显微注射转基因的基因组，并在编辑Threespine刺鱼
May 13th, 2016
转基因操作和基因组编辑是功能测试基因和顺 -regulatory元素的作用是至关重要的。此处的基因组修饰（包括TOL2介导的荧光报道基因构建体，TALENS和CRISPRs）的生成的详细显微注射协议提出了紧急模型鱼的三刺。
这种显微注射技术的总体目标是生成转基因和基因组编辑的粘背鱼，以测试基因和增强子功能。这种方法可以帮助回答发育和进化遗传学中的关键问题，例如基因和增强子如何发挥作用以产生体型。该技术的主要优点是它可以有效地生成转基因鱼以进行功能遗传分析。
根据文本方案制备 toll 两个质粒和 mRNA 后，从硼硅酸盐玻璃中拉出至少四个微量移液器针。垂直存放在毛细管储存罐中，尖端朝下。要使多达 100 个粘背鱼卵受精，请加入 50 微升精子溶液，并使用移液器吸头轻轻搅拌以确保所有卵子受精。
在冰上工作时，将 0.5 微升注射液移液到针头的平端，并让其排空，回填至少三个针头。同时，打开解剖显微镜的透照灯，将 13 平方厘米的玻璃板放在显微镜灯座上，玻璃板顶部有 15 厘米的石膏锯片。将锯垂直于注射装置的方向，使凹痕朝向持针器，然后打开控制箱并确保压力设置为约 175 千帕。
将注入持续时间设置为 180 毫秒。接下来松开持针器，然后将装满的针头插入持针器中，直到感觉到橡胶持器的阻力，然后拧紧持针器，直到用手拧紧。然后将针角度调整到大约 45 度。
使用显微作器控件调整指针，使指针末端在视野中居中。放大约 40 倍并聚焦于针尖，它不应接触下面的玻璃。用制表师的镊子抓住针尖，从末端起两到三镊子宽，然后以 60 度角轻轻折断针尖。
然后踩下注射脚踏板数次，测试针头是否断裂。轻点几下后，微小的红色液滴应该开始从末端出来。使用一次性移液管将几滴粘背水滴在玻璃板上。
轻轻地将针头放入水中，然后增加背压，直到针头中流出淡淡的粉红色液体。尽可能缩回针头，以免在准备胚胎时损坏它。受精后约 25 分钟，使用两个 10 微升移液器吸头从离合器中取出 5 到 10 个胚胎并转移到玻璃板上。
使用移液器吸头，小心地将胚胎轻轻地分成锯片的各个凹痕中，不要刺穿胚胎。接下来，用移液管加入足够的粘背水以覆盖胚胎。然后在 3 到 5 秒后，去除大部分水，只留下一小块覆盖每个胚胎。
从最远的胚胎开始，滑动玻璃板并放大胚胎，使其填满大约 25% 的视野。将针头放入视野中，然后使用 10 微升移液器吸头轻轻旋转胚胎以识别卵裂球，卵裂球是卵黄顶部一个颗粒状、略带黄色、凸起的细胞质凸起。旋转胚胎，使卵裂球直接垂直于针头末端。
降低针头，缓慢均匀地施加压力以刺穿果核，然后将针头插入细胞质，不要将其推入下面的蛋黄。踩下脚踏板 3 到 4 次进行注射，使边缘略微扩散的红色团块填充细胞质直径的大约 1/8。有一个垂直于冠状体的锋利针将促进这一步。
限制添加的水量将有助于保持 corion 柔软。最后，靶向细胞质将增加获得转基因动物的可能性。使用显微作器控件缩回针头，并使用 10 微升移液器吸头，如果胚胎粘在针头上，请按住胚胎。
缩回针头后，滑动玻璃板，将下一个胚胎与针头对齐，然后重复注射。注射完所有胚胎后，使用末端被切断的移液管向板中加水。然后使用移液管收集胚胎并将它们放入装满粘背水的 150 毫米培养皿中。
在 18 摄氏度下孵育胚胎。注射后 1 天，轻轻倒掉粘背水，然后换上淡水。检查死亡或畸形胚胎并取出以防止污染。
如此处所示，对于具有增强子活性的转基因，成功注射会导致转基因的特异性细胞表达。例如，在胸鳍和正中鳍以及脊索中。然后可以杂交注射的鱼以产生稳定的品系，例如这种在受精后 4 天驱动胚胎心脏中 GFP 表达的背部稳定品系。
对于活性增强子，40% 到 50% 的胚胎将显示组织特异性转基因表达，例如，在正中鳍和胸鳍中。高达 100% 的 GFP 阳性 F0 鱼表达 toll 两个质粒转基因产生转基因后代。然而，携带转基因的后代的百分比差异很大，从不到 1% 到 72% 不等。
仅保存 GFP 阳性注射的胚胎通常会提高传播效率。只有高达 10% 的 F0 反向注射的粘背胚胎在预期组织中显示荧光。此外，backs 的传递率低于质粒构建体的传递率。
只有高达 14% 的筛选粘背鱼传播背部。与反向转基因的低效率相比，注射爪子的鱼中有 70% 到 100% 有马赛克病变。在这里，每个注射胚胎中未切割的 PCR 扩增子表明每个胚胎中的一些细胞在目标基因座处携带病变。
一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在一个多小时内完成，一窝 100 个胚胎。在尝试此程序时，重要的是要记住，需要练习和耐心来提高技术和胚胎存活率。在此程序之后，可以使用其他方法（例如共聚焦显微镜）来回答有关增强子表达详细模式的进一步问题。
此外，基因组编辑的鱼可以交叉生长以研究诱导突变引起的表型。发展之后，这项技术为进化和发育遗传学领域的研究人员研究粘背鱼的基因调控和功能铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何注射粘背胚胎进行转基因和基因组编辑有了很好的了解。
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概览
本文介绍了一种详细的微注射协议，用于在三刺鳅鱼中生成基因组修饰。该方法专注于转基因操作和基因组编辑技术，包括Tol2介导的构建体、TALENs和CRISPRs。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 发育生物学
- 进化生物学
背景
- 转基因和基因组编辑技术对于基因的功能测试至关重要。
- 三刺鳅鱼作为一个新兴的模式生物。
- 理解基因和增强子功能对发育和进化遗传学至关重要。
- 这种微注射技术可以有效地生产转基因鱼。
研究目的
- 生成转基因鳅鱼用于功能基因分析。
- 调查基因和增强子在体型模式生成中的作用。
- 提供测试基因功能的可靠方法。
使用的方法
- 根据协议准备Tol2质粒和mRNA。
- 微注射到受精的鳅鱼卵中。
- 使用微量移液器针进行精确注射。
- 用精子溶液使卵受精以成功发育。
主要结果
- 微注射技术成功地生成了转基因鳅鱼。
- 高效生产遗传修饰生物进行分析。
- 促进了基因和增强子功能的探索。
- 有助于理解发育和进化过程。
结论
- 这种方法是遗传学研究者的有价值工具。
- 它增强了研究复杂遗传相互作用的能力。
- 未来应用可能扩展到其他模式生物。
常见问题
Executive Industry Relevance
