通过成像流式细胞术表征人单核细胞来源的树突状细胞：两种单核细胞分离方案的比较

本研究的总体目标是比较两种不同的人单核细胞分离方法用于体外树突状细胞生成的效果，并通过成像流式细胞术表征所得单核细胞来源群体的CT11c、CT14细胞表面表达。这些单核细胞分离方案有助于建立可靠的方法，用于科研和临床应用中人树突状细胞的纯化。这些方案的主要优势在于能够促进人单核细胞的分离及其向具有活力和功能性的单核细胞来源细胞的分化。

此外，本研究是首次通过单细胞成像流式细胞术对单核细胞来源的树突状细胞的特定群体进行表征。该方法也可作为分离其他稀有细胞的替代方法，能够获得足够产量以满足后续研究应用的需求。这些方法的可视化演示至关重要，因为在缺乏适当指导和经验的情况下，安全处理血液样本可能具有挑战性。

首先，将血液样本与PBS按1:1比例在T75培养瓶中稀释。然后，向50毫升离心管中加入15毫升密度梯度溶液，并小心地将25至30毫升稀释后的血液叠加在梯度液上方。为实现外周血单个核细胞的有效分离，需迅速但小心地将血液加至密度梯度溶液上，避免混合各层。

通过离心分离细胞，随后将白细胞界面层转移至新的50毫升锥形管中。用PBS洗涤细胞两次，将最终的细胞沉淀重悬于10毫升氯化铵-钾裂解缓冲液中，在4摄氏度下孵育15分钟。然后再用PBS洗涤细胞两次。

采用贴壁法分离单核细胞时，将所得PBMC沉淀中的5 × 10⁷个细胞接种于新的T75培养瓶中，每10 mL完全培养基接种五倍，于37°C、5%二氧化碳的湿润培养箱中培养2小时。培养结束后，弃去未贴壁的悬浮细胞，并用PBS轻柔洗涤贴壁细胞两次。随后，加入补充了人源GM-CSF和IL-4的完全细胞培养基培养贴壁细胞，并将培养物放回培养箱继续培养5至7天。

通过磁性分离法分离单核细胞时，首先经密度梯度离心收集外周血单个核细胞（PBMC），将白细胞层转移至一个5毫升聚苯乙烯管中，并用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，使细胞浓度达到每毫升5×10⁷个细胞。随后，每毫升细胞悬液中加入50微升人单核细胞富集混合液，混匀后在4摄氏度条件下孵育10分钟。接着，每毫升细胞悬液中加入50微升磁性颗粒，轻柔混匀，并在4摄氏度条件下孵育5分钟。

第二次孵育结束时，向细胞中加入 PBS，使总体积达到 2.5 毫升，并用移液器吹打混匀 2 至 3 次。然后将聚苯乙烯管置于适当的磁力架中，室温放置。2.5 分钟后，保持试管仍在磁铁中，将纯化的单核细胞组分倾入新的 15 毫升锥形管中。

随后，将纯化的单核细胞与添加了GM-CSF和IL-4的完全细胞培养基共同培养5至7天，方法如前所述。经过7天的分化后，将每份含有1×10⁶个单核细胞来源的树突状细胞的细胞悬液分装至适量的1.5毫升离心管中，并向每份样品中加入50微升热灭活的人血清，以阻断任何非特异性结合。孵育10分钟后，离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于适量的荧光标记的一抗中，在4摄氏度避光孵育20分钟。

随后用一毫升 PBS 洗涤细胞两次，每 1×10⁶ 个细胞用 100 微升 PBS 重悬沉淀。分析前立即向每根试管中加入一微升 DAPI。然后根据制造商说明书，使用单细胞成像流式细胞仪检测样品。

通常情况下，通过贴壁法分离的单核细胞约占外周血单个核细胞（PBMC）群体总数的6.2%，而通过磁珠分选法分离的单核细胞可占到总PBMC群体的25%。两种方法分离得到的单核细胞均具有同等的活力。由这两种方法纯化的单核细胞分化而来的MDDC首先根据总单细胞中DAPI阴性或活细胞进行设门，随后对各细胞群进行分群分析。

两种分离方法均获得较低比例的单CD14阳性细胞群，且两种方法均获得较高比例的总CD11c阳性细胞群。对所有CD11c阳性细胞进行了进一步的表型分析，尽管磁珠分离法获得的CD11c阳性CD14阳性双阳性细胞比例较高，但与贴壁分离法相比，该差异无统计学显著性。这些CD11c阳性、CD14阳性双阳性细胞可能是处于早期分化阶段的单核细胞来源树突状细胞（MDDCs），尚未丢失CD14单核细胞标志物。

在分析单个CD11c阳性细胞时，贴壁法获得的CD11c阳性、CD14阴性细胞数量最多。这些单阳性细胞可能是处于晚期分化阶段的MDDC。一旦掌握，贴壁法和磁珠分选技术若操作得当，分别可在3至4小时和1至2小时内完成。

进行此操作时，重要的是每次更换培养基时（每48小时）都应使用新鲜的树突状细胞分化细胞因子。处理血液等生物危害性液体时可能具有极大的危险性，因此在执行这些操作时，必须始终采取适当的个人防护装备和废弃物处理方法。本研究为免疫学领域的研究人员探索利用人单核细胞和树突状细胞进行治疗性治疗奠定了基础。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何优化人单核细胞的分离，以体外生成不同类型的单核细胞衍生细胞群体。