Name: 单细胞基因组测序的超高通量微流控平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 了解超高通量微流控单细胞基因组测序技术，通过微凝胶封装和条形码标记实现数万个单细胞的高通量测序。该方法保留基因组异质性，适用于微生物及多种细胞类型的基因组分析。

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本工作得到了美国国家科学基金会职业奖（资助号 DBI-1253293）；美国国立卫生研究院（NIH）（资助号 HG007233-01、R01-EB019453-01、1R21HG007233、DP2-AR068129-01、R01-HG008978）；以及美国国防高级研究计划局生命制造计划（合同号 HR0011-12-C-0065、N66001-12-C-4211、HR0011-12-C-0066）的支持。

<ol><li>Navin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Ni, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+copy+number+variation+patterns+among+single+circulating+tumor+cells+of+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).</li>
<li>Schmidt, H., Hensel, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14726454">Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).</li>
<li>Martínez, J. L., Baquero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+strategies+associated+with+bacterial+infection%3A+pathogenicity+epidemicity%2C+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Liu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+for+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers for single cells.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).</li>
<li>Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+microfluidics+for+digital+quantification+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing.</a> Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+clonal+origins+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+by+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+genome-wide+expression+profiling+of+individual+cells+using+nanoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+labeling+%28Hi-SCL%29+for+RNA-Seq+using+drop-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics.</a> PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).</li>
<li>Amini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-resolved+whole-genome+sequencing+by+contiguity-preserving+transposition+and+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing.</a> Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotyping+germline+and+cancer+genomes+with+high-throughput+linked-read+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).</li>
<li>Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+massively+parallel+single-molecule+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing.</a> Nature Communications. 7, 11784(2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing+at+ultra-high-throughput+with+microfluidic+droplet+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).</li>
<li>Novak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiplex+gene+detection+and+sequencing+with+microfluidically+generated+agarose+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions.</a> Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).</li>
<li>Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lysis+methods+for+the+extraction+of+bacterial+DNA+for+analysis+of+the+vaginal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota.</a> PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn5+transposase+and+tagmentation+procedures+for+massively+scaled+sequencing+projects%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects.</a> Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).</li>
<li>Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beating+Poisson+encapsulation+statistics+using+close-packed+ordering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering.</a> Lab on a Chip. 9 (18), 2628(2009).</li>
<li>Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-based+optical+waveguides+with+live+cell+encapsulation+and+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Optic+Letters%22%5BJournal%5D)">Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics.</a> Optic Letters. 37 (9), 1472(2012).</li>
<li>Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemical-free+breaking+of+microfluidic+emulsions+with+a+hand-held+antistatic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun.</a> Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).</li>
<li>Gole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+polymerase+cloning+and+genome+sequencing+of+single+cells+using+nanoliter+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells.</a> Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).</li>
<li>Chao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+reveals+significant+changes+of+microbial+compositions+and+protective+functions+during+drinking+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment.</a> Scientific Reports. 3 (1), 3550(2013).</li>
<li>Fierer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-biome+metagenomic+analyses+of+soil+microbial+communities+and+their+functional+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).</li>
<li>Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+metagenomic+sequences%3A+methods+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Classification of metagenomic sequences: methods and challenges.</a> Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+droplet+enrichment+for+targeted+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), e86(2015).</li>
<li>Clark, I. C., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+helix+in+a+haystack%3A+nucleic+acid+cytometry+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).</li>
</ol>

