Name: 显微注射转基因的基因组，并在编辑Threespine刺鱼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 了解显微注射技术在三刺鱼中生成转基因和基因组编辑的方法。该技术利用Tol2质粒、TALENs和CRISPRs等工具，为发育与进化遗传学研究提供高效的基因功能分析手段。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）R01 #DE021475（CTM）、NIH 预博培训基金 5T32GM007127（PAE）以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金（NAE）资助。我们感谢 Kevin Schwalbach 进行 BAC 重组工程和显微注射操作，Nick Donde 提供 CRISPR Sanger 测序数据，以及 Katherine Lipari 对注射方案提出的有益反馈。

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<li>Colosimo, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+parallel+evolution+in+sticklebacks+by+repeated+fixation+of+Ectodysplasin+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles.</a> Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
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<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
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<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> EvoDevo. 5 (1), (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对三刺鱼胚胎进行单细胞显微注射以实现转基因或基因组编辑时，主要面临三个挑战。首先，与斑马鱼胚胎相比，三刺鱼胚胎的卵膜较为坚韧，常常导致注射针头断裂。该问题可通过使用更粗、更坚固的玻璃毛细注射针，并以垂直于卵膜的角度进行注射来部分解决（参见实验方案，图2）。确保加入胚胎的水量尽可能少（仅需使卵膜膨胀并脱离细胞即可），有助于降低卵膜硬度。卵膜会随着时间推移而逐渐硬化，因此在湿润胚胎后应尽快完成操作。在注射前将胚胎置于湿度恒定的培养环境中，防止其干燥，也至关重要。某些卵块甚至个别胚胎的卵膜天然更厚更坚韧；此时，跳过当前胚胎或更换另一批卵块可能是最简便的解决方案。与其更换损坏的针头，不如直接跳过一个难以注射的胚胎更为高效。准备备用针头可在针头断裂时确保注射持续进行。在注射BAC（细菌人工染色体）时，针头常会发生堵塞。此时可通过镊子轻轻刮擦或重新折断针尖，或使用恒定气压开关冲洗针道，以清除堵塞物。
其次，识别胚胎中的第一个细胞具有挑战性；该细胞通常非常扁平，初学者很难观察到，尤其是直接观察时尤其难以看见。通常只能从侧面看到卵裂球呈现为略微隆起的小突起。因此，...

