使用原子力显微镜测量活细胞的力学性能
2013年6月27日
本文演示了一个协议，通过使用原子力显微镜（AFM）的显微表征活细胞的机械性能。
以下实验的总体目标是使用原子力显微镜测量活细胞的弹性模量。这是通过首先在单元的不同位置进行 FM 力谱测量来实现的。第二步，分析每条强制距离曲线，以确定 A FM 尖端最初与单元接触的点。
接下来，从接触点开始，将前 200 到 300 纳米的压痕数据拟合到赫兹模型。为了提取弹性模量，结果产生了通过使用力映射模式获得的细胞刚度的 2D 图，其中每个像素代表一条强制距离曲线演示该程序的是我实验室的研究生 Guen Thomas。要开始此过程，请用 70% 乙醇清洁悬臂支架并使其干燥。
然后根据制造商的说明将 bru DNP 10 悬臂加载到 A FM 中。接下来，校准反向光学杆灵敏度。该参数描述了光电二极管的响应量，单位为每纳米悬臂偏转的伏特。
为此，首先将干净的载玻片加载到样品台上。安装 FM 头并根据制造商的说明调整激光束和对准。对齐后，在抽出 P 8 O 的情况下，将 A FM 尖端接合载玻片上的尖端。
将镜子重新对准负 2 伏的光电二极管读数。然后执行力谱测量，最大光电二极管响应或触发点为正 2 伏。数据采集完成后，放大力曲线的固定接触区域，并对该区域执行线性拟合。
要找到以伏特/纳米为单位的斜率，然后将反射镜对准重置为零伏特的自由偏转。接下来，使用 levy 和 Malam 描述的热调谐方法校准悬臂弹簧常数。首先，将扫描仪抬离样品台，使尖端和样品之间没有相互作用。
然后通过记录悬臂梁的热振动来捕获热数据。A FM 软件分析这种热振动的功率谱，并在数据窗口中绘制。接下来，对以最低频率（也称为基波谐振峰值）为中心的数据段进行拟合，以确定弹簧常数。
为了准备用于培养板的 FM，请在 a FM 载物台上安装培养皿加热器附件，并将温度设置为 37 摄氏度。等待 20 分钟，让系统达到稳定的热平衡。预热后，将培养皿放在 FM 载物台上，并使用培养皿加热器随附的夹子将其固定，对于超过 30 分钟的测量，应使用不依赖二氧化碳的培养基来代替普通培养基。
接下来，将一小滴 37 摄氏度的培养基涂抹在 A FM 悬臂的尖端，然后降低 A FM 头，直到尖端刚刚浸没在液体中。使用俯视图 CCD 相机重新对准悬臂上的激光束。由于介质折射率的变化，液体中的排列方式与空气中的排列方式不同。
对齐后，将 A FM 尖端接合培养皿的无细胞区域，并在液体环境中对反向光学杆灵敏度进行校准。要开始细胞的机械性能测量，请借助光学显微镜将悬臂尖端定位在细胞的珍珠眼区域上方。悬臂位置的精确调整是通过对 X 和 Y 扫描仪应用偏移来完成的。
然后将 a FM 切换到四光谱模式，并将压痕速率设置为每秒 5 微米，该速率足够低，可以避免流体动力学效应。接下来，将偏转触发点设置为 2 纳牛顿。为避免损坏细胞，请根据样品刚度调整此值。
此外，选择相对触发选项，这将校正偏转信号中的任何漂移。然后将力距离设置为 5 微米，以确保在两次力测量之间，尖端与电池完全分离。对于每种条件，在至少 30 个细胞的细胞核区域中的不同位置收集三条力曲线。
尽管在每个单元格上获取多条曲线是有益的。为了获得可靠的统计数据，服用过多会导致 A FM 探针的细胞刚度发生变化。使用力图模式进一步表征整个单元的机械性能分布。
在力图模式下，将扫描大小设置为 30 微米，将分辨率设置为 32 x 32，并且缩进参数与为单个力曲线选择的参数相同。然后，A FM 将在采样区域中的每个像素处获取单个力曲线，并提供整个区域的刚度图。接下来，使用 MATLAB 分析记录的力曲线以计算单元刚度。
首先采用 Lynette Al 首次发布的算法，该算法使用 matlab 计算每个点的线性拟合和赫兹拟合。计算两个拟合的相对 RMS 误差，并在每个点处对这些值求和。选择获得最小总拟合误差的点作为初始接触点，定位该点对于准确测量细胞杨氏模量至关重要。
接下来，计算样本变形增量。使用以下公式，在单元接触之前，变形等于零，其中 Z 小于 Z 零，等于悬臂挠度 D 与通过接触点的总距离 Z 之间的差值。然后使用以下公式计算缩进力 F，其中单元接触前的力等于零，其中 Z 小于 Z 零，等于悬臂的弹簧常数 K 乘以悬臂越过接触点的悬臂挠度。
然后将 Elise 方拟合应用于赫兹模型接触后区域中的样品变形与缩进力数据，以便根据所示使用的尖端形状提取单元的杨氏模量。以下是从三种不同表面培养的 3 个 T 3 个成纤维细胞中提取的代表性力曲线。正如您在这里看到的，不同的表面会极大地影响细胞骨架的刚度。
在硬塑料表面上培养的细胞的平均变形以红色显示。生长在坚硬聚丙烯酰胺凝胶上的石墨烯片以紫色显示，生长在弹性聚丙烯酰胺凝胶上的石墨烯片以蓝色显示。在仔细识别曲线中的接触点后，可以准确地显示作为单元变形函数的压痕力。
此外，他们的 Young 's 模块化，I 可以从接触后的前 300 纳米压痕中准确计算出来。这里显示的是转染了绿色荧光蛋白标记的 menton（一种中间丝）的成纤维细胞。图像越亮，该区域中的 menton 就越多。
这可能与细胞骨架的刚度有关。使用此处介绍的 A FM 力映射技术，可以显示分辨率为 32 x 32 像素的类似 fiberblast 刚度图，其中每个像素代表 2.5 x 2.5 微米的细胞表面积。看完这个视频后，它将对如何使用原子力显微镜测量活组织细胞的弹性有一个很好的了解。
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概述
本文展示了一种使用原子力显微镜（AFM）通过微缩入口来表征活细胞机械性质的协议。该研究重点关注通过力谱和数据分析测量活细胞的弹性模量。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞力学
- 生物物理学
- 原子力显微镜
背景
- 理解细胞的机械性质对于各种生物学应用至关重要。
- 原子力显微镜（AFM）允许对细胞刚度进行高分辨率测量。
- 弹性模量是评估细胞机械性质的关键参数。
- 力映射可以提供细胞刚度空间变化的详细洞察。
研究目的
- 使用AFM测量活细胞的弹性模量。
- 开发表征细胞机械性质的协议。
- 基于力映射数据创建细胞刚度的二维图。
使用的方法
- 在细胞的各个位置进行FM力谱测量。
- 分析强迫距离曲线以确定接触点。
- 将压入数据拟合到Hertz模型以提取弹性模量。
- 使用力映射模式生成细胞的二维刚度图。
主要结果
- 成功测量活细胞的弹性模量。
- 创建显示细胞刚度变化的详细二维图。
- 由研究生演示该协议。
- 建立了表征细胞机械性质的可靠方法。
结论
- 该协议为研究细胞力学的研究人员提供了宝贵的工具。
- 基于AFM的测量可以增强对细胞行为的理解。