与该工作流程相关的专利可能已授权给 Mission Bio，而 Adam R. Abate 是该公司的股东。

SiC-seq 微流控工作流程可从数千个细菌细胞中生成单细胞基因组测序数据。数字条形码被拼接到微凝胶包裹的细胞基因组上，从而允许通过in silico方法将高通量测序（NGS）数据解卷积为来自同一细胞的条形码读段组。为了评估条形码组的纯度，必须使用已知组成的微生物群落进行对照实验。若低纯度组占比较大，表明细胞包封率过高，或在微流控处理步骤中发生了显著的液滴交叉污染。根据泊松统计，条形码与细胞的包封应达到每10个液滴中包含1个颗粒的目标比例，以将多重包封事件的发生率限制在所有非空液滴的5%以下。包封率超过此值将导致双细胞包封率呈指数级上升，因此在液滴生成过程中验证包封比例至关重要。用户应特别警惕单个微凝胶中包封多个细胞的情况，因为共享相同条形码序列的不同细胞所产生的读段无法通过生物信息学手段分离。如果单个细胞获得了两个不同的条形码，则条形码组的纯度不受影响，但在按条形码序列计数时会导致丰度度量出现偏差。
由于合并条件不理想，也可能导致液滴交叉污染。在成功操作过程中，微流控合并装置（图5）可精确地将1个条形码液滴与1个微凝胶及一定体积的PCR试剂可控配对。非理想的流速会导致液滴配对比例错误：例如，1个条形码可能与2个微凝胶配对。本方案中列出的所有流速均为估算值，可能需要根据装置几何结构和液滴尺寸的微小差异进行相应调整。具备高速录像功能相机（&#62;10,000帧/秒）的用户，应在微流控操作开始阶段及整个过程中验证液滴合并的正确性。无高速相机的用户可收集少量合并后的输出液滴，在显微镜下手动测量液滴尺寸。液滴尺寸应保持均一：若存在大量未合并的条形码液滴或微凝胶液滴，则表明需相应降低重注入速率。
在处理微凝胶和微液滴时，应采取若干常规预防措施以保持其完整性。微凝胶虽然具有一定的机械强度，但在进行破碎和洗涤步骤之前必须充分冷却，以确保完全凝胶化。若微凝胶呈现非球形，表明琼脂糖未获得足够时间充分固化。洗涤微凝胶时，应以指定转速离心悬浮液，避免产物损失。琼脂糖水凝胶的折射率与水相近，在离心管中可能难以观察22，因此操作者在吸取液体前应仔细识别凝胶与液体之间的界面。水包油液滴易因实验手套和管路表面积累静电而发生聚并23。因此，我们建议使用徒手加载液滴重注注射器，并在启动泵之前，使用防静电枪处理所有重注管路。可通过缓慢旋转注射器中的乳液，并手动吸取因浮力较大而聚集在上部的较大液滴，从而去除发生聚并的大液滴。
SiC-seq 是首个实现单细胞基因组测序的技术 &#62;50,000 个细菌细胞。该平台在通量方面较现有方法具有显著优势，能够对异质性微生物群落进行更深入的取样。迄今为止，用于单细胞基因组测序的微流控技术均采用微腔结构9 和微孔24 用于细胞分离与扩增，但通量仅限于数十至数百个细胞。将单个细胞通过流式分选进入孔板5,6 不需要专门的微流控仪器，但通量同样较低。鉴于环境中采集的土壤和水样通常具有较高的α多样性 &#62;1,000 个物种水平25,26，SiC-seq 由于能够取样更多数量的生物体而具有显著优势。SiC-seq 的工作流程可适用于来自实验室培养、自然环境或活体宿主的细胞输入。细胞样品只需处于水相悬浮状态，并去除大颗粒即可&#62;10 µm）适用于微流控封装。例如，该方法此前已应用于海水样品，通过一系列洗涤和过滤步骤在封装前对细胞进行预处理17.
SiC-seq 技术从每个单细胞产生的测序数据相对稀疏，可能不适用于所有应用场景。某些生物信息学算法，例如从头基因组组装或单核苷酸变异（SNV）检测，需要更高的测序覆盖深度才能有效运行。作为替代方案，可通过分类学分箱方法27对条形码组进行体外聚类，从而使算法能够应用于更大规模的测序读段集合。此外，SiC-seq 流程整体条形码标记效率相对较低，在输入样本量有限的情况下可能带来挑战。SiC-seq 依赖于符合泊松分布的条形码封装步骤，因此大约仅有 10% 的细胞能够获得分子条形码，并在最终文库构建步骤中被扩增。尽管这一效率与其他基于微滴的条形码技术相当10，但对于珍贵细胞样本的操作者而言，可能难以获得足够的文库产量用于测序，因而可能需要增加最终扩增步骤中的 PCR 循环次数。对于具备微流控技术经验的操作者，另一种潜在解决方案是在数字 PCR 步骤后对携带阳性条形码的微滴进行分选，从而将整体条形码效率提升至&#62;85%28。
SiC-seq 技术未来可能的发展方向之一是将该工作流程适配用于哺乳动物细胞，从而为新的临床单细胞研究铺平道路。例如，对单个癌细胞中拷贝数变异的分析可能加深我们对异质性在癌症病理中作用的理解2。此外，将 SiC-seq 与现有方法相结合，用于探测和富集感兴趣的 DNA 序列29，将实现对细胞亚群或稀有细胞株的靶向单细胞测序。对于环境样本，可靶向已知代谢通路中的基因，并与邻近基因进行上下文联合分析，以鉴定新的基因组岛。在人体宿主环境中，可对低滴度的致病菌样本进行单细胞水平的分离与测序，以更深入地研究其毒力表型的基因型起源。