理解生物多样性产生机制的一个基本组成部分是确定自然界中进化表型变化的遗传和发育基础。三刺棘背鱼（Gasterosteus aculeatus）已成为研究进化遗传基础的优秀模式生物。随着海洋鱼类不断迁入北半球无数的淡水环境，棘背鱼经历了多种适应性进化改变，导致了显著的形态学、生理学和行为学变化1。已有21个棘背鱼种群个体的基因组被测序并完成组装，并构建了高密度连锁图谱以进一步优化基因组组装质量2,3。遗传定位实验已鉴定出控制进化表型的基因组区域4-6，在少数情况下，特定候选基因的功能作用也已得到验证7,8。目前已发现多个与形态变化相关的基因组区域，并提出了有潜力的候选基因，但这些候选基因尚未经过功能验证9-12。此外，棘背鱼也是种群遗传学/基因组学13,14、物种形成15、行为学1、内分泌学16、生态毒理学17、免疫学18和寄生虫学19研究中常用的模型生物。未来在这些领域的研究都将受益于在棘背鱼中进行功能遗传操作的能力。除了对编码序列进行操作外，还可通过研究候选基因的cis-调控序列，或功能性地增强、减弱或消除候选基因的表达来评估其作用。棘背鱼中的显微注射和转基因技术已较为成熟7,8,20，最初采用的是基于巨核酸酶介导的方法21，该方法最早在青鳉鱼中被描述22。本文所介绍的改进版显微注射方法已针对Tol2介导的转基因以及近年来发展的基因组编辑工具（包括TALENs和CRISPRs）进行了优化。
人们认为，cis-调控元件的改变对形态进化至关重要，因为cis-调控变化可以避免编码区突变带来的负面多效性后果23。因此，检测和比较假定的cis-调控序列已成为越来越多进化研究的核心目标。此外，大多数人类疾病相关变异属于调控性变异24,25，而研究cis-调控元件的功能与调控机制迫切需要合适的模式脊椎动物系统。体外受精且产卵数量大的鱼类为研究cis-调控提供了强有力的脊椎动物模型。Tol2转座子系统可高效地将质粒构建体整合到鱼类基因组中，该系统将待整合的外源DNA置于Tol2转座酶结合位点之间，并与Tol2转座酶mRNA共注射26-28。通常，将潜在的增强子克隆至基础启动子（如hsp70l29）上游，并插入Tol2载体中，与EGFP（增强型绿色荧光蛋白）或mCherry等荧光报告基因连接，随后与转座酶mRNA共同注射26。通过观察荧光报告基因在注射后胚胎或稳定整合转基因后代中的表达情况，可获得该假定增强子驱动基因表达的时空调控信息。在后续实验中，经验证的增强子可用于驱动目的基因在特定组织中的过表达。
用于较大样本的分析 顺式-调控区域，已利用细菌人工染色体（BACs）为海洋和淡水刺鱼构建了高质量的大片段基因组文库30这些BAC可通过重组工程技术，在长达150-200 kb的基因组区域内，将目标基因替换为荧光报告基因。31荧光报告基因随后将根据BAC内调控序列决定的时空模式进行表达。在鱼类研究中，可在BAC上添加Tol2位点以促进其基因组整合32,33发育的后期阶段，当 原位 杂交在技术上具有挑战性，但BAC的荧光读出可用于研究基因表达模式，这一点已在刺鱼中得到证实 骨形态发生蛋白6 (Bmp6)20此外，可以对个体中的荧光表达模式进行随时间追踪，而这是传统方法无法实现的 原位 杂交。BAC还可用于添加基因组区域的额外拷贝，以增加目的基因的剂量。
在基因功能研究中，基因组编辑是一个迅速发展的领域，可用于在多种生物体中对基因组序列进行靶向修饰34。转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）是一类模块化、序列特异性的核酸酶，最初来源于植物病原体，可被精确设计以直接结合特定的基因组序列，并产生双链断裂35,36。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas系统最初在细菌中发现，利用向导RNA和Cas9&#160;蛋白在与向导序列互补的目标DNA序列上造成断裂37。TALENs和CRISPR介导的双链断裂在后续修复过程中常导致小片段的插入或缺失，从而破坏目标序列的功能35-37。在刺鱼中，TALENs已被用于靶向增强子以干扰基因表达20，而TALENs和CRISPR均已在编码序列中成功诱导突变（未发表数据）。针对斑马鱼设计CRISPR的详细实验方案可作为开发刺鱼CRISPR工具的参考指南38。
转基因和基因组编辑实验需要将核酸导入新受精的单细胞胚胎中。通过在发育早期引入转基因或基因组编辑工具，可使胚胎中遗传操作的子代细胞数量最大化。随后对注射后的胚胎进行荧光观察或分子检测，以筛选基因组修饰。如果成功靶向了生殖系来源的细胞，即使注射后胚胎致死率较高，转基因或突变仍可传递给部分子代。嵌合体鱼可通过杂交或互交，并对其子代进行筛选，以获得目标突变等位基因或稳定整合的转基因。本方案描述了将转基因和基因组编辑试剂导入单细胞刺鱼胚胎，并检测基因组修饰是否成功的方法。

<table><tbody><tr><td>带透射照明的体视显微镜</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>手动显微操作器</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 显微操作器</td></tr><tr><td>压力注射系统</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>背压单元</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器固定夹具套装</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>磁性底座夹具</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic base</td><td></td></tr><tr><td>脚踏开关</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>铁板（磁性底座）</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>一次性转移移液管</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 中的 0.5% 酚红</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P0290</td><td>注射示踪剂</td></tr><tr><td>#5 镊子，biologie dumoxel&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>用于折断针头</td></tr><tr><td>微量移液器储存罐</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>用于存放针头</td></tr><tr><td>6&quot;，每英寸6齿的石膏板锯</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>用于固定卵进行注射</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm 玻璃板</td><td>任意五金商店</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管，外径1.0 mm/内径0.58 mm&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*比斑马鱼注射用毛细管更硬的玻璃</td></tr><tr><td>150 x 15 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>用于三刺鱼胚胎培养</td></tr><tr><td>35 mm × 10 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>用于注射前储存卵</td></tr><tr><td>Instant Ocean 海盐</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>鱼类麻醉/安乐死剂</td></tr><tr><td>Sp6 转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>用于TALENs和转座酶mRNA的体外转录</td></tr><tr><td>RNeasy 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>纯化转座酶或TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>用于纯化注射用质粒</td></tr><tr><td>蛋白酶K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>用于DNA制备</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 试剂盒</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>用于BAC DNA制备</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 聚合酶</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>含内毒素冲洗缓冲液</td></tr><tr><td>QIAQuick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704&amp;nbsp;</td><td>用于测序诱导突变</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（分子生物学级）</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-乙酸-EDTA 缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb RNA 标准品</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&amp;nbsp; 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA 标准品</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12联排PCR管</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

