通过成像流式细胞仪人单核细胞来源的树突状细胞的特征:两个单核细胞分离方法的比较

本研究的总体目标是比较体外树突状细胞生成的两种不同的人单核细胞分离方法，并通过成像流式细胞术表征所得单核细胞衍生群体的 CT11c、CT14 细胞表面表达。这些单核细胞分离方案有助于开发可靠的方法，用于纯化人树突状细胞，用于研究和临床应用。这些方案的主要优点是它们有助于分离人单核细胞并将其分化为活的和功能性的单核细胞衍生细胞。

此外，这是第一项通过单细胞成像流式细胞术表征单核细胞衍生树突状细胞特定群体的研究。该方法还可以用作以足够产量分离其他稀有细胞的替代方案，用于下游研究应用。这些方法的目视演示至关重要，因为如果没有适当的指导和经验，安全处理血液样本可能具有挑战性。

首先在 T75 培养瓶中用 PBS 将血液样品稀释至一比一的比例。然后，将 15 毫升密度梯度溶液加入 50 毫升离心管中，并小心地将 25 至 30 毫升稀释的血液分层于梯度上。为了实现外周血单核细胞的适当分离，将血液快速但小心地加载到密度梯度溶液上，不要混合各层。

通过离心分离细胞，然后将白细胞界面层转移到新的 50 毫升锥形管中。在 PBS 中洗涤细胞两次，将最终沉淀重悬于 10 毫升氯化铵钾裂解缓冲液中，在 4 摄氏度下 15 分钟。然后在 PBS 中再洗涤细胞两次。

为了通过粘附法分离单核细胞，在新的 T75 培养瓶中，每 10 毫升完全培养基中对所得 PBMC 沉淀的 7 个细胞进行 5 乘以 10 的培养，在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳中培养 2 小时，在加湿培养箱中培养 5 小时。孵育结束时，丢弃非贴壁漂浮细胞，并用 PBS 轻轻洗涤贴壁细胞两次。然后，用补充有人 GMCSF 和 IL4 的完全细胞培养基喂养贴壁细胞，并将培养物放回培养箱中 5 至 7 天。

为了通过磁性分离分离单核细胞，通过密度梯度分离收集 PBMC 后，将白细胞层转移到 5 毫升聚苯乙烯管中，并以每毫升 10 至 7 个细胞的 5 倍浓度将细胞重悬于 PBS 中。接下来，将每毫升 50 微升人单核细胞富集混合物混合到细胞中，并将细胞与混合物在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。然后每毫升细胞加入 50 微升磁性颗粒，小心混合，并在 4 摄氏度下孵育细胞 5 分钟。

在第二次孵育结束时，向细胞中加入 PBS，使总体积达到 2 点 5 毫升，并通过移液 2 至 3 次进行混合。然后将聚苯乙烯管置于室温下的适当磁性装置中。两分半钟后，在试管仍在磁力架中的情况下，将纯化的单核细胞组分倒入新的 15 mL 锥形管中。

刚才所示，将纯化的单核细胞和补充有 GMCSF 和 IL4 的完全细胞培养基培养 5 至 7 天。分化 7 天后，将 10 倍单核细胞衍生的树突状细胞的 6 个细胞等分试样分配到适当数量的 1 点 5 毫升试管中，并向每个样品中加入 50 微升热灭活人血清，以阻断任何非特异性发现。10 分钟后，离心细胞并将沉淀物重悬于适当的荧光偶联一抗中，在 4 摄氏度下避光放置 20 分钟。

然后在 1 毫升 PBS 中洗涤细胞两次，将沉淀重悬于 100 微升 PBS 中，每 1 次 10 次，以重悬至 6 个细胞中。在分析之前，向每个试管中加入 1 微升 DAPI。然后，根据制造商的说明在单细胞成像流式细胞仪上读取样品。

平均而言，通过粘附方法分离的单核细胞约占外周血单核细胞 （PBMC） 总细胞群的 6.2%，而通过磁分离分离的单核细胞占总 PBMC 的 25%。通过任一方法分离的单核细胞都同样有活力。首先根据来自总单细胞的 DAPI 阴性或活细胞对从两种方法纯化的单核细胞分化的 MDDC 进行门控，然后对每个细胞群进行门控。

两种分离方法都产生了较低的单个 CD14 阳性群体，两种方法都产生了较高的 CD11c 总阳性群体。对所有 CD11c 阳性细胞进行了进一步的表型分析，尽管磁性分离给出了更高百分比的双阳性 CD11c 阳性 CD14 阳性细胞，但与粘附方法相比，这种影响不显著。这些双阳性 CD11c 阳性、CD14 阳性细胞可能是尚未去除 CD14 单核细胞标志物的早期分化 MDDC。

在分析单个 CD11c 阳性细胞时，贴壁法可获得最高的 CD11c 阳性、CD14 阴性细胞产量。这些单个阳性细胞可能是晚期分化的 MDDC。一旦掌握，如果作得当，粘附和磁隔离技术可以分别在 3 到 4 和 1 到 2 小时内完成。

在尝试此程序时，请务必记住，当培养基补充时，每 48 小时补充一次新鲜的树突状细胞分化细胞因子。使用血液等生物危害液体可能非常有害，因此在执行这些程序时应始终使用适当的个人防护设备和处置方法。这项研究为免疫学领域的研究人员探索利用人类单核细胞和树突状细胞进行治疗铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何优化人单核细胞分离以在体外生成不同群体的单核细胞衍生细胞有很好的了解。