Name: 表征使用原子力显微镜，冲击压痕和流变测定脑组织的多尺度力学性能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 了解如何使用原子力显微镜、冲击压痕和流变测定技术表征脑组织的多尺度粘弹性力学性能。这些方法可测量从单细胞到全脑水平的生物组织力学特性，有助于理解疾病对脑组织的影响及脑损伤防护策略。

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我们感谢国家多发性硬化症协会和西蒙斯社会脑中心对本工作的支持。BQ 感谢美国国家国防科学与工程研究生奖学金项目的支持。

<ol><li>van Dommelen, J. A. W., Hrapko, M., Peters, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Properties+of+Brain+Tissue%3A+Characterisation+and+Constitutive+Modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanosensitivity+of+the+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Mechanical Properties of Brain Tissue: Characterisation and Constitutive Modelling.</a> Mechanosensitivity of the Nervous System. , 249-281 (2009).</li>
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<li>Rother, J., Nöding, H., Mey, I., Janshoff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+microrheology+reveals+significant+differences+in+the+viscoelastic+response+between+malign+and+benign+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines.</a> Open biology. 4 (5), 140046(2014).</li>
<li>Du, P., Lu, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Young%27s+Relaxation+Modulus+of+PDMS+Using+Stress+Relaxation+Nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Symposium+DD+-+Microelectromechanical+Systems+-+Materials+and+Devices+III%22%5BJournal%5D)">Measuring the Young's Relaxation Modulus of PDMS Using Stress Relaxation Nanoindentation.</a> Symposium DD - Microelectromechanical Systems - Materials and Devices III. 1222 (c), (2009).</li>
<li>Elkin, B. S., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+the+P17+and+adult+rat+brain+from+indentation+in+the+coronal+plane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of the P17 and adult rat brain from indentation in the coronal plane.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 135, 114507(2013).</li>
<li>Brands, D. W., Bovendeerd, P. H., Peters, G. W., Wismans, J. S., Paas, M. H., van Bree, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+dynamic+behavior+of+brain+tissue+and+two+model+materials%5BTitle%5D)+AND+%2243rd+Stapp+Car+Crash+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of the dynamic behavior of brain tissue and two model materials.</a> 43rd Stapp Car Crash Conference Proceedings. , 313-320 (1999).</li>
<li>Hrapko, M., van Dommelen, J. A. W., Peters, G. W. M., Wismans, J. S. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+mechanical+behaviour+of+brain+tissue+in+compression+and+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the mechanical behaviour of brain tissue in compression and shear.</a> Biorheology. 45 (6), 663-676 (2008).</li>
<li>Pogoda, K., Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+stiffening+of+brain+and+its+effect+on+mechanosensing+by+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Compression stiffening of brain and its effect on mechanosensing by glioma cells.</a> New Journal of Physics. 16 (7), 075002(2014).</li>
<li>Peters, G. W. M., Meulman, J. H., Sauren, A. A. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applicability+of+the+time%2Ftemperature+superposition+principle+to+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">The applicability of the time/temperature superposition principle to brain tissue.</a> Biorheology. 34 (2), 127-138 (1997).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍的每种技术均用于测量脑组织力学特性的不同方面。蠕变柔量和应力松弛模量用于表征时间依赖性力学特性。储能模量和损耗模量则反映速率依赖性力学特性。冲击压痕同样测量速率依赖性力学特性，但侧重于能量耗散的背景。在表征组织力学特性时，原子力显微镜辅助压痕（AFM-enabled indentation）和流变学是两种常用方法。其中，原子力显微镜辅助压痕尤为有用，因为它不仅能提供材料的时间依赖性特性，还可通过调节不同的实验参数来测量细胞和组织的弹性模量4，甚至频率依赖性特性24，如前所述。然而，对于柔软且含水的组织，数据的准确解读和实验设计仍具挑战性。流变学测量的是组织的整体特性，而原子力显微镜辅助压痕则探测与细胞微环境相关的微尺度体积。冲击压痕则提供了一种量化材料在集中动态冲击载荷下变形行为的方法，在研究局灶性冲击引起的创伤性脑损伤等应用中具有重要意义。尽管各技术所得结果不能直接比较，但通过冲击压痕测得的能量耗散特性与通过流变学测得的剪切损耗模量所呈现的趋势一致，如下文所述。
在本文所示的原子力显微镜（AFM）辅助脑组织压痕实验中，我们采用蠕...

