三刺鱼转基因与基因组编辑的显微注射技术

该显微注射技术的总体目标是通过生成转基因和基因组编辑的刺鱼，以检测基因和增强子的功能。该方法有助于回答发育遗传学和进化遗传学中的关键问题，例如基因和增强子如何发挥作用以形成身体图式。该技术的主要优势在于能够高效地产生用于功能遗传学分析的转基因鱼。

根据文本方案制备好两种质粒和 mRNA 后，从硼硅酸盐玻璃上至少拉制四个显微注射针。将注射针尖端朝下垂直存放于毛细管储存罐中。为使多达一百个刺鱼卵受精，加入 50 µL 精子溶液，并用移液器吸头轻轻搅拌，以确保所有卵子均完成受精。

在冰上操作时，用移液器将0.5微升注射溶液注入至少三根针头的钝端，并让其自然流出以填充针头。同时，打开解剖显微镜的透射光源，在显微镜光源底座上放置一块13平方厘米的玻璃板，并在玻璃板上放置一个15厘米长的石膏锯片。将锯片垂直于注射装置放置，锯齿面朝向针头夹持器，然后打开控制箱，确保压力设定在约175千帕。

将注射持续时间设置为180毫秒。接着松开针头夹持器，然后将装有液体的针头插入夹持器，直至感觉到橡胶夹持器的阻力，再拧紧针头夹持器，直至手指拧紧为止。然后将针头角度调整至约45度。

使用显微操作仪的控制装置调节针头，使针尖位于视野中央。将放大倍数调至约40倍，并对准针尖聚焦，确保针尖未接触下方的玻璃表面。用钟表匠镊子夹住针尖末端上方约两到三个镊子宽度的位置，轻轻以60度角折断针尖。

然后多次按压注射脚踏板，以检测针头是否断裂。轻踏几次后，针尖应开始有微小的红色液滴渗出。使用一次性移液器吸取几滴刺鱼水，滴加到玻璃板上。

轻轻将针头放入水中，然后逐渐增加回压，直至针头处有微弱的粉红色液体流出。将针头尽可能回撤，以免在准备胚胎时损坏针头。受精后约25分钟，使用两个10微升移液器吸头从一窝胚胎中取出5至10个胚胎，并转移至玻璃板上。

使用移液枪头时，小心地将胚胎逐个分离至锯片的凹槽中，注意不要刺破胚胎。接着，用移液管加入足够的刺鱼用水，以浸没胚胎。然后等待三到五秒后，吸去大部分液体，仅保留少量液体覆盖每个胚胎即可。

从距离最远的胚胎开始，移动玻璃板并放大胚胎，使其大约占据视野的25%。将针头移入视野，然后使用10微升移液器吸头轻轻旋转胚胎，以识别卵裂球——即位于卵黄顶部的一团呈颗粒状、略带黄色、略微隆起的细胞质。旋转胚胎，使卵裂球与针头末端完全垂直。

缓慢而均匀地施加压力，降低针头以刺穿绒毛膜，并将针头插入细胞质中，注意不要穿透下方的卵黄。踩下脚踏板三到四次进行注射，使红色团块略微扩散边缘，填充细胞质直径的约1/8。保持针头锋利且垂直于绒毛膜，有助于完成此步骤。

控制加入的水量有助于保持卵壳柔软。最后，以细胞质为注射目标可提高获得转基因动物的几率。使用显微操作仪的控制装置将注射针回撤，并用10微升移液枪头压住胚胎，以防其黏附在注射针上。

拔出针头后，移动玻璃板使下一个胚胎与针头对齐，并重复注射操作。当所有胚胎注射完毕后，使用剪去末端的转移移液管向培养皿中加入水。然后用转移移液管收集胚胎，并将其放入盛有刺鱼养殖用水的150毫米培养皿中。

将胚胎在18摄氏度条件下孵育。注射后一天，轻轻倒掉刺鱼用水，并更换为新鲜水。检查是否存在死亡或畸形的胚胎，并将其移除以防止污染。

如图所示，对于具有增强子活性的转基因，成功注射后会导致转基因在特定细胞中表达，例如在胸鳍、中鳍和脊索中。注射后的鱼可与野生型鱼杂交，以产生稳定的品系，例如该背部稳定品系可在受精后四天驱动胚胎心脏中的GFP表达。

对于一个有活性的增强子，40%至50%的胚胎会显示出组织特异性的转基因表达，例如在中鳍和胸鳍中。表达toll two质粒转基因的GFP阳性F0代鱼中，最多可达100%能够产生转基因后代。然而，后代中携带转基因的比例变化较大，从不到1%到72%不等。

仅保存 GFP 阳性的已注射胚胎通常可提高遗传传递效率。在 F0 代回交注射的刺鱼胚胎中，仅有不超过 10% 的个体在预期组织中表现出荧光。此外，回交的遗传传递率低于质粒构建物的传递率。

在经过筛选的刺鱼中，仅有最多14%能够将目标片段传递给后代。相比之下，反向转基因的效率较低，而注射了talons的鱼类中有70%至100%会出现嵌合性突变。此处每个注射胚胎中的未切割PCR扩增产物表明，每个胚胎中的部分细胞在目标位点携带突变。

如果操作得当，掌握该技术后，对一批100个胚胎进行操作仅需一个多小时。在尝试该实验流程时，需牢记：提高技术水平和胚胎存活率需要反复练习和足够的耐心。在完成该操作后，可进一步采用共聚焦显微镜等其他方法，以研究增强子表达的详细模式。

此外，可以通过将基因组编辑的鱼类进行杂交培养，以研究由诱导突变引起的表型。该技术在建立之后，为进化与发育遗传学领域的研究人员提供了研究刺鱼中基因调控与功能的新途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何对刺鱼胚胎进行显微注射以实现转基因和基因组编辑。