全血流式细胞术分析人单核细胞亚群的表征

在这里, 我们提出了一个通过全血流式细胞仪表征单核细胞子集的协议。这包括概述如何门的子集和评估他们的表面标记的表达, 并提供了一个例子, 评估 M1 (炎症) 和 M2 标记 (抗炎) 的表达。

这种技术可以帮助回答免疫学领域的关键问题。例如，确定单核子集比例或不同标记的表达在疾病状态中是如何变化的。此技术的主要优点是，细胞接近其本机状态，并且使用明确的指令和说明，以提供标准化的浇注方法。

一般来说，对这种方法的新鲜人可能难以为之奋斗，因为许多论文没有给出关于如何进行细胞浇注的明确说明。开始此协议与收集血液样本和确定白血球计数，如文本协议中详细说明。用磷酸盐缓冲盐水稀释血液，将浓度调整为每毫升约500万白血球。

通过结合血液、抗 CD14-V450、抗 CD16-APC 和抗 HLA-DR-PerCP，为管数准备足够的主混合。涡流和移液器 51.9 微升混合到每个管中。添加标记为M1和M2标记抗体的PE，以及T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞和天然杀伤细胞的标记到相应的管中。

漩涡和孵育30分钟，在黑暗中4摄氏度。现在，加入250微升的红细胞解合和白细胞固定溶液，并立即轻轻涡旋混合物。在黑暗中，在摄氏4度下孵育涡旋混合物10分钟。

10分钟后，加入250微升PBS，在室温下以260g的光转，10分钟。去除上一代，将细胞重新在300微升中，其1%甲醛。将细胞储存在四摄氏度，防止光线，直到进行分析。

流动细胞测量应在样品制备后48小时内完成。首先，检查流量环流仪日志，以确保设施人员已执行质量控制检查。要设置流式细胞学实验，请单击新的实验，然后点击新的标本和新管，添加管子。

通过单击图标并选择双变量图，并使用下拉菜单选择访问参数。确保包含 CD16/CD14 图和显示探测器的图以及同时显示时间图，以监控采集情况。插入管子并单击，获取。

检查仪器电压设置，确保检测器信号不缩小刻度。观察落在 CD14/CD16 图单核门中的细胞。将经典单核门的录制阈值设置为 5，000 个事件，然后单击记录。

继续记录其余管的数据。记录所有管的数据后，将流数据导出为 fcs 文件进行分析。要执行单核门控，请在分析软件中打开文件，双击管名称，然后从下拉菜单中选择参数，以可视化向前散点区域与向前散射高度图上的单元格。

通过单击多边形门工具图标并包围单元格，创建双精度排除门。通过双击封闭区域来选择封闭单元格。在新的显示框中，调整下拉菜单参数以显示前进散射区域与侧面散射区域图上的单元格。

单击矩形门图标，根据向前和侧面散射特性慷慨地选择单细胞群体，以排除大多数淋巴细胞、自然杀伤细胞和粒细胞。选择封闭单元格并在 CD14/CD16 绘图上重新播放，使用下拉菜单选择参数。单击多边形门，根据单核细胞的特征选择反转的 l 形状。

如果非经典种群与左侧的细胞没有区别，那么污染是可能的，应该进行调查。选择封闭单元格，并使用下拉菜单选择参数，在 CD/16 HLA-DR 绘图上显示单核。单击多边形门以选择 HLA-DR 阳性细胞，并排除任何剩余的自然杀伤细胞和中性粒细胞。

选择封闭单元格，并使用下拉菜单在 CD14/HLA-DR 绘图上显示 HLA-DR 正单元格以选择参数。单击多边形门，并绘制一个门以排除 HLA-DR 高/CD14 低 B 单元格。选择封闭单元格并使用下拉菜单在 CD16/CD14 绘图上显示它们。

从绘图选项中，选择斑马图，该图将启用单核子集门，以确定子集比例。现在，单击矩形门图标，通过围绕 CD14 高/CD16 低经典单核组绘制近似矩形门来选择经典单核。在显示下，选择，显示中位数，以显示经典单核细胞的中位荧光强度。

调整门，使总体与左侧和右侧的中位数具有相等的分布，并包含左侧的所有单元格。通过绘制包含经典门右侧单元格的矩形门来选择中间群体。通过将栅极与完全在经典单核栅门内的同心圆底部对齐，调整栅极底部以排除非经典细胞。

通过从中间子集的下边缘向下绘制一个矩形框，选择所有单元格到总体底部，来网格非经典子集。在"显示"下，选择"显示栅极频率"以确定每个单核子集的百分比。最后，从每个单核子集中选择单元格。

更改下拉参数，为每个单核子集创建直方图，显示每个标记。然后，使用中位数或几何均值计算表达式的程度，如文本协议中所述。此处显示了成功封闭的单核群。

比例与文献中的比例一样。该样本的比例计算为，88.1%经典，4.33%中间体和7.49%非经典。通过评估其他种群的相对位置，很明显，此处显示的 T 细胞和中性粒细胞在 CD16/CD14 图上跟随单核细胞、反转 l 形状之外。

然而，自然杀伤细胞和B细胞群，以蓝色显示，与非经典单细胞群重叠。此处显示的热图确认已移除污染细胞类型。自然杀伤细胞已被HLA-DR CD16步门，而B细胞则被HLA-DR CD/14步门。

此处显示了 M1 和 M2 标记的蓝色表达式（相对于其同型控件（红色）。CD120b M1 标记显示所有单核子集的等型控制上方的明显变化。CD93 也是 M2 标记，在经典中表达较高，中间体中为中等，非经典为低。

在尝试此过程时，重要的是要记住确保污染细胞被封闭，因为它们可以有助于量化的表达式。按照此过程，可以检查其他标记。为了回答其他问题，例如，单细胞标记表达在疾病中如何变化。

不要忘记，使用人体血液和甲醛可能是危险的，因此在执行此程序时，应始终采取预防措施，如个人防护装备和使用生物危害罩。