- 未来的应用可能包括研究疾病状态和细胞反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of cell mechanical properties using atomic force microscopy (AFM) enables biopharma teams to assess cellular responses to microenvironmental changes, supporting early discovery and target validation. Reliable stiffness mapping informs mechanistic de-risking and predictive confidence in disease-relevant systems, directly impacting portfolio triage and translational research. Integrating AFM-based elasticity measurements strengthens decision-making at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of cell stiffness as a functional biomarker for physiological or pathological states.
- Supports mechanistic de-risking by correlating cytoskeletal changes with disease models or compound effects.
- Facilitates hypothesis testing regarding cellular responses to substrate or genetic perturbations.
- Provides quantitative endpoints for target validation in cell-based assays.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, quantitative force curves and stiffness maps for assay standardization.
- Enables high-content screening of mechanical phenotypes across multiple cell conditions.
- Supports development of robust, scalable assays for compound evaluation targeting cell mechanics.
- Improves assay readiness by integrating force mapping with automated data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanical property measurements with disease-relevant phenotypes for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking cell mechanics to functional outcomes.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, physiologically relevant data.
- Supports predictive de-risking in preclinical models by mapping mechanical heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-based cell stiffness measurement fits within the early discovery to preclinical continuum, providing a bridge between mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative force mapping clarifies cellular responses and de-risks biological hypotheses.
- Screening: Standardized force spectroscopy outputs enable reproducible comparison across conditions and compounds.
- Analytics: MATLAB-based analysis yields quantitative Young's modulus values and spatial stiffness maps for robust data interpretation.
- Translational Research: Mechanical phenotyping aligns with disease models and supports biomarker continuity.
- Enterprise Reuse: AFM protocols and analysis routines are adaptable across cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based models.
- Operational Value: Standardizes mechanical property measurement and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs based on functional cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, force spectroscopy, and quantitative data analysis.
- Demands access to calibrated AFM instrumentation and compatible analysis software (e.g., MATLAB routines).
- Necessitates cross-team standardization of calibration, measurement, and analysis protocols.
- Adaptable to various cell types and substrates with careful adjustment of indentation parameters.
- Potential limitations include probe-induced cell stress and the need for careful contact point identification.