基因组作为细胞身份和功能的蓝图，包含了生物体全部的编码潜能。在基因组水平上理解细胞生物学，可以解释异质性细胞群体中观察到的表型多样性。这种异质性在生物系统中普遍存在，并对人类健康与疾病具有广泛影响。例如，肿瘤细胞之间的基因拷贝数变异与癌症的发生和扩散密切相关1,2。在细菌感染中，仅存在于少量基因组中的致病岛可通过水平转移导致耐药细菌的增殖3,4。在单细胞水平研究基因组的主要挑战在于可获取的DNA量极低，同时需要分析数千个细胞才能充分取样基因型的全部多样性。由于这些原因，实验通量的限制阻碍了单细胞研究的有效性，导致结果偏向于最丰富的细胞类型。单细胞分离技术，如流式分选5,6、光镊7、包埋于大块凝胶8以及微流控技术9，能够处理数百个细胞用于测序；然而，这仅占大多数样本的一小部分。若能实现通量显著更高的单细胞基因组测序方法，将有助于对细胞群体进行更深入、更全面的分析，从而阐明基因型多样性在这些群体中的作用。
液滴微流控技术能够在数百万个皮升级别的反应器中对细胞和生物试剂进行高通量操控。迄今为止，微液滴技术已被用于研究来自异质组织中细胞间的差异表达模式10,11,12，对长分子进行深度测序13,14,15，以及在单细胞水平上开展染色质免疫沉淀测序（ChiP-seq）分析16。事实上，微液滴具备高通量、区室化操作的能力，因此适用于单细胞基因组学的应用。然而，该技术的发展也面临独特的技术挑战。为了均匀地取样细胞群体，必须以最小的偏差对细胞进行裂解、纯化和扩增。此外，与哺乳动物细胞中的多聚腺苷酸化mRNA转录本不同，基因组中不存在类似的分子基序来促进目标核酸的捕获。由于这些原因，在微液滴平台上实现单细胞基因组测序一直较为困难。
在本研究中，我们提供了一种此前报道的单细胞微流控方法的详细实验方案，该方法能够在单次实验中对数万个细胞的基因组进行测序17。利用这种称为SiC-seq的技术，细菌细胞被包裹在微米级水凝胶中，随后进行单个裂解、标签化（tagmentation）处理，并与含有独特寡核苷酸条形码的微液滴融合；通过一次重叠延伸聚合酶链式反应（PCR），该条形码被连接到细胞的基因组DNA上。水凝胶作为独立的反应容器，可将高分子量的基因组DNA在空间上限制其中，同时允许去垢剂和溶菌酶等小分子进入，从而在条形码标记前实现DNA的裂解与纯化18。本方案可在数小时内处理&#62;50,000个单细胞，最终获得可用于测序的条形码文库。测序完成后，根据各读段所携带的单细胞条形码序列进行解复用（demultiplexing），获得包含数百万条测序读段的数据集，每条读段均带有对应的细胞索引。

