一种多功能自动化平台微尺度细胞刺激实验

该程序的总体目标是组装和使用基于半自动微流体的平台来培养和刺激小细胞群，并回收细胞裂解物用于分子分析。这是通过首先在纤连蛋白包被的微毛细管（称为细胞灌注室）中建立微量细胞培养物来实现的。第二步是将灌注室连接到数字微流体或 DMF 模块，该模块提供了一种灵活的方法，通过该模块将试剂路由到微量细胞培养物或从微量细胞培养物中路由。

接下来，DMF 模块将感兴趣的刺激物输送到灌注室，并将细胞与刺激物一起孵育预定的暴露时间。最后，通过化学方法裂解细胞，并将裂解物回收到 DMF 模块中进行分子分析。然后使用定量 R-T-P-C-R 分析回收的裂解物，以表征细胞群对刺激的转录反应。

与传统细胞培养方法相比，该技术的主要优点是，使用该技术可以使用少量细胞进行细胞刺激研究，也可以使用少量试剂。我们的研究表明，平台在微尺度上对细胞和试剂的精确处理最大限度地减少了实验间的可变性。该平台也非常通用。

数字微流模块可以非常灵活地将细胞和试剂路由到灌注室和从灌注室进出，因此可以快速轻松地定制和重新配置实验。首先，制备每毫升 50 μg 纤连蛋白的无菌溶液，并使用多端口注射泵将 30 μL 溶液吸入每个微毛细管中，以加速微毛细管内表面的涂层。在 37 摄氏度下孵育 2 小时，然后取出并丢弃纤连蛋白溶液，让微毛细管在室温下干燥 6 小时。

接下来，使用 capite 接头将纤维 nin 涂层的微毛细管或灌注室连接到聚碳酸酯管，并将管道连接到注射泵。此处显示的设置使用支持六个灌注室的辅助端口注射泵。使用胶带将每个灌注室的主体固定在加热块上，并将加热块温度设置为 37 摄氏度。

然后将灌注室的开口端浸入含有细胞的储液槽中，悬浮在新鲜生长的培养基中，以每毫升 100 万个细胞的浓度均匀分散。指示注射泵将 10 微升细胞悬液拉入每个灌注室。然后从细胞悬液中取出灌注室的开口端，并指示注射泵抽出足够的空气，将液体塞移动到固定在加热块上的部分。

通过在 37 摄氏度下孵育 1 至 2 小时，让细胞粘附在纤连蛋白涂层的灌注室内表面。同时，将灌注室的开口端转移到含有新鲜生长培养基的新储液器中。粘附期过后，指示注射泵将液体塞送至废液中，然后将 10 μL 新鲜培养基吸入每个融合室，然后注入足够的空气，将新鲜培养基置于粘附的细胞上。

继续在 37 摄氏度下孵育细胞，每两小时更换一次培养基，直到培养物充分平衡和扩增。模式。DMF 模块的底板带有 46 个氧化铟锡电极。使用标准光版印刷技术，通过化学气相沉积在 DMF 模块的底板上涂上 5 微米的 Lene C，然后用 50 纳米的 Teflon af 旋涂。

50 纳米的 Teflon AF 旋涂和未图案化的氧化铟锡玻璃基板作为顶板。使用金属压缩框架将板固定在聚合物铸件中，这些铸件带有凹槽，可在板之间保持 400 微米的间距。此间距与 2.5 平方毫米的驱动电极尺寸相结合，将液滴体积定义为每个电极 2.5 微升。

然后将特氟龙涂层的转移微毛细管插入 DMF 板之间的空间。定位每个，使其延伸到其同源驱动电极的边缘，以达到每个传输的另一端。微毛细管固定 capite 接头。

接下来，接合电气连接器，为 10 氧化物铟电极提供电压。电极激活序列通过使用运行预定脚本的计算机控制电子界面实现自动化。然后用适当的试剂填充 DMF 模块的板载储液槽，用于细胞刺激、洗涤和裂解。

在某些情况下，最好在刺激物使用前一步加载刺激本身，从加载的板载储液器中汲取，将微液滴分配到 DMF 模块上。测试、驱动微液滴，包括它们在 DMF 模块和传输微毛细管之间的传输。布莱斯。首先，在含有 0.1%onic F1 27 的新鲜培养基中制备刺激物，终浓度为 100 μg/mL。

然后将 80 到 100 微升的刺激物加载到其指定的机载储液器中。接下来，从培养基储液器中取出灌注室的开口端，并将其插入固定在转移微毛细管末端的 capite 接头中，然后指示注射泵将灌注室内的液体塞送至废液容器。接下来，指示 DMF 模块产生 10 微升刺激液滴，并通过转移微毛细管将它们输送到灌注室。

如果需要，将细胞与 37 摄氏度的刺激物一起孵育 1 到 4 小时。刺激期后定期更换新的刺激。指示注射泵将刺激物发送到废液容器，并指示 DMF 模块将 10 微升洗涤缓冲液液滴输送到每个灌注室。

将细胞与洗涤缓冲液一起孵育 5 分钟。然后将洗涤缓冲液交换为 10 μL 裂解液，再孵育 5 分钟。接下来，指示注射泵将每个细胞裂解物发送到 DMF 模块。

拆下 DMF 模块的顶板，注意不要将板向侧面倾斜，因为这会导致液滴之间交叉污染。最后，使用移液器人从开放的 DMF 模块中收集裂解物进行平台外分析，例如基因表达、通过定量 R-T-P-C-R 进行分析，以便为下一个实验准备平台。首先，在室温下将转移微毛细管、CAPITE 接头和 DMF 模块板浸入 10% 漂白剂中 10 分钟，然后用异丙醇冲洗 DMF 模块板，然后用去离子水冲洗并使用氮气干燥，然后在 160 摄氏度下烘烤 10 分钟。

该方案中描述的接种方法导致每个灌注室粘附约 500 个米伦巨噬细胞。将细胞与 37 摄氏度的生长培养基一起孵育 16 小时后，细胞群大小增加了一倍，每个灌注室大约有 1000 个细胞。此处显示的是 R-T-P-C-R 定量分析的结果，这些基因已知在对细菌的先天免疫反应中起重要作用。

巨噬细胞在常规或微量培养物中生长，并用大肠杆菌生物颗粒刺激 1 小时或 4 小时。蓝色条表示刺激常规培养细胞后基因表达的平均倍数增加，而红色条表示生长和刺激的细胞中的诱导表达。在微量培养物中，误差线表示来自三个独立实验的生物学重复之间的标准偏差。

基因表达谱分析结果非常相似，尽管常规培养物使用 96 孔板，每孔约 50， 000 个细胞，而微量培养物使用微量毛细管，每个灌注室实验大约有 1000 个细胞，实验变异性至少是可比的，并且在微量培养中通常会降低，如在微量尺度上工作的较短误差线所示。细胞消耗量减少 5 倍，试剂消耗量减少 3 至 50 倍。相对于常规实验。

该方法可用于培养几乎任何贴壁细胞类型，在某些情况下使用不同的细胞外基质成分或生长。培养基非粘附细胞类型可能具有挑战性，但细胞栓系策略已被证明在类似环境中是成功的。此处描述的方法支持长达 24 小时的微量培养。

该平台还包括进行长期培养的所有功能，但需要开发细胞传代方案。其他模块可以通过微毛细管互连集成到数字微流体 Cub 中。通过这种方式，DMF 充当连接外围模块以执行复杂工作流程的中心枢纽。

我们主要专注于表征宿主对感染因子的转录反应，但该平台被设计为用途极其广泛，因此它应该支持各种研究应用。