼则无信号，证实了注射细胞的特异性定位。对荷瘤骨组织进行切片并行苏木精-伊红（H&E）染色，结果显示骨组织内存在致密的、鹅卵石样排列的细胞群，细胞核较大，提示在髂内动脉注射后14天，骨组织中已形成显微镜下可见的MCF-7转移病灶。此外，骨组织切片的免疫荧光染色也显示MCF-7细胞与成骨细胞及前成骨细胞相互混杂。一旦掌握，该技术可在10至15分钟内完成。在完成这些操作步骤后，可采用其他方法进一步回答更多科学问题。例如，我们可以利用RNA-Seq技术对转移微环境中的细胞进行分析，并将其与正常细胞进行比较。该技术为乳腺癌和前列腺癌研究人员提供了一种在动物体内研究骨微转移的方法。观看本视频后，您应能够充分掌握通过髂内动脉注射建立乳腺癌骨转移模型的操作步骤。请采取适当的预防措施，因为使用氯胺酮和赛拉嗪可能存在极高风险。

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