<table><tbody><tr><td>3&quot; 硅片，P型，原始测试级</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025 光刻胶</td><td>Microchem</td><td>17030192</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>光掩模</td><td>CadArt Servcies</td><td>(定制)</td><td>参见补充文件中的掩模设计</td></tr><tr><td>PGMEA 显影液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>脱气室</td><td>Bel-Art</td><td>42025</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm 活检打孔器</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片 (75 mm × 50 mm)</td><td>Corning</td><td>294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel（疏水性玻璃处理剂）</td><td>Pittsburgh Glass Works</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>PE-2 聚乙烯管</td><td>Scientific Commodities</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 号针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500 氟化油 (HFE)</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>FC-40 氟化油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>PEG-PFPE 表面活性剂</td><td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant</td><td></td></tr><tr><td>电暖器</td><td>Lasko&amp;nbsp;</td><td>CD09250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a9414</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液 (10X)</td><td>Rockland</td><td>mb-007</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X, pH 7.4</td><td>E&amp;K Scientific Products</td><td>EK-65083</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep（密度梯度介质）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>d1556</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H-全氟-1-辛醇 (PFO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533</td><td></td></tr><tr><td>Span 80（单油酸山梨醇酯）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s6760</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20（聚山梨酯20）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p2287</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶 IV 型</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td></td></tr><tr><td>突变溶菌酶 (Mutanolysin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase（酵母裂解酶）</td><td>Zymo Research</td><td>e1004</td><td></td></tr><tr><td>溶葡萄球菌素 (Lysostaphin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7386</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7.5, 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Teknova</td><td>d9750</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9781</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>New England Biosciences</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 证明（100%）</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I（核酸染料）</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6k</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100（辛基酚聚氧乙烯醚）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA 文库制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex Master Mix（高保真热启动预混液）</td><td>New England Biosciences</td><td>m05365</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Multiplex PCR Master Mix（Taq 预混液）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4464263</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart 2.0 Bst 聚合酶（等温扩增聚合酶）</td><td>New England Biosciences</td><td>m0538m</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT 试剂盒中的 NT 缓冲液（中和缓冲液）</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>冷阴极荧光逆变器</td><td>(定制)</td><td>(定制)</td><td></td></tr><tr><td>直流电源</td><td>Mastech</td><td>HY1503D</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat 3 防静电枪</td><td>Milty</td><td>5036694022153</td><td></td></tr><tr><td>3D 打印离心机注射器支架</td><td>(定制)</td><td>(定制)</td><td>参见补充文件中的 3D 打印文件</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

测序技术已从群体水平转向单细胞分辨率，以应对人们对细胞异质性在生物系统中作用的不断深入理解。然而，大规模单细胞群体的测序因基因组文库制备过程中的技术限制而受到阻碍。本文描述了一种单细胞基因组测序方法（SiC-seq），该方法利用液滴微流控技术对单个细胞的基因组进行分离、扩增和条形码标记。通过将细胞包裹在微凝胶中，可实现DNA的分区纯化与标签化（tagmentation）；同时，微流控融合装置可高效地将每个基因组与唯一的单细胞寡核苷酸条形码配对，使每次运行可测序超过&gt;50,000个单细胞。测序数据通过条形码解复用，生成来源于单个细胞的读段群组。作为一种高通量、低偏差的单细胞测序方法，SiC-seq将推动面向多样化细胞群体的更广泛基因组学研究。

