内髂动脉注射显微骨转移的效率和选择性建模
2016年9月26日
本手稿提供了髂内动脉 （IIA） 注射的详细程序，这是一种将癌细胞特异性输送到包括骨骼在内的后肢组织以建立实验性骨转移的技术。虽然最初是用乳腺肿瘤模型建立的，但该方案可以很容易地扩展到其他癌症类型。
该程序的总体目标是通过髂内动脉注射将癌细胞直接输送到后肢组织（包括骨骼）来建立实验性骨转移。所以这种方法可以帮助我们回答关于乳腺癌骨定植的关键问题，尤其是在这个过程的早期阶段，乳腺癌细胞如何与骨骼中的微环境细胞相互作用。我们今天做了髂动脉注射。
该技术的主要优点是它可以有效、选择性地建立各种癌症类型的实验性显微镜骨转移模型，而不会造成局部组织损伤。一般来说，刚接触这种方法的人会很困难，因为在显微镜上找到准确的髂动脉注射位置可能需要练习才能达到高于 90% 的注射成功率。首先通过捏住 5 到 6 周龄的 20 克小鼠的脚趾来确认适当的镇静水平。
涂抹眼药膏后，用连续的无菌 70% 异丙醇浸泡棉签擦拭剃光的右侧腹股沟区域数次，然后用优碘手术擦洗。接下来，用无菌窗帘覆盖所有小鼠。然后，使用无菌的 10 号碳钢手术刀刀片和 3 号手柄，在右下腹部的第四和第五个之间做一个 1 到 1.2 厘米的皮肤切口。
并将动物转移到标准台式解剖显微镜下。在 4X 物镜下，将钝分离钳插入脂肪组织和腹膜之间的切口，并将组织从两侧向外推出，露出髂血管和神经。接下来，使用笔直的细镊子突破血管和最靠近血管的神经之间的结缔组织。
然后，将倾斜的镊子滑过结缔组织和髂血管下方，同时将直镊子插入血管另一侧的结缔组织中，以引导倾斜的镊子穿过组织。我们建议在此步骤中将髂缘和动脉作为一个束带分离和提升。虽然肿瘤细胞仅注射到动脉中，但将两条血管一起分离可以节省时间和精力。
一旦倾斜的镊子就位，进一步将髂静脉和动脉与周围组织分开，在解剖过程中将血管保持在倾斜的镊子顶部。当血管畅通后，使用直镊子将 4-0 丝缝合线的尖端输送到倾斜的镊子上，然后缓慢而轻柔地将缝合线拉到血管下方。然后，髂总静脉和动脉血管都应由缝合线支撑。
当血管准备好后，上下移液管肿瘤细胞数次，以将它们重新悬浮到单个细胞溶液中并打碎任何团块。然后，将每只小鼠 100 微升细胞吸入 31 号胰岛素注射器中。现在，以缝合线为导向，将倾斜的镊子滑回血管下方，然后打开镊子，使血管轻轻地靠在尖端上。
用另一只手将针尖斜面向上插入镊子尖端之间动脉部分的管腔中。缓慢按下柱塞以注射细胞。细胞悬液将通过血管冲洗血液。
当所有细胞都娩出后，轻轻取出针头，保持镊子上的血管凸起以防止出血。然后，拉开缝合线。最后，快速取下镊子，将棉签按压在切口上 5 到 10 分钟以止血。
在这里，显示了髂内动脉注射 5 乘以 10 到第五个 GFP 荧光素标记的 MCF-7 乳腺癌细胞，然后通过眶后窦注射给予 d-荧光素后的代表性全动物生物发光图像。注射后第 14 天，从注射的髂内动脉后骨获得强烈的生物发光信号，而不是从对侧对照骨获得，证实了注射细胞的特异性定位。荷瘤骨骼的 H&E 染色切片还显示，在髂内动脉注射后 14 天，骨组织中有一个致密的鹅卵石状细胞群，具有大细胞核，表明骨组织中有微小的 MCF-7 转移病灶。
此外，骨切片的免疫荧光染色还显示 MCF-7 细胞与成骨细胞和成骨前细胞的共混合。一旦掌握，这项技术可以在 10 到 15 分钟内完成。按照这些过程，您可以使用其他方法来回答其他问题。
例如，我们可以使用 RNA-Seq 来分析转移生态位中的微环境细胞，并将它们与正常细胞进行比较。该技术为乳腺癌研究人员和前列腺癌研究人员提供了一种研究动物骨微转移的方法。看完这个视频，你应该对如何通过髂内动脉注射建立乳腺癌骨转移模型有了很好的了解。
请采取适当的预防措施，因为使用氯胺酮和甲苯噻嗪可能非常危险。
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概述
本文详细介绍了通过髂内动脉（IIA）注射将癌细胞递送至后肢组织（包括骨骼）以建立实验性骨转移的方法。该方法对于研究乳腺癌细胞与骨微环境之间的相互作用特别有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 实验技术
背景
- 骨转移是癌症患者常见的并发症。
- 了解癌细胞在骨组织中定植的机制对于开发治疗方法至关重要。
- 髂内动脉注射法可实现癌细胞的靶向递送。
- 与其它方法相比，该技术可最大限度减少局部组织损伤。
研究目的
- 建立用于研究骨转移的模型。
- 探究乳腺癌细胞与骨微环境细胞之间的相互作用。
- 提高注射技术的准确性和成功率。
使用的方法
- 经髂内动脉注射癌细胞。
- 使用五至六周龄的小鼠模型。
- 通过脚趾夹捏反应监测镇静水平。