三刺鱼转基因与基因组编辑的显微注射技术

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

三刺棘背鱼已成为研究多种形态学、生理学和行为表型遗传基础的有力模型系统。随着海洋种群适应无数淡水环境而演化出极为多样的表型，加之海洋型与淡水型之间可进行杂交，这为脊椎动物中罕见的遗传研究体系提供了可能，使得研究人员能够利用遗传学方法定位控制演化性状的基因组区域。目前已有优质的基因组资源，有助于对演化改变进行分子遗传学解析。尽管基因定位实验能够产生一系列有趣的候选基因列表，但仍需通过功能遗传操作来验证这些基因的作用。利用Tol2转座酶系统将转基因报告质粒和BAC整合到基因组中，可研究基因调控。通过TALEN和CRISPR/Cas9基因组编辑工具诱导靶向突变，可评估特定候选基因及cis-调控元件的功能。所有这些方法均需将核酸导入受精后的单细胞棘背鱼胚胎，但由于棘背鱼胚胎具有较厚的绒毛膜以及相对较小且薄的卵裂球，该操作颇具挑战性。本文详细描述了将核酸显微注射至棘背鱼胚胎的操作流程，适用于转基因和基因组编辑研究，以分析基因表达与功能，并介绍了评估转基因成功与否及建立稳定品系的技术方法。

对于具有增强子活性的报告基因转基因，成功注射将导致转基因在特定细胞中表达（图4A，4C）。注射后的鱼可与野生型鱼杂交，以建立稳定品系（BAC稳定品系示例如图4B所示）。将DNA注射到刺鱼胚胎中通常比单独注射RNA导致更高的致死率。注射Tol2报告基因构建体后，通常会观察到高达50%（有时甚至更高）的胚胎死亡或畸形（见图4D-F，4I），这与先前描述的巨核酸酶方法21类似。然而，结果会因具体构建体、胚胎形态以及操作者技术水平而有较大差异。对于具有活性的增强子，通常有40–50%的胚胎会表现出组织特异性转基因表达，例如在中鳍和胸鳍中（图5）。背景荧光及非特异性荧光（图4G-I）的程度因所用启动子的不同而差异显著；斑马鱼hsp70l启动子...

转基因操作和基因组编辑对于功能验证基因和cis-调控元件的作用至关重要。本文针对新兴的模式鱼类——三刺棘背鱼，详细介绍了用于产生基因组修饰（包括Tol2介导的荧光报告转基因构建体、TALENs和CRISPRs）的显微注射方案。

三刺棘背鱼已成为研究多种形态学、生理学以及……遗传基础的有力模型系统。

本显微注射技术的总体目标是生成转基因及基因组编辑的刺鱼，以验证基因和增强子的功能。该方法有助于回答发育与进化遗传学中的关键问题，例如基因和增强子如何发挥作用以形成身体图式。该技术的主要优势在于能够高效地生成用于功能遗传学分析的转基因鱼类。根据文本方案制备好两种质粒和 mRNA 后，从硼硅酸盐玻璃毛细管中至少拉制四根显微注射针。将注射针尖端朝下垂直存放于毛细管储存罐中。为使多达一百枚刺鱼卵受精，加入 50 µL 精子溶液，并用移液器吸头轻轻搅拌，确保所有卵子均完成受精。在冰上操作时，用移液器吸取0.5 µL注射溶液注入针头的钝端，使溶液自然流出，至少重复此操作填充三根针头。同时，打开解剖显微镜的透射光源，在显微镜光源底座上放置一块13 cm²的玻璃板，并将一片15 cm的石膏锯片置于玻璃板上方。将锯片垂直于注射装置放置，使其凹槽一侧朝向针头架，然后打开控制盒，确保压力设定在约175 kPa。将注射持续时间设置为180毫秒。接着松开针头夹持器，将装满液体的针头插入夹持器，直至感受到橡胶夹持器的阻力，然后用手拧紧针头夹持器至手指拧紧程度。随后调节针头角度至约45度。使用显微操作仪的控制装置调节针头，使针尖位于视野中央。将放大倍数调至约40倍，并对准针尖聚焦，确保针尖未接触下方的玻璃表面。用钟表匠镊子夹住针尖末端上方约两至三个镊子宽度的位置，轻轻以60度角折断针尖。然后多次按压注射脚踏板，以检测针头是否断裂。轻踏几次后，针尖应开始出现微小的红色液滴。使用一次性移液器吸取几滴刺鱼水，滴加到玻璃载片上。轻轻将针头放入水中，然后逐渐增加回压，直至针尖出现微弱的粉红色液体细流。将针头尽可能缩回，以免在准备胚胎时受损。受精后约25分钟，使用两个10微升移液器吸头从受精卵团中取出5至10个胚胎，转移至玻璃培养皿中。用移液枪头小心地将胚胎逐一分开，放入锯片的各个凹槽中，注意不要刺破胚胎。接着用移液管加入足量的刺鱼水，以浸没胚胎。然后等待三到五秒后，吸去大部分液体，仅留下少量液体覆盖每个胚胎即可。从最远处的胚胎开始，移动载玻片并放大胚胎，使其大约占据视野的25%。将显微针 lowered 至视野中，然后使用10微升移液枪头轻轻旋转胚胎，以识别卵裂球——即位于卵黄顶部的一粒略呈黄色、质地粗糙且略微隆起的细胞质突起。旋转胚胎，使卵裂球与显微针末端完全垂直。缓慢而均匀地施加压力，降低针头以刺穿绒毛膜，并将针头插入细胞质中，注意不要穿透下方的卵黄。踩下脚踏板三到四次进行注射，使红色团块略微扩散边缘，体积约占细胞质直径的1/8。保持针头锋利且垂直于绒毛膜，有助于完成此步骤。控制加入的水量有助于保持卵壳柔软。最后，以细胞质为注射目标可提高获得转基因动物的几率。使用显微操作仪的控制装置将注射针回撤，并用10 µL移液器吸头按住胚胎，以防其黏附在注射针上。拔出针头后，移动玻璃板使下一个胚胎与针头对

