通过全血流式细胞术分析表征人单核细胞亚群

该技术有助于解答免疫学领域的关键问题，例如，确定在疾病状态下单核细胞亚群的比例或不同标志物的表达如何发生变化。该技术的主要优势在于细胞接近其天然状态，并且采用清晰的说明和合理的依据，提供了一种标准化的设门方法。

通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为许多论文并未明确说明细胞设门的具体操作步骤。请按照文本方案中的详细说明，首先采集血液样本并测定白细胞计数。用磷酸盐缓冲液稀释血液，将白细胞浓度调整至每毫升约500万个。

通过混合血液、抗CD14-V450、抗CD16-APC和抗HLA-DR-PerCP，配制足够数量的主混合液用于所有反应管。涡旋混匀后，将51.9 µL混合液移入每根试管中。向对应的试管中分别加入PE标记的M1和M2标志物抗体，以及T细胞、B细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞的标志物抗体。

涡旋并在4°C避光孵育30分钟。然后加入250 µL红细胞裂解液与白细胞固定液的混合溶液，立即轻轻涡旋混匀。将涡旋后的混合物在4°C避光孵育10分钟。

10分钟后，加入250 µL PBS，于室温下以260 ×g离心10分钟，沉淀细胞。弃去上清液，将细胞重悬于300 µL 1%甲醛中。避光，于4°C保存，直至进行分析。

流式细胞术应在样本制备后的48小时内进行。开始前，检查流式细胞仪日志，以确保设施工作人员已完成质量控制检查。设置流式细胞术实验时，依次点击“新建实验”、“新建样本”和“新建试管”，以添加试管。

单击图标选择双变量图，并使用下拉菜单选择通道参数。确保包含 CD16/CD14 图以及一个检测器与时间关系图，以监测采集过程。插入样本管，然后单击“采集”。

检查仪器的电压设置，确保检测器信号未超出量程。观察CD14/CD16图中位于单核细胞门内的细胞。将经典单核细胞门的记录阈值设为5,000个事件，然后点击记录。

继续记录其余试管的数据。在所有试管的数据记录完成后，将流式数据导出为 fcs 文件以供分析。进行单核细胞设门时，在分析软件中打开文件，双击试管名称，然后从下拉菜单中选择参数，以在前向散射面积（FSC-A）对前向散射高度（FSC-H）图上显示细胞。

通过单击多边形门控工具图标并圈选细胞，创建双联体排除门。通过双击已圈选区域来选择门控细胞。在新显示框中，调整下拉菜单参数，以在前向散射面积与侧向散射面积图上显示细胞。

单击矩形门控图标，根据前向散射和侧向散射特性，宽泛地圈选单核细胞群体，以排除大部分淋巴细胞、自然杀伤细胞和粒细胞。选择已圈选的细胞，并在 CD14/CD16 图上重新显示，通过下拉菜单选择相应参数。单击多边形门控工具，根据单核细胞特有的倒L形特征来圈选单核细胞。

如果非经典亚群与其左侧细胞无明显区分，则可能存在污染，应进行排查。选择设门的细胞，通过下拉菜单选择参数，将单核细胞显示在CD16与HLA-DR图上。点击多边形门以选中HLA-DR阳性细胞，并排除残留的自然杀伤细胞和中性粒细胞。

使用下拉菜单选择参数，选中门控细胞并在 CD14/HLA-DR 图中显示 HLA-DR 阳性细胞。单击多边形门控，绘制门控以排除 HLA-DR 高表达/CD14 低表达的 B 细胞。选中门控细胞后，使用下拉菜单在 CD16/CD14 图中显示这些细胞。

在图示选项中，选择“斑马图”，以启用单核细胞亚群门控，用于确定各亚群的比例。接着，点击矩形门控图标，通过在CD14高表达/CD16低表达的经典单核细胞群体周围绘制近似矩形门控来圈选经典单核细胞。在显示选项中，选择“显示中位值”，以显示经典单核细胞的中位荧光强度。

调节门控，使门内细胞群在中位数左右两侧分布均匀，并包含左侧的所有细胞。通过绘制一个矩形门控来选中经典门控右侧的细胞，从而选择中间型细胞群。通过将门控下边界与经典单核细胞门控内完全包含的同心圆的下缘对齐，调整门控下边界以排除非经典型细胞。

通过从中间亚群的下边缘向下绘制一个矩形框，选择位于群体底部的所有细胞，从而圈定非经典亚群。在显示选项中，选择“显示门控频率”，以确定每个单核细胞亚群的百分比。最后，从每个单核细胞亚群中选择细胞。

调整下拉参数，为每种单核细胞亚群创建直方图，以显示各标记物。然后，按照文本方案中所述，采用中位数或几何平均值计算表达程度。成功设门的单核细胞群体如下所示。

其比例与文献中的数据一致。本样本的比例计算为：经典型占88.1%，中间型占4.33%，非经典型占7.49%。通过评估其他细胞群体的相对位置可以明显看出，在CD16/CD14图谱中，此处以蓝色显示的T细胞和中性粒细胞位于单核细胞倒L形区域之外。

然而，此处以蓝色显示的自然杀伤细胞和B细胞群体与非经典单核细胞群体存在重叠。此处展示的热图证实了污染性细胞类型已被去除。自然杀伤细胞通过HLA-DR和CD16分选步骤被排除，而B细胞则通过HLA-DR和CD14分选步骤被排除。

此处显示了相对于红色同型对照的蓝色M1和M2标志物的表达情况。M1标志物CD120b在所有单核细胞亚群中均明显高于其同型对照。M2标志物CD93也呈现类似趋势，其表达水平在经典型单核细胞中较高，在中间型中等，在非经典型中较低。

在进行该实验操作时，重要的是要记住确保将污染性细胞通过设门排除，因为这些细胞可能会干扰定量表达的准确性。完成该操作后，可进一步检测其他标志物。为了回答更多科学问题，例如单核细胞标志物在疾病状态下的表达变化情况。

请注意，处理人血和甲醛可能存在危险，因此在进行本实验操作时，必须采取个人防护装备、使用生物安全柜等预防措施。