一种用于单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

本实验的总体目标是利用一系列微流控装置，从数万个单细胞中生成带有条形码的基因组测序数据。该方法实现了前所未有的单细胞测序通量。我们采用微流控技术对细胞进行 individually 封装、裂解和条形码标记，从而保留了基因组异质性，而这种异质性在传统的群体测序研究中会丢失。

该技术的主要优势在于通量高，能够从数万个细胞中获得单细胞数据。尽管本演示中使用的是微生物，但通过微调微流控装置的尺寸，该流程可经适当修改后适用于其他类型的细胞。开始实验前，配制1毫升3%（质量/体积）低熔点琼脂糖溶液，溶于1× Tris-EDTA（即TE）缓冲液中。

将琼脂糖溶液置于90摄氏度的加热块上，直至准备用注射器加样。用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，并离心细胞。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于一毫升含17%体积比密度梯度介质的PBS溶液中，并在加样前将细胞置于冰上保存。

接下来，用含有2%（质量分数）PFPE-PEG表面活性剂的氟化油（HFE）填充一支3毫升的注射器，安装27号针头，并将其放入注射泵中。将细胞悬液和熔融琼脂糖分别装入两支1毫升注射器中，每支均安装27号针头，并置于注射泵中。

然后，将电暖器调至高温档，并使加热面距离注射器10厘米。确保在注射器位置测得的温度约为80摄氏度。在将管路插入设备之前，需先启动泵以排空管路中的空气。

使用聚乙烯（PE）管将注射器针头连接到微流控装置的入口。将一段管路连接至出口，并将游离端放入15毫升收集管中。液滴生成后，将收集管置于4摄氏度环境中30分钟，以确保琼脂糖完全凝胶化。

使用带有20号针头的三毫升注射器从收集管中移除下层油相，注意不要扰动上层的琼脂糖液滴。加入一毫升体积分数为10%的PFO（HFE中的全氟辛烷），以破坏琼脂糖液滴的表面活性剂层。用移液器上下吹打溶液一分钟，使乳液充分混匀并完全被包裹，确保乳液均匀且无团块。

将锥形管在2,000 × g条件下离心1分钟，以收集琼脂糖微凝胶。吸除PFO/HFE上清液，并确保微凝胶已完全去除表面活性剂层且变得透明。洗涤微凝胶后，取10 µL凝胶样品，用1×核酸染料染色，然后在显微镜下以400倍放大倍数观察，验证细胞在微凝胶中的包封情况。

用一小段铅焊料堵住共流式液滴发生装置的细胞进样口。在将管路插入装置之前，先启动泵以排空管路中的空气。将一段管路连接至出口，并将游离端放入一个0.2毫升的PCR管中。

使用屏幕上的流速进行液滴制备。将液滴收集到PCR管中，每管约50微升。液滴制备完成后，使用加样枪头小心移除乳液下层的HFE油，并替换为含有5%（质量分数）PFPE-PEG表面活性剂的FC-40氟化油。

然后，设置热循环程序。在将管子插入设备之前，启动泵以排出管路中的空气。使用PE管将装有HFE、标签化混合物和微凝胶的注射器连接到微流控装置的入口。

将一段管路连接至出口，并将游离端放入一个空的1毫升注射器中，活塞拉至1毫升刻度线处。接着，在400倍光学显微镜下验证微凝胶包封率。为含有标签化乳液的注射器安装一根针头，并将其直立放入55摄氏度的加热块或烘箱中孵育一小时，以片段化基因组DNA。

通过将FC-40油相替换为含2%（重量/重量）PFPE-PEG的HFE，准备用于融合的条形码液滴。小心地将液滴转移至一支1毫升注射器中，安装针头后放入注射泵。将孵育后的带标签片段化微凝胶液滴注射器装入另一注射泵中。

接下来，使用PE管将三个氯化钠溶液注射器连接到两个电极入口和一个护城槽入口。在将管路插入装置之前，需先启动泵以排空管路中的空气。使用PE管将安装在泵上的三个HFE注射器连接到两个间隔油入口和液滴生成油入口。

然后，在将管路连接至注射器针头之前，先用防静电枪对所有液滴重新注入管路进行放电处理。使用PE管将PCR反应混合液注射器、微凝胶液滴注射器和条形码液滴注射器分别连接至对应的入口。用电极夹将电极注射器的针头连接至冷阴极荧光逆变器。

将逆变器的直流电源设置为两伏。以推荐的流速运行双合并装置。将液滴收集到PCR管中，每管约含50微升乳状液。

在进行热循环之前，使用加样枪头小心地移除乳液中下层的HFE油，并替换为含有5%（质量分数）PFPE-PEG表面活性剂的FC-40氟化油。然后设定循环程序。为从热循环后的液滴中回收DNA，将液滴收集至微量离心管中，加入20 µL PFO破乳。

涡旋混匀10秒。离心管。用移液器小心吸去上层水相，并转移至新的微量离心管中。

弃去油相，随后进行文库构建、测序及分析步骤。条形码计数与组大小的直方图显示，大量有效条形码组的大小略高于每组7.5 kb的阈值，该阈值排除了PCR突变产生的孤儿序列。

通过计数原始测序读段和条形码组，计算了由三种革兰氏阴性菌、五种革兰氏阳性菌和两种酵母菌组成的合成10细胞群落中各细胞类型的相对丰度。来自所有条形码组的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）读段的环形覆盖度图显示了SiC-seq读段的均匀性，未观察到覆盖度下降区域，平均覆盖度为5.55X。通过归一化覆盖度值的频率分布验证了覆盖度的均匀性。

在进行此操作时，重要的是保持每10个液滴中约包含一个条形码或一个细胞的封装率。这可以降低双重封装事件的发生概率，从而避免单细胞数据的混淆。观看本视频后，您应能够充分理解如何设置和操作用于生成单细胞测序数据的微流控装置。

一旦掌握，该技术可在八小时内完成，或分为两个四小时的工作日进行。