SiC-seq 实验流程包含3个采用软光刻技术制备的PDMS微流控装置（图1）。共流式液滴生成器（图3A）用于生成25 µm的数字条形码液滴，以对基因组DNA进行标记，并赋予每个单细胞唯一的标识符。条形码寡核苷酸包含一段15 bp的随机序列，两侧为用于扩增的PCR接头（表2，BAR引物）。将条形码稀释至飞摩尔浓度，以实现单分子封装，每个液滴中包含0个或1个条形码片段。含有条形码的液滴随后进行扩增，产生大量双链条形码扩增子。使用核酸染料检测扩增是否成功，并量化条形码片段的封装效率（图4B）。微凝胶通过将细菌细胞悬液与熔融琼脂糖凝胶以相等流速共流生成（图2A）。琼脂糖配制浓度为最终所需浓度的两倍，因为在共流液滴生成过程中，水相溶液会被有效稀释两倍。随着琼脂糖冷却，其固化形成直径为25 µm的微凝胶，占据液滴的球形空间。
一系列洗涤和裂解步骤可纯化微凝胶中的高分子量基因组DNA（图2B）。破乳后，使用大体积的水相溶液进行洗涤，以稀释可能抑制后续酶促反应的微量有机溶剂。通过显微镜观察经洗涤的微凝胶，以验证细胞包封率（图4A）。向微凝胶悬浮液中加入具有广谱裂解活性的酶混合液，以降解细菌和真核微生物的细胞壁19。随后用蛋白酶K和去垢剂进行第二次处理，以降解蛋白质并溶解细胞碎片。
为避免小片段的标签化DNA在微凝胶之间扩散可能导致的交叉污染，对纯化后的DNA在液滴中进行标签化（tagmentation）处理18。液滴封装装置（图3B）将每个微凝胶与缓冲液及标签化酶分隔在独立的液滴中，该酶可同时将双链DNA打断并用预加载的寡核苷酸对其进行“标记”20。微凝胶以紧密堆积的颗粒形式被加载至液滴中，实现接近每个液滴封装一个微凝胶的效率，且双包率极低21（图4C）。
在微流控工作流程的最后一步（图2C），设备通过一个双合并操作，在受控的两步过程中将1个条形码液滴、1个含微凝胶的液滴以及扩增混合液进行整合。首先，含有PCR试剂的液滴在黄色区域（图5）与条形码液滴配对并合并。微流控通道中的盐水电极产生高电场梯度，从而触发液滴合并。随后，第一个合并后的液滴在红色区域以类似方式与含微凝胶的液滴配对，并进行第二次合并。合并后的液滴被收集，并在芯片外通过单重叠延伸（SOE）PCR进行热循环扩增。条形码与经标签化处理的基因组DNA之间的互补重叠末端可实现融合，并仅对正确标记的构建体进行指数级扩增。
测序数据首先根据读段质量进行过滤，然后通过将读段按其15 bp的单细胞条形码序列进行分组来解析。一个条形码组要被视为有效，必须包含最低数量的读段；该阈值设定可将分析限制在具有足够测序数据量的细胞，并去除发生PCR突变的条形码 &#34;孤儿&#34; 从数据集中。在此样本运行中，每组的最小值设定为 7.5 kbps（每组 50 条读段，每条 150 bp）。条形码计数与组大小的直方图显示，大量有效条形码组的大小仅略高于阈值大小（图6A).
在已知微生物群落组成的对照实验中，使用纯度和相对丰度指标来评估 SiC-seq 运行的质量。此处分析了一个由 3 种革兰氏阴性菌、5 种革兰氏阳性菌和 2 种酵母组成的合成 10 细胞群落。给定条形码组的纯度定义为该组中比对到最常见基因组的读段数除以该组总读段数。绝大多数条形码组的纯度均高于 0.95（图 6B）。细胞类型的相对丰度通过统计原始读段数和条形码组数来计算，其中每个条形码组根据其成员读段的一致性被分配一个细胞类型（图 6C）。读段数与条形码组数的丰度呈大致相同比例变化，表明细胞群体的取样方式使得某些物种未被过度集中于过小或过大的条形码组中。绘制来自单一物种所有条形码组的总覆盖度，显示在整个基因组范围内具有高覆盖度，且几乎不存在或仅有极少的覆盖缺失区域（图 7）。覆盖度的均匀性可通过归一化覆盖度值的频率分布进行验证，大多数值集中在平均值附近（图 7，插图）。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig1.jpg" /> 
图 1：通过光刻技术制备微流控装置。（A）通过在硅片上旋涂一层 SU-8 光刻胶来制备具有单一特征高度的母模。随后使用光刻掩模和紫外光对光刻胶进行图案化，使曝光区域的 SU-8 发生交联。最后，未交联的 SU-8 在显影液中溶解。所得的模具用于浇铸 PDMS，并与载玻片键合，从而制成完整的微流控装置。（B）对于双层装置，其制备同样始于旋涂和曝光步骤，随后重复这些步骤以构建双层结构。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig2.jpg" /> 
图2： SiC-seq 工作流程概述。 (A) 在液滴生成装置中，将微生物悬液与熔融琼脂糖共流，以将单个细胞包裹在微凝胶中。B微凝胶经过一系列洗涤步骤以纯化细菌基因组DNA。裂解酶消化革兰氏阳性菌和酵母的细胞壁，去污剂溶解细胞碎片。微凝胶被重新包封到液滴中进行标签化（tagmentation），以减少交叉污染。C微流控融合以一定速率将数字PCR条形码、经标签化剪切的微凝胶基因组以及扩增混合物组合在一起 &#62;1 kHz。片外SOE-PCR将独特的单细胞条形码连接到经标签化处理的基因组上，并选择性扩增完全带有条形码的构建体。 <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig3.jpg" /> 
图3： 用于液滴生成和微凝胶再包封的微流控装置。（A）本图展示了一种共流式液滴生成装置（特征高度为25 µm）。细胞和熔融琼脂糖以相等的流速注入装置，在25 µm × 25 µm的交汇处生成25 µm的液滴。在数字条形码液滴生成过程中，细胞入口被封闭，PCR反应混合物被引入琼脂糖入口。（B）本图展示了一种微凝胶再包封装置（特征高度为25 µm）。微凝胶通过漏斗形入口流入，以维持其紧密排列的有序结构，并在进入25 µm × 30 µm交汇处进行再包封前，接收一定体积的标签化混合物。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig4.jpg" /> 
