Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zu beschreiben, die zur Untersuchung der automatisierten Bildung von Lipiddoppelschichten unter Verwendung eines dünnen Polydimethylsiloxan-Films genutzt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Nanobiosensoren bezüglich der Wechselwirkungen zwischen Membranen und Proteinen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Bildung der Lipiddoppelschicht automatisiert und reproduzierbar ist.

Bereiten Sie zunächst die Pufferlösung vor, indem Sie Kaliumchlorid, Tris-Hydrochlorid und EDTA in destilliertem Wasser kombinieren. Danach stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 8,0 ein. Anschließend filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikron-Filter und autoklavieren sie bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten.

Bereiten Sie anschließend die Lipidlösung zur Vorbehandlung vor, indem Sie 3 % des Lipids in einer Mischung aus zwei Teilen Undecan und acht Teilen Hexadecan nach Volumen lösen. Rühren Sie die Lösung über Nacht mit einem Rotator. Bereiten Sie außerdem die Lipidlösung zur Membranbildung vor, indem Sie 0,1 % des Lipids in derselben Mischung aus zwei Teilen Undecan und acht Teilen Hexadecan nach Volumen lösen.

Rühren Sie diese Lösung ebenfalls über Nacht auf einem Rotator. Um einen PDMS-Dünnfilm herzustellen, mischen Sie neun Teile Prepolymer mit einem Teil Härter in einem Mischbecher. Geben Sie fünf Gramm dieser Mischung in eine Petrischale und beschichten Sie die Schale durch Aufdrehen bei 800 min⁻¹ für 10 Sekunden, um einen 200 bis 250 Mikrometer dicken Film zu erzeugen.

Als Nächstes die Petrischale in einen Vakuum-Exsikkator geben und zwei Stunden lang ein Vakuum von 100 Millitorr erzeugen, um verbleibende Luftblasen zu entfernen. Anschließend den Dünnfilm fünf Stunden lang bei 70 Grad Celsius im Ofen aushärten, um das PDMS zu polymerisieren. Nach dem Abkühlen den polymerisierten Dünnfilm in Quadrate von zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter schneiden und mit einem Lochstanzgerät mit 500 Mikrometer Durchmesser eine kleine Öffnung in die Mitte des Quadrats stanzen.

Verwenden Sie anschließend eine Mikropipette, um die Öffnungen mit einem Mikroliter der 3 %igen Lipidlösung vorzubestreichen. Um die Kammer für die schwarze Lipiddoppelschicht zu erstellen, entwerfen Sie mit einer 3D-Zeichnungssoftware zwei symmetrische Blöcke für die Kammer. Stellen Sie die Kammer anschließend aus einem PTFE-Block mithilfe einer CNC-Maschine her.

Um die Kammer zusammenzubauen, wird der vorgefärbte PDMS-Dünnfilm zwischen die beiden PTFE-Blöcke gelegt, sodass die Öffnung im PDMS-Dünnfilm mittig zur Bohrung in der Kammer ausgerichtet ist. Die äußeren Kanten der Kammer werden mit Deckglas und Vakuumfett abgedichtet. Nach dem Versiegeln wird die montierte Kammer mit Muttern und Schrauben fixiert.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Kammer gut verschlossen ist, damit keine Flüssigkeit austritt. Geben Sie mithilfe einer Pipette 0,5 Mikroliter der 0,1-%-Lösung auf die Öffnung des mit der Kammer montierten PDMS-Dünnschichtfilms. Anschließend stellen Sie die Kammer in eine gekühlte Umgebung unter 10 Grad Celsius und lagern sie, bis sie benötigt wird.

Um eine schwarze Lipiddoppelschicht mit beschleunigter Selbstassemblierung zu erzeugen, entnehmen Sie die Kammer dem Kühlschrank und geben zwei Milliliter der Pufferlösung auf jede Seite der Kammer. Stellen Sie die Kammer 10 Minuten lang beiseite, bis der gefrorene Membranvorläufer aufgetaut ist. Danach platzieren Sie die Kammer auf einem Mikromanipulator, um die Höhe präzise bezüglich der Lichtquelle und des Mikroskops zu steuern.

