表征使用原子力显微镜，冲击压痕和流变测定脑组织的多尺度力学性能

这些机械表征技术的总体目标是测量生物组织在不同长度尺度和负载速率下的粘弹性。这些方法可用于回答生物工程中的关键问题。例如，大脑在非常高的负荷率下如何变形，或者多发性硬化症或自闭症等疾病如何影响脑组织的机械特性。

这些技术的主要优点是对于刚度非常低、水合度非常高的材料，如生物组织，您可以在广泛的负载条件下进行测试，也可以在广泛的材料体积范围内进行测试，低至单个细胞的水平，直到整个大脑的水平。这些技术的影响延伸到对受伤期间大脑反应的建模，这对于设计保护策略非常重要。虽然这种方法可以深入了解大脑的机械特性，但它也可以应用于其他顺应的生物组织，例如心脏和肝脏。

在对顺应性组织进行机械表征时，在测量探针和组织之间建立适当的接触至关重要。小心地将标称弹簧常数为每米 0.03 牛顿的 AFM 探针和直径为 20 微米的硼硅酸盐珠子装入探针支架中。将安装在培养皿中的脑切片放在已预热至 37 摄氏度的 AFM 载物台安装加热器上。

然后加入约 2 毫升预热的培养基。接下来，小心地在 AFM 探针上加入一滴培养基，以防止它在下降到脑切片周围的介质中时因表面张力而破裂。然后将 AFM 头重新定位到载物台上，并开始降低头，直到它浸没在培养基中。

使用光学显微镜移动载物台，使感兴趣区域低于校准的 AFM 探针，然后降低 AFM 探针以与组织表面接触。为了进行蠕变柔度实验，在软件的函数编辑器中构建一个施加的力函数。该功能包括 0.1 秒斜坡到 5 纳牛顿的设定点，保持 20 秒，然后 1 秒斜坡下降到零纳牛顿。

该软件将记录 AFM 探针在施加力功能期间压痕到组织中的数据。运行蠕变柔度实验后，通过在软件中创建施加的压痕函数来进行力松弛实验。当软件收集有关 AFM 探针在压入组织时所受力的数据时，运行此功能。

要开始冲击压痕测试，请使用镊子将球形探针滑到摆锤上，以匹配球形探针。然后将熔融石英样品柱连接到板上，并将板拧入平移台。要在水合的脑组织上进行动态冲击实验，请首先执行液体细胞校准。

转到软件中的校准菜单，选择 Liquid Cell 并按照软件提示与熔融石英样品接触。接下来，为压头类型选择正常，并为压头载荷使用默认值 0.05 毫牛顿。然后单击 continue （继续） 以执行正常压头配置的校准。

现在将样品台向后移动至少 5 毫米并安装杠杆臂。通过选择 Liquid Cell 作为压头类型，在新配置中重复液体池校准。单击 Continue （继续） 获取液体池校准因子。

接下来，增加电容器板间距。增加电容器板间距将增加最大可测量深度，这在测试高度合规的材料时是必需的。用扳手以小增量顺时针转动控制电容器板间距的三个螺母。

每完成顺时针旋转一圈后，在 Maintenance（维护）菜单下选择 Bridge Box Adjustment（桥箱调整）并获得良好的摆锤测试。继续缓慢调整螺母，直到大约深度校准读数为 70， 000 纳米/伏或更高。

然后在摆锤底部放置一个新的限位挡块，该限位挡块可以通过电源打开和关闭。缩回摆锤后面的原始限位挡块，以消除摆锤运动的潜在障碍，并允许更高的冲击速度和更高的穿透深度进入柔顺样品。打开螺线管的电源并将其设置为 10 伏。

接下来，转到 Experiment （实验） 菜单，然后选择 Impact （冲击） 和 Adjust Impulse Displacement（调整脉冲位移）。按照软件说明校准摆锤的摆动距离。当冲击压痕设置完全完成后，吸出培养基并干燥脑切片。

然后使用一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂将切片的大脑固定到铝制样品柱上。然后将液体池滑过样品柱上的第二个 O 形圈，并在液体池中填充 5 毫升不依赖二氧化碳的培养基，以完全浸入组织。沿负 X 方向移动浴槽，直到杠杆臂上的尖端正确位于浴槽上方。

接下来，沿 Z 轴正方向移动，直到吸头完全浸没在浴槽中并位于样品前面。使用样品台控制窗口，小心地接触样品台，然后将样品台从样品表面向后退约 30 微米。在 Experiment （实验） 菜单下，单击 Impact 并设置影响实验。

根据摆动距离校准，选择与产生的冲击速度直接相关的特定脉冲载荷。然后运行计划的实验。当摆锤向后摆动并且样品表面继续移动到测量平面时，请关闭下限开关。

软件将记录探针随时间变化的位移。将砂纸贴在 25 毫米直径的测量探头上。接下来，连接热系统并安装探头。

最后，将另一张沙纸贴在与顶板对齐的底板上。按照制造商的说明校准流变仪。首先，将探针上的力归零。

其次，建立探针和底板之间的接触。然后测量探头的惯性。最后，执行电机调整。

然后慢慢放下测量板。当板距离组织不到 1 毫米时，以 0.1 毫米的增量将其降低，直到板与组织的顶面完全接触并且测得的法向力达到所需值。在样品边缘挤出少量培养基，以在作过程中保持水合作用。

降低隔热罩。接下来，单击 File（文件）、New（新建），然后在 Gel 选项卡下选择 Frequency Sweep（频率扫描）。然后单击 window measurement one frequency sweep 并双击振荡框。

输入频率范围、应变和点数。最后，选择 OK 并单击 Start 以启动频率扫描。以下是蠕变柔度和力松弛实验的代表性压痕和力随时间的响应。

利用这些数据和系统的几何形状，可以计算大脑不同区域的蠕变柔度和力松弛模量。冲击压痕测量组织在高空间和时间集中载荷速率下的机械性能。所得的冲击响应参数可以在不同的冲击速度下量化，这为研究组织的速率依赖性特性提供了一种方法。

流变学根据存储和损耗模量测量块状组织的频率依赖性粘弹性。在低频下，储能模量几乎比损耗模量大一个数量级，这表明弹性特性主导着脑组织的行为。在尝试此程序时，重要的是要保持组织充分水分或浸入有助于组织保持其适当结构的液体中。

这些演示技术的发展为材料研究人员设计一种可以模拟大脑机械反应的优化合成凝胶铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用原子力显微镜实现压痕、冲击压痕和流变学来表征组织的粘弹性力学特性有很好的了解。在解释收集的数据时，请记住一个基本假设，即组织的变形体积在结构上是均匀的，并且在弹性上是各向同性的。

这不一定适用于所有生物组织。随着您对生物组织力学的问题变得更加明确，您可以选择其中的一个或多个力学实验，以适当的长度尺度或感兴趣的时间尺度来回答问题。