图4：液滴和微凝胶的显微图像。（A）本图显示酶解前洗涤后的25 µm微凝胶。细菌经荧光染色，用于量化包封率。根据泊松加载统计，为最大限度降低多重包封事件的发生频率，细胞的包封率应控制在每10个液滴或更少包含1个细胞。（B）本图显示经核酸染料染色的25 µm数字条形码液滴的荧光显微图像。含有扩增条形码片段的液滴产生强烈的荧光信号。（C）本图显示重新包封于50 µm液滴中的微凝胶。微凝胶的紧密堆积使得包封率接近每个液滴1个凝胶，且双包封情况较少。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig5.jpg" /> 
图5：用于单细胞基因组条形码编码的微流控双融合装置。 通过两步融合操作，以高通量方式将条形码液滴与经标签化剪切的基因组合并。首先生成PCR混合液液滴，并在黄色区域利用盐水电极将其与条形码液滴融合。随后，引入含有微凝胶的液滴，并在红色区域进行第二次融合。油相入口可精确控制重新注入液滴之间的间距。条形码重注室及其间隔油相位于较短的25 µm层上，以蓝色阴影表示。所有其他装置结构均属于较厚的层，总高度为45 µm。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig6.jpg" /> 
图6：10个细胞合成微生物群落的条形码组指标。（A）本图显示了条形码组大小的分布情况。随着组大小的增加，特定大小的组数量呈指数级下降。每组至少7.5 kbps的最低阈值限制了分析范围，仅保留信息量足够的组，并去除了PCR突变产生的序列“孤儿”。（B）本图显示了条形码组纯度的分布情况。绝大多数（&#62;90%）的组具有很高的纯度（&#62;95%）。（C）本图显示了在测序读段和条形码组水平上计算得到的10个物种的相对丰度。两种计数方法产生相似的结果，表明不同物种间的条形码组大小具有一致性。<a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57598/57598fig7.jpg" /> 
图7基因组覆盖度的总和 枯草芽孢杆菌 条形码组 所有比对到该细菌的条形码组的测序读段 B. subtilis （N = 9,398）被合并后进行整体分析。环形覆盖度图展示了SiC-seq读段的覆盖均匀性，未见明显的覆盖缺失区域。圆周周围的虚线表示平均覆盖深度（5.55x）。插图中的相对覆盖频率直方图显示，大部分碱基的覆盖深度接近全基因组平均水平，该水平由虚线表示。 <a href="/files/ftp_upload/57598/57598fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>装置</td>
			<td>第一层高度 (µm)</td>
			<td>第一层旋转速度 (rpm)</td>
			<td>第二层高度 (µm)</td>
			<td>第二层旋转速度 (rpm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>共流液滴生成器</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>凝胶再包封装置</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>双融合装置</td>
			<td>25</td>
			<td>4000</td>
			<td>20</td>
			<td>5000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：微流控器件制备参数。 本表列出了在SiC-seq工作流程中使用的微流控器件及其光刻胶旋涂所需的转速（依据SU-8 3025生产商的技术规格）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标签</td>
			<td colspan="5">序列 (5' &#62; 3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAR</td>
			<td colspan="5">GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA_BAR</td>
			<td colspan="5">CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P7_BAR</td>
			<td colspan="5">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P5_DNA</td>
			<td colspan="5">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I7_READ</td>
			<td colspan="5">GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：引物序列。
补充文件 1： <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_1-SiC-seq_device_masks.dwg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2： <a href="/files/ftp_upload/57598/Suppl_File_2-centrifuge_syringe_holder_1mL.dwg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