Beleuchten Sie mithilfe eines Halogen-Faseroptik-Illuminators eine Seite der Kammer, um die Öffnung des PDMS-Dünnschichtfilms aufzuhellen. Auf der gegenüberliegenden Seite platzieren Sie ein 20x-Objektiv in Linie mit der Öffnung und beobachten das Zentrum, wo die Farbe heller als im ringförmigen Bereich erscheint. Zur elektrischen Messung bereiten Sie Silberchlorid-Elektroden vor, indem Sie einen 208 Mikrometer dicken Silberdraht mindestens eine Minute lang in eine Lösung aus Natriumhypochlorit geben.

Verbinden Sie als Nächstes die Elektroden mit einem Mikroelektrodenverstärker. Platzieren Sie dann die Silberchlorid-Elektroden auf jeder Seite der Kammer, sodass sie in der Pufferlösung liegen. Erzeugen Sie mithilfe einer Elektrophysiologie-Software eine dreieckförmige Welle mit 10 Millivolt über die Membran, um eine Rechteckwelle zu erhalten.

Notieren Sie die elektrischen Eigenschaften der Membran, indem Sie auf die Aufnahmetaste klicken. Setzen Sie die Aufnahme fort, bis eine gleichmäßige Rechteckwelle beobachtet wird. Beenden Sie dann die Aufnahme, indem Sie auf das schwarze Quadratsymbol klicken.

Es können zwei Methoden angewendet werden, um Gramicidin A in die Lipiddoppelschicht einzubauen. Zunächst kann Gramicidin A direkt der Lipidlösung hinzugefügt werden, bevor die Lipidlösung auf die Öffnung der PDMS-Dünnschicht aufgetragen wird. Zweitens kann eine Gramicidin-A-Lösung der Kammer hinzugefügt werden, sobald sich eine Lipiddoppelschicht gebildet hat.

Um die Kanalaktivitäten von Gramicidin A zu beobachten, legen Sie eine Spannung von 100 Millivolt über die Membran bei einer Abtastrate von 5 Kilohertz an, um das Haltepotential der Membran zu messen. Nehmen Sie die elektrischen Eigenschaften wie zuvor beschrieben auf, indem Sie den Aufnahmeknopf betätigen. Sobald Ionenkanalaktivitäten sichtbar werden, setzen Sie die Aufnahme fort, bis verschiedene Stromsprünge beobachtet werden können, um die Integration der Ionenkanäle zu bestätigen.

Beenden Sie nach der Bestätigung die Aufnahme, indem Sie auf das schwarze Quadrat-Symbol klicken. Nach Beendigung der Aufnahme filtern Sie die Daten mit einem Tiefpass-Bessel-Filter bei 100 Hertz unter Verwendung von Elektrophysiologie-Software. Beobachten Sie die Stromsprünge in den gefilterten Daten der Haltespannung.

Diese Sprünge stellen die Dimerisierung eines Gramicidin-A-Ionenkanals dar. Wenn der gefrorene Membranvorläufer zur Auftauung auf Raumtemperatur gebracht wurde, wird die Bildung der Lipiddoppelschicht durch die Extraktion des hydrophoben Lösungsmittels in den PDMS-Dünnfilm begünstigt. Diese Abfolge von Bildern zeigt die Bildung einer Lipiddoppelschicht, die sich beim Erwärmen aus ihrer gefrorenen Form heraus selbständig zusammenlagert.

Hier veranschaulicht die elektrische Leitfähigkeit die Einlagerung und Dimerisierung von Gramicidin A. Nach der Dimerisierung bildet Gramicidin A einen Ionenkanal, und die Leitfähigkeitswerte springen auf 28 Pikosiemens, was mit den Ergebnissen früherer Berichte übereinstimmt und eine sofortige Einlagerung dieses Antibiotikums in die Doppelschicht zeigt. Unsere Membranbildungs-Technik bietet im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, die begrenztes Potenzial für die praktische Anwendung haben, ein leistungsfähiges Werkzeug für Untersuchungen von Zellmembranen und Nanokanälen. Unser System erfordert keine besonderen Fachkenntnisse für die Membranbildung oder die Einlagerung von Ionenkanälen und eignet sich daher gut für Anwendungen in der Wirkstoffscreening- und Biosensorik.