单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

本实验的总体目标是使用一系列微流控设备从数万个单细胞中生成条形码基因组测序数据。该方法实现了无与伦比的单细胞测序通量。我们使用微流控技术单独封装、裂解和标记细胞，保留潜在的基因组异质性，这在测序研究中的传统休克中丢失了。

该技术的主要优点是吞吐量高，能够从数以万计的细胞中产生单细胞数据。尽管我们在本演示中处理的是微生物，但通过对微流体装置的尺寸进行微小修改，工作流程可以适应不同的细胞类型。开始实验步骤时，在 1X Tris-EDTA 或 TE 缓冲液中制备 1 毫升每体积重量为 3% 的低熔点温度琼脂糖。

将琼脂糖溶液放在 90 摄氏度的加热块上，直到注射器加载。将细胞重悬于一毫升磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，然后旋转细胞。吸出上清液，将细胞沉淀重悬于一毫升 17% 体积到体积密度梯度培养基中的 PBS 中，并将细胞保持在冰上，直到注射器加载。

接下来，在一个 3 毫升注射器中加入氟化油 （HFE），每重量含有 2% 重量的 PFPE-PEG 表面活性剂。用 27 号针头装上它，然后将其放入注射泵中。将细胞悬液和熔融琼脂糖装入 1 毫升注射器中，均配有 27 号针头，然后放入注射泵中。

然后，将空间加热器设置为高，并将加热表面放置在距离注射器 10 厘米的位置。确保在注射器处测得的温度约为 80 摄氏度。在将管子插入设备之前，灌注泵以去除管路中的空气。

使用聚乙烯 （PE） 管将注射器针头连接到微流体设备入口。将一根管路连接到出口，并将自由端放入 15 毫升收集管中。液滴后，将收集管置于 4 摄氏度下 30 分钟，以确保琼脂糖完全凝胶化。

使用装有 20 号针头的 3 毫升注射器从收集管中取出下层油，注意不要干扰琼脂糖液滴的顶层。在 HFE 中加入每体积 1 毫升 10% 体积的 PFO，以破坏其表面活性剂层上的琼脂糖滴。上下移液 1 分钟以彻底涂覆乳液，乳液应均匀且无结块。

将锥形管以 2， 000 次 g 旋转 1 分钟以收集琼脂糖微凝胶。吸出 PFO/HFE 上清液，并确保微凝胶现在没有表面活性剂层并且是透明的。洗涤微凝胶后，用 1X 核酸染色剂对 10 μL 等分试样凝胶进行染色，在显微镜下以 400X 放大倍率验证微凝胶中的细胞包膜。

用一小块铅焊料塞住 co-flow dropmaker 设备的电池入口。在将管子插入设备之前，灌注泵以去除管路中的空气。将一根管子连接到出口，然后将自由端放入 0.2 毫升 PCR 管中。

使用屏幕上的流速进行 dropmaking。将液滴收集到 PCR 管中，每管中约有 50 微升液滴。液滴后，使用凝胶加载移液器吸头小心地从乳液中去除下层 HFE 油，并用含有每重量 5% PFPE-PEG 表面活性剂的 FC-40 氟化油代替。

然后，对热循环进行编程。在将管子插入设备之前，灌注泵以去除管路中的空气。使用 PE 管将含有 HFE、tagmentation mix 和微凝胶的注射器连接到微流体装置入口。

将一根管子连接到出口，将自由端放入一个空的 1 毫升注射器中，柱塞拉到 1 毫升的管线上。接下来，在光学显微镜下以 400 倍放大倍率验证微凝胶包封速率。用针头装入含有酶切分乳剂的注射器，并在 55 摄氏度的加热块或烘箱中直立孵育 1 小时，以片段化基因组 DNA。

通过将 FC-40 油馏分替换为 HFE 每重量 2% 重量 PFPE-PEG，准备用于合并的条形码液滴。小心地将滴剂转移到 1 毫升注射器中，用针头装上，然后将其放入注射泵中。将孵育和标记的微凝胶液滴注射器装入注射泵中。

接下来，使用 PE 管将三个氯化钠注射器连接到两个电极入口和单个沟槽入口。在将管子插入设备之前，灌注泵以去除管路中的空气。使用 PE 管将安装在泵上的三个 HFE 注射器连接到两个间隔油入口和液滴制造油入口。

然后，在将管路连接到注射器针头之前，用抗静电枪射击所有液滴再注射管。使用 PE 管将 PCR 混合注射器、微凝胶滴注射器和条形码滴注射器连接到各自的入口。使用鳄鱼夹将电极注射器的针头连接到冷阴极荧光逆变器。

将逆变器的直流电源设置为 2 伏。以推荐的流速运行双合并装置。将液滴收集到 PCR 管中，每管中含有大约 50 微升乳剂。

在热循环之前，使用凝胶加载移液器吸头小心地从乳液中去除下层 HFE 油，并用含有每重量 5% PFPE-PEG 表面活性剂的 FC-40 氟化油代替它们。然后，对循环进行编程。为了从热循环液滴中回收 DNA，将液滴汇集到微量离心管中，并使用 20 μL PFO 打破乳剂。

将它们涡旋 10 秒钟以混合。旋转管子。使用移液管小心地从试管中取出上层水层，然后将其转移到新的微量离心管中。

丢弃油相。然后，最后进行文库制备、测序和分析步骤。条形码计数与组大小的直方图显示，有效条形码组的很大一部分略高于每组阈值大小的 7.5 kb 对，这不包括 PCR 突变的孤立细胞。

通过计数原始读数和条形码组来计算来自 3 个革兰氏阴性菌、5 个革兰氏阳性菌和 2 个酵母菌的合成 10 细胞群落的细胞类型的相对丰度。来自所有条形码组的枯草芽孢杆菌读数的圆形覆盖图说明了 SiC-seq 读数的一致性，没有可观察到的丢失区域，平均覆盖率为 5.55 倍。通过标准化覆盖率值的频率分布验证覆盖率的均匀性。

在尝试此过程时，重要的是要保持每 10 个液滴大约 1 个条形码或细胞的包埋率。这限制了双重封装事件的可能性，因为双重封装事件可能会使单个单元数据变得复杂。观看此视频后，您应该对如何设置和作用于生成单细胞测序数据的微流控设备有很好的了解。

一旦掌握，这项技术可以在 8 小时或两天 4 小时内运行。