构成生物器官的大多数软组织在力学和结构上具有复杂性，与矿化骨组织或工程材料相比刚度较低，并表现出非线性和与时间相关的变形特性。与其他人体组织相比，脑组织表现出显著的柔顺性，其弹性模量 E 数量级约为数百帕斯卡（Pa）1。脑组织在结构上具有异质性，灰质与白质区域分明且相互交错，功能上也存在差异。理解脑组织的力学特性有助于设计材料和计算模型，以模拟脑组织在损伤过程中的响应，促进对机械性损伤的预测，并推动防护策略的工程化设计。此外，这些信息还可用于确定组织再生的设计目标，并加深对与多发性硬化症和自闭症等疾病相关的脑组织结构变化的理解。本文中，我们介绍并演示了多种可用于表征包括脑组织在内的柔顺性软组织在微、中、宏观尺度下黏弹性特性的实验方法。
在微尺度上，我们采用原子力显微镜（AFM）压痕技术进行了蠕变柔量和力松弛实验。通常，AFM压痕技术用于估算样品的弹性模量（或瞬时刚度）2-4。然而，同一仪器也可用于测量微尺度下的黏弹性（与时间或速率相关）特性5-10。这些实验的原理如图1所示：将AFM悬臂探针压入脑组织，保持特定大小的作用力或压入深度，并随时间测量相应的压入深度或力的变化。利用这些数据，可分别计算蠕变柔量JC和松弛模量GR。
在介观尺度上，我们在保持组织结构和水合水平的液体浸没条件下，使用基于摆锤的仪器化纳米压痕仪进行冲击压痕实验。实验装置如图2所示。当摆锤摆动并与组织接触时，记录探针位移随时间的变化，直至振荡的摆锤在组织内停止运动。根据探针产生的阻尼谐振振荡运动，可计算组织的最大穿透深度xmax、能量耗散能力K以及耗散品质因子Q（反映能量耗散速率）11,12。
在宏观尺度上，我们使用平行板流变仪来量化组织的频率依赖性剪切弹性模量，即储能模量 G' 和损耗模量 G&#34;。在这种流变测量中，我们在已知振幅和频率下施加谐波角应变（以及相应的剪切应变），并测量反作用扭矩（以及相应的剪切应力），如图3所示。根据测得的扭矩的振幅和相位滞后，以及系统的几何参数，我们可以计算在特定施加频率下的 G' 和 G&#34;13,14。

<table><tbody><tr><td>赛拉嗪</td><td>Lloyd Laboratoried</td><td></td><td>处方药</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>AnaSed Injections</td><td></td><td>处方药</td></tr><tr><td>振动切片机（振动刀片式切片机）</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A 培养基</td><td>Gibco</td><td>A1247501</td><td>适用于成体组织的 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;非依赖性神经培养基</td></tr><tr><td>原子力显微镜，MFP-3D-BIO</td><td>Asylum Research</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>培养皿加热器</td><td>Asylum Research</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>AFM 探针，0.03 N/m，10&amp;nbsp;&amp;micro;m 半径硼硅酸盐玻璃微球</td><td>Novascan</td><td>PT.GS</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>来源于贻贝的生物粘合剂</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>可使用其他供应商</td></tr><tr><td>氢氧化钠，1 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59223C</td><td>可使用其他供应商</td></tr><tr><td>仪器化压痕仪，NanoTest Vantage</td><td>Micro Materials Ltd.</td><td>-</td><td>探针尖端需加工（钢制平冲头，直径 1&amp;nbsp;mm，长度 4-5&amp;nbsp;mm）</td></tr><tr><td>NanoTest 液体池</td><td>Micro Materials Ltd.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>平行板流变仪 MCR501</td><td>Anton-Parr</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PP25&amp;nbsp;</td><td>Anton-Parr</td><td>-</td><td>直径 25 mm 的平板测量头</td></tr><tr><td>粘性砂纸</td><td>McMaster-Carr</td><td>4184A48</td><td>可使用其他供应商</td></tr><tr><td>乐泰 4013 瞬干胶</td><td>Henkel</td><td>20268</td><td>可使用其他供应商</td></tr></tbody></table>

