基本的有丝分裂纺锤体的重组在球形乳液液滴
2016年8月13日
有丝分裂纺锤体的组装和定位取决于微管动力学、运动蛋白和交联剂产生的联合力。在这里，我们介绍了我们最近开发的方法，其中球形乳液液滴的几何限制用于基本有丝分裂纺锤体的自下而上重建。
该程序的总体目标是在油乳液液滴中水的几何限制内重建有丝分裂纺锤体状结构。这种方法可以帮助回答有丝分裂纺锤体组装领域的关键问题，例如纺锤体如何定位和组装，以及单个组件对这些过程的具体贡献是什么？该技术的主要优点是我们使用自下而上的方法在模拟有丝分裂细胞形状的几何限制内重建纺锤体状结构。
该方法也可用于研究依赖于细胞限制的其他过程。将 10 份 PDMS 预聚物与 1 份固化剂混合，总质量约为 40 克。然后，将混合物放入真空室中约 30 分钟以去除气泡。
同时，将铝箔包裹在模具周围，制成一个直径为 4 英寸的一厘米深的杯子。准备好后，将大约 3/4 的 PDMS 混合物倒入模具中。然后，将 PDMS 放回真空室中再放置 30 分钟。
脱气后，在 100 摄氏度下固化 PDMS 一小时。同时，用压缩空气除尘，准备一些用于旋涂的载玻片。然后，将剩余的 PDMS 混合物旋涂到载玻片上。
将这些载玻片在 100 摄氏度下固化一小时以硬化 PDMS。接下来，使用剃须刀片轻轻剥离 PDMS，并从 PDMS 条带上打出所需的孔，以制作微流控芯片。现在，电晕对微流体芯片和 PDMS 涂层的载玻片进行几秒钟的处理。
最后，将微流控芯片放在每个载玻片上，通道朝下，并在 100 摄氏度下烘烤芯片过夜。首先，使用氯仿清洗的玻璃器皿，制备约 250 微克氯仿溶解的脂质。用惰性气体小心地干燥脂质混合物。
然后将其放入真空室中放置一个小时。然后，将脂质溶解在矿物油和 2.5% 表面活性剂中，至每毫升 0.5 毫克，即约 500 微升。要完全溶解脂质，请在 40 kHz 下对混合物进行 30 分钟的超声处理。
接下来，将 PDMS 旋涂到厚度与显微镜物镜相匹配的盖玻片上。然后，将 PDMS 旋涂到载玻片上。现在，将涂有 PDMS 的盖玻片和载玻片在 100 摄氏度下固化一小时。
然后，通过将实验室密封膜的薄片紧密分布在 PDMS 涂层的载玻片上来制作流通池。放置三个毫米条带，相距约 2 毫米。然后，用涂有 PDMS 的盖玻片覆盖流通池，并在 100 摄氏度下熔化薄膜片刻以密封组件。
加热后，轻轻按下盖玻片并用 Valap 密封。接下来，准备用于长期成像的 PDMS 杯。在 3 毫米厚的 PDMS 切片上打一个直径为 4 毫米的孔。
然后，电晕处理 PDMS 切片和 PDMS 涂层盖玻片。处理后，将它们放在一起，并在 100 摄氏度下烘烤组件过夜。在倒置明场显微镜上监测液滴的形成。
将脂质油相连接到压力控制器，并增加压力，直到一滴油从峰管中流出。将峰管连接到微流体芯片的入口 2。然后，用来自入口 2 的脂质油相完全填充微流体芯片。
接下来，从入口 1 引入基于 MRB-80 的水相。通过改变脂质油相和水相压力来控制液滴大小，以产生直径约为 15 微米的液滴。脂油相约为 800 毫巴，水相约为 200 毫巴，这是一个很好的起点。
获得所需的液滴大小后，用液滴完全填充流通池。这些液滴是使用少量水相形成的。这意味着微流体装置需要快速运行，以免在形成正确大小的液滴之前失去整个水相。
填充后，使用 Valap 小心地关闭流通池的末端。如果液滴没有停止移动，则密封不完整，或者可能引入了气泡。对于长期成像，将液滴转移到 PDMS 杯中，并覆盖一层油脂混合物。
在室温下解冻中心体，并将其在 37 摄氏度下放置 20 分钟，以确保微管成核正常。等待时，在冰上准备测定混合物。这应包含微管蛋白、GTP、除氧系统、分子力发生器（如微管交联剂）、ATP 和 ATP 再生系统。
混合后，将样品在冷却的 Airfuge 转头中以 30 psi 离心 3 分钟。然后，将预热的中心体添加到混合物中。优化添加的中心体数量，使每个液滴获得一个或两个中心体。
然后，如前所述，使用这种混合物产生乳剂液滴。为了将动力蛋白募集到液滴皮层的生物素化脂质中，将 GFP-动力蛋白 TMR 和链霉亲和素添加到水相中。在转盘式共聚焦显微镜上，在 26 摄氏度下观察 30 分钟后微管的生长。
成像时，可以通过将温度提高到 28 甚至 30 摄氏度来促进微管生长。对于 Z 投影，采用 1 微米间隔的堆栈，每个液滴大约需要 20 张图像。转到主相机面板，单击 编辑 Z，然后将 Z 步长设置为 1.0。
点击 下一步 存储设置。接下来，通过单击"采集"面板中的"相机"选项卡，并将"EM 增益"条滑动到 300 来设置最大线性 EM 增益。然后，在同一选项卡中将 Exposure Time （曝光时间） 设置为 200 毫秒。
点击 Record 存储设置。对于实时成像实验，通过将曝光时间减少到大约 100 毫秒，并将 Z 间隔增加到 2 微米，每两分钟进行一次 Z 投影，持续两个小时。对于实时成像实验，请使用 PDMS 杯代替普通流通池，以最大限度地固定样品。
使用所描述的方案，研究了在含有中心体的水和油乳液滴中紫菀的形成。最初，中心体在受限体积内自由扩散。大约 20 到 30 分钟后，第一批微管变得可见，并且随着微管向各个方向逆着皮层生长，中心体的扩散受到限制。
当微管长到液滴直径的一半以上时，中心体被推到相反的边界，微管沿着液滴皮层生长。如果没有链霉亲和素，dymeine 会在液滴内弥散。然而，对于链霉亲和素，在液滴形成后约 10 分钟内，动力蛋白会与生物素化脂质连接。
当在皮质动力蛋白存在下观察荧光微管蛋白时，很明显中心体位于中心位置。而在没有动力蛋白的情况下，中心体被推到液滴的相对两侧。这可能是由于动力蛋白促进微管灾难和皮质拉力，从而导致紫苑居中。
看完这个视频，你应该对如何使用微流控技术在球形乳液液滴中创建纺锤状结构有了很好的了解。一旦掌握，如果作得当，可以在 2 到 3 小时内完成液滴形成和成像。使用该程序，可以封装其他纺锤体装配因子，以研究它们对纺锤体形态和定位的影响。
使用氯仿或 PDMS 时应始终采取预防措施，例如戴手套。
概述
本研究提出了一种使用油包水乳滴在几何限制内重建有丝分裂纺锤体样结构的方法。该方法旨在阐明有丝分裂纺锤体的组装和定位机制。
研究的关键组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 生物物理学
背景
- 有丝分裂纺锤体对细胞分裂至关重要。
- 了解纺锤体动力学可以揭示细胞过程的洞察。
- 几何限制模仿细胞环境。
- 以往的方法缺乏有效的重建技术。
研究目的
- 开发一个自下而上的方法来研究纺锤体组装。
- 研究纺锤体动力学中个体组成部分的贡献。
- 探索限制对细胞过程的影响。
使用的方法
- 准备用于微流控芯片的PDMS模具。
- 使用受控压力形成脂质滴。
- 结合中心体和微管组件。
- 使用共聚焦显微镜对微管生长进行实时成像。
主要结果
- 在滴中成功重建了纺锤体样结构。
- 观察到限制下的微管动力学。
- 洞察个体组成部分在纺锤体组装中的作用。
- 展示了该方法对其他细胞过程的适用性。
结论
- 该方法为研究有丝分裂纺锤体提供了新的平台。
- 几何限制对模拟细胞条件至关重要。