- 练习注射技术以达到高成功率。
主要结果
- 该技术可有效建立骨转移模型。
- 经过练习可达到较高的成功率。
- 该方法观察到的局部组织损伤极小。
- 可获得乳腺癌细胞定植早期阶段的深入认识。
结论
- 髂内动脉注射是癌症研究中的一种重要工具。
- 该方法可适用于乳腺癌以外的多种癌症类型。
- 进一步的研究可加深对癌症与骨骼相互作用的理解。
常见问题
行业重要性概述
建立可靠的早期骨转移模型在肿瘤药物研发中仍是一项关键挑战，尤其是在评估靶向微转移定植的治疗干预措施方面。髂内动脉注射技术可实现癌细胞向后肢骨骼的时空同步播散，支持对播散性肿瘤细胞进行可靠定量，同时减少因操作导致的组织损伤所引发的混杂炎症反应。该方法通过允许对惰性骨病变进行连续监测，且不出现全身器官转移，提高了临床前研究的预测可信度，从而增强了骨转移模型在靶点验证和先导化合物筛选中的转化相关性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过模拟癌细胞与骨微环境组分（如成骨细胞和前成骨细胞）的早期相互作用，能够验证治疗假说。
- 操作价值：提供一种选择性强且高效的途径，将癌细胞递送至后肢骨，有助于在不同实验队列中稳定构建模型。
- 战略价值：通过生物发光和组织学检测手段，可视化单个细胞发展为多细胞病灶的微转移过程，从而支持对骨转移通路的机制性风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成可量化的输出结果，如生物发光信号强度和组织学病灶密度，从而实现对转移负荷的标准化评估。
- 操作价值：避免局部组织损伤及相关的伤口愈合干扰因素，提高检测的可重复性，并减少后续分析中的变异。
- 战略价值：产生疾病相关性高且脱靶器官转移极少的模型系统，可在筛选研究中实现对剂量-反应关系和时间效应的长期观察。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过捕捉播散性肿瘤细胞在骨骼中发展为微转移灶的进程，与疾病相关的系统相契合，解决了临床中的一个关键瓶颈问题。
- 操作价值：支持长期活体成像以及终点分析（如苏木精-伊红染色和免疫荧光染色），实现了从发现到临床前验证的连续性研究。
- 战略价值：通过提供针对干扰癌细胞与基质细胞共存或骨微环境中生态位形成的化合物的早期疗效信号，指导基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
髂内动脉注射方法适用于从靶点验证到先导化合物筛选，再到临床前药效测试的整个发现过程，尤其适用于骨靶向治疗药物的研究，其中早期转移模型有助于阐明作用机制和治疗窗口。
- 发现生物学：通过将肿瘤细胞靶向递送至骨骼特定部位，实现对癌细胞与骨微环境相互作用的假设验证。
- 筛选：提供适用于高内涵筛选平台的即用型生物系统，具备定量的生物发光和组织病理学检测读数。
- 分析：生成可量化的因变量，包括生物发光的光子通量、组织切片中的病灶面积，以及肿瘤细胞与基质细胞的共定位指数。
- 转化研究：通过模拟临床骨转移中溶骨性或成骨性进展之前的无血管微转移阶段，衔接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：作为一种标准化的手术技术，可适用于多种癌症类型和不同实验室，促进骨转移模型构建在跨项目间的一致性。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少操作引起的炎症干扰，并明确将表型变化归因于药物作用机制，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：利用明确的解剖标志和缝合引导的血管分离，增强实验的标准化与可重复性，最大限度降低操作者依赖的变异性。
- 战略价值：提供早期、器官特异性的转移读数，及早发现未预期的骨趋向性，从而减少后期失败风险，提升“继续/终止”决策效率。
- 组合影响：在同源或异种移植模型中，通过直接比较不同治疗组间的转移负荷，促进骨靶向候选药物的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要熟练掌握显微外科技术，包括在解剖显微镜下进行血管分离和缝合结扎。
- 依赖于无菌解剖显微镜、精细镊子、胰岛素注射器以及等渗细胞悬液制备设备的可及性。
- 需要跨团队统一麻醉方案（如氯胺酮/赛拉嗪）和术后监测流程，以确保动物福利和模型的一致性。
- 适应性考虑因素包括根据癌细胞系的侵袭性和小鼠品系的变异性调整注射体积和细胞浓度。
- 实际限制包括达到超过90%注射成功率所需的学习曲线，以及在腹股沟切口过程中需采用无菌技术以防止腹膜污染。