利用原子力显微镜、冲击压痕和流变仪表征脑组织的多尺度力学特性

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

为了设计和构建受大脑特性启发的材料，无论是用于力学模拟还是组织再生研究，都必须在不同的空间和时间尺度上对脑组织本身进行充分表征。与许多生物组织类似，脑组织具有复杂的层级结构。然而，与其他大多数组织不同的是，脑组织的力学刚度极低，其杨氏弹性模量 E 仅为数百帕斯卡（Pa）量级。这种低刚度特性给关键力学性能的实验表征带来了挑战。本文展示了多种经过改进的力学表征技术，可用于在不同长度尺度和加载速率下测量脑组织等水合、柔软生物材料的弹性与黏弹性特性。在微米尺度上，我们采用原子力显微镜辅助的压痕法进行蠕变柔量和力松弛实验；在介观尺度上，使用基于摆锤的仪器化压痕仪进行冲击压痕实验；在宏观尺度上，则通过平行板流变仪测定频率依赖性的剪切弹性模量。我们还讨论了每种方法所面临的挑战与局限性。综合这些技术，可实现对脑组织的深入力学表征，有助于更好地理解脑的结构，并推动仿生材料的工程化设计。

图4展示了蠕变柔量和应力松弛实验中典型的压痕深度及力-时间响应曲线（图4B,E），分别对应于施加的力或压痕深度（图4A,D）。利用这些数据以及系统的几何参数，可计算出脑组织不同区域的蠕变柔量Jc(t)和应力松弛模量GR(t)（图4C,F）。尽管先前的研究表明脑部不同区域的弹性模量存在差异23，但通过该方法测得的小鼠脑组织切片的黏弹性特性在同一切片内并未显示出区域间的差异。
压痕冲击法用于测量组织在空间和时间上高度集中的高加载速率下的力学特性。这些实验结果可提供有关组织在创伤性损伤或与手术相关的有意变形情况下如何耗散能量的信息。压痕冲击探针的阻尼振荡运动（图2B）可提供数据，用于计算组织...

我们介绍了一组用于表征大脑在微观、介观和宏观尺度下的黏弹性力学特性的技术。

为了设计和制备受大脑特性启发的材料，无论是用于力学模拟还是组织再生研究，大脑……

这些力学表征技术的总体目标是在不同的长度尺度和加载速率下测量生物组织的黏弹性特性。这些方法可用于回答生物工程领域中的关键问题。例如，大脑在极高加载速率下如何发生形变，或者多发性硬化症或自闭症等疾病如何影响脑组织的力学性质。这些技术的主要优势在于，对于像生物组织这样刚度极低且高度水合的材料，可以在广泛的加载条件下进行测试，同时也可以在大范围的材料体积上进行测试，小至单个细胞，大至整个脑组织。这些技术的应用意义在于对脑损伤过程中的响应进行建模，这对于设计防护策略具有重要意义。尽管该方法可为脑组织的力学特性提供深入见解，也可应用于其他柔软的生物组织，如心脏和肝脏。在对柔顺组织进行力学表征时，建立测量探针与组织之间的适当接触至关重要。小心地将一个标称弹簧常数为0.03牛顿/米、带有20微米直径硼硅酸盐微珠的原子力显微镜（AFM）探针装入探针 holder 中。将置于培养皿中的脑片放置在已预热至37摄氏度的原子力显微镜载物台加热器上。然后加入约两毫升预热的培养基。接着，小心地在原子力显微镜（AFM）探针上滴加一滴培养基，以防止探针在浸入脑片周围培养基时因表面张力而损坏。随后将AFM探头重新放置到载物台上，并开始缓慢下降探头，直至其完全浸入培养基中。使用光学显微镜移动载物台，使感兴趣区域位于已校准的原子力显微镜（AFM）探针下方，然后降低AFM探针使其与组织表面接触。为了进行蠕变柔量实验，需在软件的函数编辑器中构建一个施加力函数。该函数包括一个0.1秒的斜坡上升至5纳牛的设定点，保持20秒，随后在1秒内斜坡下降至0纳牛。软件将记录AFM探针在施加力作用下压入组织时的压痕数据。在完成蠕变柔量实验后，通过在软件中设置施加的压痕函数，进行力松弛实验。运行该函数的同时，软件将采集AFM探针压入组织过程中所受力的数据。开始进行冲击压痕测试时，使用镊子将球形探针滑动安装到摆锤上。然后将熔融石英样品柱安装到样品台上，并将样品台旋入平移台。为了实现对水合脑组织的动态冲击实验，首先执行液体池校准。进入软件中的校准菜单，选择液体池（Liquid Cell），并按照软件提示与熔融石英样品接触。接着，选择“法向”（Normal）作为压头类型，并使用默认的0.05毫牛顿压头载荷值。然后点击继续，以完成法向压头配置的校准。现在将样品台向后移动至少五毫米，并安装杠杆臂。通过选择压头类型为液体池，对新配置重复进行液体池校准。单击“继续”以获取液体池校准因子。接下来，增大电容器极板间距。增大电容器极板间距可增加最大可测深度，这在测试高顺应性材料时是必要的。使用扳手，将控制电容器极板间距的三个螺母顺时针方向小幅旋转拧紧。每次顺时针旋转一周后，在维护菜单中选择“Bridge Box Adjustment”并进行一次良好的摆锤测试。继续缓慢调节螺母，直至“Approx. Depth Calibration”读