Microinjection-based transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks enables direct functional interrogation of candidate genes and regulatory elements in a vertebrate model with high phenotypic diversity. This capability supports mechanistic de-risking and target validation at the earliest stages of discovery, providing predictive confidence for gene function and regulatory architecture. The approach is strategically positioned for portfolio triage and prioritization of genetic targets in developmental and evolutionary contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional testing of candidate genes and enhancers identified from mapping studies.
- Supports mechanistic de-risking by allowing targeted genome editing with TALENs and CRISPR/Cas9.
- Facilitates validation of gene regulatory elements using transgenic reporter assays.
- Provides predictive confidence for gene-phenotype relationships in a vertebrate system.
Screening & Assay Development
- Prepares validated transgenic and genome-edited lines for downstream phenotypic screening.
- Standardizes microinjection and selection protocols to ensure reproducibility and quantitative assessment of transgenesis efficiency.
- Enables scalable production of genetically modified embryos for assay development.
- Supports reliable evaluation of gene function and regulatory activity in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic manipulation with disease-relevant phenotypes and evolutionary adaptations.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical model development in a vertebrate context.
- Enables risk-adjusted advancement of genetic targets based on functional outcomes.
- Supports the establishment of stable lines for longitudinal and cross-generational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection protocol integrates into the discovery continuum from candidate gene identification to functional validation and preclinical model generation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through direct gene and enhancer manipulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for transgenesis and genome editing efficiency.
- Analytics: Enables measurement of transgene expression and mutation rates to compare experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in a vertebrate system with diverse phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic manipulation applicable to multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for genetic manipulation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets across programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microinjection and embryo handling.
- Needs access to specialized instrumentation such as micromanipulators and dissecting microscopes.
- Demands cross-team standardization of injection and selection protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different genetic constructs or model systems.
- Efficiency and transmission rates can vary by construct type and must be empirically determined.
