高通量基因标记在Trypanosoma brucei中的应用

本方法的总体目标是以高通量方式对布氏锥虫（Trypansoma brucei）中的蛋白质进行标记。该方法有助于解答动基体生物学领域中有关大量蛋白质定位及其潜在功能的关键问题。该技术的主要优势在于，可同时快速、简便地对大量蛋白质进行标记。

尽管该方法可提供有关定位的信息，但也可通过使用其他标签来研究大量蛋白质之间的相互作用。例如，可用于生物素邻近标记（bio-ID） proximity mapping 实验的 BirA 标签。本实验操作将由本实验室的研究助理 Ross Madden 演示。

开始此操作之前，先将一个96孔PCR冷却器在-80摄氏度冰箱中预冷冻。在10毫升离心管中配制主混合液A，包含以下组分：2,100微升去离子蒸馏水、105微升PCR级DMSO、105微升10毫摩尔/升dNTPs以及105微升pPOT模板。

将主混合液A倒入试剂储液槽中，并将23微升主混合液A分装至96孔PCR板的每个孔中。使用P20十二通道多通道移液器，向每个已加样孔中加入2微升100微摩尔的混合引物。用封板膜密封PCR板。

将其置于预冷的PCR冷却器上，并在负80摄氏度下冷冻至少20分钟。即使使用特定的热启动聚合酶，PCR主混合液A的冷冻步骤也至关重要，以确保高效的热启动反应，从而实现可重复且高产量的扩增。

当PCR板置于冷冻机中时，准备配制混合液B。在10毫升离心管中加入以下组分：2,048微升去离子蒸馏水、525微升10X缓冲液和52.5微升聚合酶，每块PCR板总反应体积为2,626微升。从-80摄氏度冰箱中取出PCR板和PCR冷却器。

将 PCR 冷却器上的反应板保持原位，迅速在每个孔中已冷冻的主混合液 A 上方加入 25 µL 主混合液 B，使总反应体积达到 50 µL。此步骤具有严格的时间要求，必须在主混合液 A 融化前完成。用封板膜密封反应板。

按如下设置PCR仪：94 °C 预变性10分钟，然后进行30个循环，每个循环包括94 °C 变性15秒、65 °C 退火30秒、72 °C 延伸2分钟，最后在72 °C 下终延伸7分钟。当加热模块温度达到94 °C 后，将PCR板放入PCR仪中，并启动扩增程序。

开始本实验前，先在Tris-乙酸EDTA（TAE）电泳缓冲液中制备一块含有四排加样孔的大尺寸1%琼脂糖凝胶。在每排的第一个和第28个加样孔中加入1 kb DNA Marker。下一步，按照此处所示模式，将2 µL PCR产物直接上样至凝胶的每个泳道中，无需添加DNA上样缓冲液。

例如，将PCR板中A行和B行的PCR产物分别加入凝胶第一行的奇数孔和偶数孔中。为尽快完成操作以减少扩增产物污染的可能性，先将PCR板中A行的PCR产物加入凝胶第一行的奇数孔，随后将PCR板中B行的PCR产物加入凝胶第一行的偶数孔。

按照相同模式加载PCR板中C行和D行的PCR产物，将C行加入凝胶第二行的奇数编号加样孔，D行加入第二行的偶数编号加样孔。持续按照此加样模式操作，直至PCR板的每个孔中的样品均已被加载到凝胶上。将凝胶放入电泳槽中，并加入TAE电泳缓冲液至完全浸没凝胶。

在100伏电压下电泳30分钟。使用紫外透射仪观察。图中显示的是一个具有代表性的96孔PCR验证琼脂糖凝胶，其中96个PCR反应中有95个成功扩增。

PCR 实验失败的是 H11。本实验使用布氏锥虫（Trypansoma brucei）前循环型 SMOXP9 细胞系。按照方案文本所述，将细胞培养至适当密度，并通过在 800 × g 条件下离心 10 分钟收集所需数量的细胞。

在细胞离心的同时开始准备电穿孔实验。将板架连接至电穿孔仪。在电穿孔仪上，将电压设为 1,500 伏特，脉冲时长设为 100 微秒，脉冲次数设为 12 次，脉冲间隔设为 500 毫秒。

在平板处理器上，将脉冲计数设置为一次。使用 P200 12 通道多通道移液器，将 PCR 反应液从 PCR 板转移至 96 孔一次性电穿孔板中。用 10 毫升改良型细胞穿孔缓冲液洗涤细胞，并在 800 × g 下再次离心 10 分钟。

将细胞重悬于23毫升改良型cytomix溶液中，使最终浓度为每毫升5×10⁷个细胞。将细胞悬液转移至试剂储液槽中。用移液器将200微升细胞溶液加入电穿孔板的每个孔中，并通过移液操作与PCR产物混合。

使用拭纸擦去电穿孔板顶部的任何液滴，以避免短路。将密封膜贴在电穿孔板顶部，注意对准位置，使每列上下两端的电极孔暴露在外。避免覆盖用于引导密封膜的凸起定位点。

将电穿孔板放入板架中并盖上盖子。按下电穿孔仪上的“脉冲”按钮。电穿孔后，须迅速将细胞转移至4块24孔组织培养板中，每孔含有1 mL SDM-79培养基，用于细胞恢复。

使用 P200 12 道多通道移液器，每隔一个吸头去掉一个，使剩余的六个吸头与 24 孔细胞培养板的六行对齐。将细胞从 96 孔板转移至 24 孔板后，用 24 孔板中对应孔的培养基清洗 96 孔板的孔。然后，将清洗液重新转移回 24 孔板的对应孔中。

将电穿孔后的细胞从96孔电穿孔板按照此处所示的预定义模式转移至24孔组织培养板中。例如，96孔板A行中奇数编号孔的细胞转移至A板的A行，而96孔板A行中偶数编号孔的细胞则转移至C板的A行。每次将细胞从96孔板转移至24孔板后，使用对应24孔板该行的培养基清洗96孔板中的孔，然后将清洗液回收转移回24孔板中。

将细胞转移至24孔板的过程容易混淆，但必须能够将最终获得的细胞系准确对应到相应的基因ID。此步骤需迅速完成，以保持细胞的健康状态。在将所有电穿孔后的细胞转移至四个24孔板后，将24孔板放入一个带有紧密密封盖的干净塑料盒中，并将该盒子置于28°C培养箱内。

六到八小时后，向每个孔中加入含有选择性抗生素的1毫升SDM-79培养基（含10% FCS）。在28°C下孵育9至10天，直至转基因细胞系可见。在对96种不同蛋白质的末端进行标记的96孔转染实验后，将细胞转移至24孔组织培养板中进行恢复和筛选。

随后对每个孔进行评估，以确定其是否含有健康且具有药物抗性的细胞。健康的孔中主要含有活性较高的细胞，在相差显微镜下呈现明亮的形态。在此示例示意图中，绿色表示转染成功的孔，灰色表示仅含有死亡细胞的孔。

96 个孔中有 88 个，即 92% 的孔，在筛选 15 天后含有成功转染的寄生虫。掌握该技术后，从电穿孔后计数细胞到铺板大约需要 1 小时。进行此操作时，需注意在转染后 6 至 8 小时加入筛选药物。

观看本视频后，您应能充分掌握在布氏锥虫中对大量蛋白质群体进行标记的方法。