单细胞测序可揭示生物系统中的基因型异质性，但现有技术缺乏对群落组成和功能进行深度分析所需的通量。本文介绍了一种微流控工作流程，可用于对来自不同细胞群体的超过&gt;50,000个单细胞基因组进行测序。

测序技术已随着对细胞异质性作用认识的不断深入，经历了从群体水平到单细胞分辨率的范式转变。

本实验的总体目标是利用一系列微流控装置，从数万个单细胞中生成带有条形码的基因组测序数据。该方法实现了前所未有的单细胞测序通量。我们采用微流控技术对细胞进行 individually 封装、裂解和条形码标记，从而保留了基因组层面的异质性，而这种异质性在传统的群体测序研究中会丢失。该技术的主要优势在于通量高，能够从数万个细胞中获得单细胞数据。尽管本演示中使用的是微生物，但通过微流控装置尺寸的微小调整，该流程可适用于其他不同类型的细胞。开始实验前，配制1毫升3%（质量/体积）低熔点琼脂糖溶液，溶于1X Tris-EDTA（即TE）缓冲液中。将琼脂糖溶液置于90摄氏度的加热块上，直至准备上样至注射器。用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，并离心细胞。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于一毫升含17%体积比密度梯度介质的PBS溶液中，并将细胞置于冰上直至上样至注射器。接下来，用含有2%（质量分数）PFPE-PEG表面活性剂的氟化油（HFE）填充一支三毫升注射器，安装27号针头，并将其放入注射泵中。将细胞悬液和熔融琼脂糖分别装入两支一毫升注射器中，每支均安装27号针头，并置于注射泵内。然后，将电暖器调至高温档，并使加热面距离注射器10厘米。确保在注射器位置测得的温度约为80摄氏度。在将管路插入设备之前，需先启动泵以排出管路中的空气。使用聚乙烯（PE）管将注射器针头连接到微流控装置的入口。将一段管路连接至出口，并将游离端放入15毫升收集管中。液滴生成后，将收集管置于4摄氏度环境中30分钟，以确保琼脂糖完全凝胶化。使用带有20号针头的三毫升注射器从收集管中移除下层油相，注意不要扰动上层的琼脂糖液滴。加入一毫升体积分数为10%的PFO/HFE溶液，以破坏琼脂糖液滴的表面活性剂层。用移液器上下吹打溶液一分钟，使乳状液充分混匀并完全被覆盖，确保体系均一且无团块。将锥形管在2,000 × g条件下离心1分钟，以收集琼脂糖微凝胶。吸除PFO/HFE上清液，并确保微凝胶已完全去除表面活性剂层且呈透明状。洗涤微凝胶后，取10 µL凝胶样品，用1×核酸染料染色，然后在显微镜下以400倍放大倍数观察，验证细胞在微凝胶中的包封情况。用一小段铅焊料堵住共流式液滴发生装置的细胞进样口。在将管路插入装置之前，先启动泵以排空管路中的空气。将一段管路连接至出口，并将游离端放入一个0.2毫升的PCR管中。使用屏幕上的流速进行液滴制备。将液滴收集到 PCR 管中，每管约含 50 微升液滴。液滴制备完成后，使用加样枪头小心移除乳液下层的 HFE 油，并替换为含有 5%（质量分数）PFPE-PEG 表面活性剂的 FC-40 氟化油。然后，设置热循环程序。在将反应管插入仪器之前，启动泵以排空管路中的空气。使用PE管将装有HFE、标签化混合物和微凝胶的注射器连接到微流控装置的入口。将一段管路连接至出口，并将游离端放入一个空的1毫升注射器中，注射器的活塞拉至1毫升刻度线处。接下来，在400倍光学显微镜下验证微凝胶包封率。为含有标签化乳液的注射器安装一根针头，并将其直立置于55摄氏度的加热块或烘箱中孵育一小时，以片段化基因组DNA。通过将FC-40油相替换为2%（重量/重量）HFE中的PFPE-PEG，制备用于融合的条形码液滴。小心地将液滴转移至一支1毫升注射器中，安装针头后放入注射泵。将孵育后的带标签片段化微凝胶液滴注射器装入另一注射泵中。接下来，使用PE管将三个氯化钠溶液注射器连接到两个电极入口和一个护城槽入口。在将管路插入装置之前，先启动泵以排空管路中的空气。使用PE管将安装在泵上的三个HFE注射器连接到两个间隔油入口和液滴生成油入口。然后，在将管路连接至注射器针头之前，先用防静电枪对所有液滴重新注入管路进行放电处理。使用PE管将PCR反应混合液注射器、微凝胶液滴注射器和条形码液滴注射器分别连接至对应的入口。使用鳄鱼夹将电极注射器的针头连接至冷阴极荧光逆变器。将逆变器的直流电源设置为2伏。以推荐的流速运行双合并装置。将液滴收集到PCR管中，每管约含50微升乳液。在进行热循环之前，使用加样枪头小心地移除乳液中下层的HFE油，并替换为含有5%（质量分数）PFPE-PEG表面活性剂的FC-40氟化油。然后设定循环程序。为从热循环后的液滴中回收DNA，将液滴收集至微量离心管中，加入20 µL PFO破乳。涡旋混匀10秒。离心试管。用移液器小心吸取上层水相，转移至新的微量离心管中。弃去油相，随后进行文库构建、测序和分析步骤。条形码计数相对于组大小的直方图显示，大量有效条形码组的大小略高于每组7.5 kb的阈值，该阈值排除了PCR突变产生的孤儿序列。通过计数原始测序读段和条形码组，计算了由三种革兰氏阴性菌、五种革兰氏阳性菌和两种酵母菌组成的合成10细胞群落中各细胞类型的相对丰度。来自所有条形码组的枯草芽孢杆菌（B.subtilis）读段的环形覆盖度图显示了SiC-seq读段的均匀性，未观察到覆盖度下降区域，平均覆盖度为5.55X。通过归一化覆盖度值的频率分布验证了覆盖度的均匀性。在进行此操作时，重要的是保持每10个液滴中约包含一个条形码或一个细胞的包封率。这可以降低双重包封事件的发生概率，从而避免单细胞数据的混淆。观看本视频后，您应能够充分理解如何设置和操作用于生成单细胞测序数据的微流控装置。一旦掌握，该技术可在八小时内完成，或分两个四小时的工作日进行。