- 进一步的研究可以扩展对纺锤体动力学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reconstituting mitotic spindle-like structures in geometrically confined emulsion droplets enables precise dissection of force-generating components critical for cell division. This bottom-up system provides a controlled platform for mechanistic de-risking and target validation in early discovery, supporting predictive confidence in cytoskeletal drug target portfolios. The approach bridges the gap between in vitro reconstitution and disease-relevant cellular complexity, informing risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of individual spindle assembly factors under defined conditions.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of microtubule motors, cross-linkers, and cortical anchors.
- Facilitates functional target validation by recapitulating cellular confinement and force-balance.
- Provides a platform for hypothesis-driven testing of cytoskeletal modulators.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, confined biological systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative outputs on microtubule dynamics and spindle positioning.
- Enables assay standardization and scalability for compound evaluation targeting spindle components.
- Supports platform reuse for diverse cytoskeletal perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro force-balance measurements with disease-relevant mitotic defects.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical model validation of spindle-targeting agents.
- Informs translational biomarker development by quantifying spindle assembly phenotypes.
- Reduces late-stage biological risk by clarifying mechanistic underpinnings of mitotic failure.
Pipeline & Workflow Integration
This reconstitution method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation for cytoskeletal targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on force generation and spindle assembly mechanisms.
- Screening: Provides assay-ready, confined systems with reproducible quantitative readouts.
- Analytics: Enables measurement of spindle positioning, microtubule dynamics, and force-balance outputs.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant mitotic phenotypes and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various spindle assembly factors and perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spindle-targeting programs.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible assay systems for cytoskeletal research.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitotic and cytoskeletal targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, cytoskeletal biochemistry, and advanced imaging.
- Demands access to microfabrication, confocal microscopy, and pressure-controlled droplet generation infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of droplet formation and imaging protocols.
- Adaptation to other model systems may require optimization of confinement and component concentrations.
- Practical limitations include throughput constraints and the need for precise control of component stoichiometry.