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神经科学

表征使用原子力显微镜，冲击压痕和流变测定脑组织的多尺度力学性能

细胞外基质的刚度显著影响黏附细胞的多种行为。基质刚度在组织内存在空间上的差异，并在多种疾病状态下发生改变。本文中，我们建立了利用原子力显微镜微压痕技术来表征正常及纤维化小鼠肺组织中刚度空间变化的方法。...

利用原子力显微镜对肺组织进行微机械特性表征

来源：Canovic, E. P., et al. 利用原子力显微镜、冲击压痕和流变学表征脑组织的多尺度力学特性。J. Vis. Exp.

利用原子力显微镜表征小鼠脑组织的机械特性

来源：Canovic, E. P., et. al., 利用原子力显微镜、冲击压痕和流变学表征脑组织的多尺度力学特性。J. Vis. Exp.

利用压痕法评估小鼠脑组织的力学特性

来源：Canovic, E. P., 等. 利用原子力显微镜、冲击压痕和流变学表征脑组织的多尺度力学特性。J. Vis. Exp. (2016)在本视频中，使用流变仪对脑组织施加受控的振荡旋转运动，以产生剪切应变，并评估组织的黏性和弹性特性。流变仪作为一种功能性工具，可为脑组织在损伤或神经退行性疾病过程中的力学行为提供...

使用流变仪测量小鼠脑组织的黏弹性特性

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

本实验方案描述了如何利用原子力显微镜在真正的纳米尺度上测量硬度，并检测单个原子级的塑性事件。...

通过仪器化原子力显微镜压痕法进行定量硬度测量

我们介绍一种利用原子力显微镜（AFM）在细胞水平上研究关节软骨早期骨关节炎变化的方法。...

原子力显微镜在早期骨关节炎检测中的应用

本方案介绍了一种用于软材料纳米压痕实验的完整工作流程，包括水凝胶和细胞。首先，详细阐述了获取力谱数据的实验步骤；随后，通过一款新开发的开源 Python 软件对这类数据进行分析，该软件可从 GitHub...

软物质纳米压痕的实验与数据分析流程

利用原子力显微镜结合偏振显微镜测量肝脏硬度

量化原子力显微镜（AFM）探针尖端与样品表面之间的接触面积及施加的力，可实现纳米尺度力学性能的测定。本文讨论了在空气或液体环境中，对软质和硬质样品实施基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术以测量弹性模量或其他纳米力学性能的最佳实践方法。...

基于原子力显微镜悬臂的纳米压痕技术：在空气与液体环境中进行纳米尺度力学性能测量

本实验方案演示了如何制备小鼠肺组织的冷冻切片，进行原子力显微镜力图实验，并分析数据以测定天然小鼠肺基底膜的杨氏模量。...

从原子力显微镜力图中提取天然小鼠肺基底膜的杨氏模量

了解如何使用原子力显微镜、冲击压痕和流变测定技术表征脑组织的多尺度粘弹性力学性能。这些方法可测量从单细胞到全脑水平的生物组织力学特性，有助于理解疾病对脑组织的影响及脑损伤防护策略。

利用原子力显微镜、冲击压痕和流变仪表征脑组织的多尺度力学特性

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