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科研

JoVE Journal

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本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片。该芯片可通过荧光检测或免疫检测方法，对细胞内蛋白质、酶、辅因子和第二信使进行定量分析。...

一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

本方案描述了一种利用微流控装置实现小体积（0.15–1.5...

用于精确小体积样品处理的微流控平台及其在声学微装置中按尺寸分离生物颗粒的应用

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

纳米孔测序是一种新型技术，可在偏远地区和资源匮乏的环境中实现低成本测序。本文介绍了一种适用于此类条件的全血 mRNA...

使用纳米孔测序技术对全血 mRNA 进行测序

本文描述了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的多层微流控装置的制备过程，该装置可实现体外转录与翻译（IVTT）反应的长期进行。此外，还全面概述了实现并维持这些反应长期自动化的所需硬件与软件。...

一种用于持久无细胞基因表达的多层微流控平台

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。...

利用高通量微流控装置产生动态环境条件

循环肿瘤细胞（CTCs）对于癌症进展和转移的研究至关重要。本文介绍了一种高通量、一体化的CTC富集与单个CTC测序方案，在提高捕获效率和CTC纯度的同时，降低了污染风险和测序成本，从而推动了精准肿瘤学研究及临床应用的发展。...

基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

了解超高通量微流控单细胞基因组测序技术，通过微凝胶封装和条形码标记实现数万个单细胞的高通量测序。该方法保留基因组异质性，适用于微生物及多种细胞类型的基因组分析。

一种用于单细胞基因组测序的超高通量微流控平台

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