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

显微注射转基因的基因组，并在编辑Threespine刺鱼

显微注射是一种成熟且有效的方法，可用于将外源物质导入受精的斑马鱼胚胎中。本文中，我们展示了一种可靠的显微注射技术，用于在斑马鱼中进行mRNA过表达以及吗啉代寡核苷酸基因敲降研究。...

斑马鱼胚胎中mRNA和吗啉代反义寡核苷酸的显微注射

来源： Chen, S., et al., 新生小鼠脑纹状体细胞遗传学操作的立体定位手术。J. Vis. Exp. (2018)本视频演示了将编码 Cre 重组酶和绿色荧光蛋白（GFP）的病毒载体通过立体定位注射至基因改造小鼠幼崽的纹状体，以切除两侧带有 loxP 位点的 STOP...

立体定向显微注射病毒载体用于小鼠幼崽纹状体的基因操作

利用基因组编辑技术，现在可以在多种生物体中实现基因靶向诱变。本文以Astyanax...

使用转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）对墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus）进行基因组编辑

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在斑点叉尾鮰胚胎中进行基因编辑的简单高效的显微注射方案。在该方案中，将引导RNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞胚胎的卵黄中。本方案已通过敲除两个与斑点叉尾鮰免疫相关的基因得到验证。...

将CRISPR/Cas9蛋白显微注射入斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）胚胎中进行基因编辑

对Nasonia vitripennis胚胎进行显微注射是实现可遗传基因组修饰的关键方法。本文详细描述了Nasonia...

用于Nasonia vitripennis基因组操作的胚胎显微注射与移植技术

本方案旨在演示如何将DNA/DOTAP混合物显微注射到一天龄Xenopus...

Xenopus laevis 胚胎眼芽中DNA的显微注射及完整活体Xenopus蝌蚪中表达GFP的视神经轴突丛的成像

本文介绍了一种用于制备和培育CRISPR/Cas9基因组敲除电鱼的实验方案。详细阐述了开展该实验所需的分子生物学操作、繁育条件和饲养要求，适用于一种裸背电鳗目（gymnotiform）和一种长颌鱼科（mormyrid）电鱼，并介绍了通过显微注射技术获得Cas9诱导的F0代插入缺失（indel）幼鱼的方法。...

沉默电火花：利用CRISPR/Cas9在弱电鱼中进行基因组编辑

本方案描述了一种蜱胚胎显微注射的方法。胚胎注射是进行遗传操作以建立转基因品系的首选技术。...

黑足蜱 Ixodes scapularis 基因编辑的胚胎注射技术

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

了解显微注射技术在三刺鱼中生成转基因和基因组编辑的方法。该技术利用Tol2质粒、TALENs和CRISPRs等工具，为发育与进化遗传学研究提供高效的基因功能分析手段。

三刺鱼转基因与基因组编辑的显微注射技术

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