优化细胞分裂监测细胞示踪染料的染色和扩散建模方法

该方法的总体目标是使用细胞示踪染料直接量化复杂群体中不同免疫细胞亚群的细胞分裂程度。这是通过首先用已知与细胞蛋白质稳定结合或非共价嵌入细胞膜的荧光染料标记亲本细胞群来实现的，以追踪对刺激计数器有反应的染料标记细胞，用荧光抗体染色和使用多参数流式细胞术进行分析，可以检测刺激的感兴趣的免疫细胞类型之间的差异反应， 但是，使用示踪染料未染色的对照来确定最低的子细胞荧光强度，这与标记的自发荧光示踪染料区分开来，但然后使用未刺激的对照来确定检测未分裂细胞的荧光强度。刺激通常会导致广泛的强度，因为响应增殖的细胞逐渐变暗，但无反应者则不会。

最终，使用峰值建模软件来估计不同世代细胞的相对频率，可以使用增殖指数或前体频率等指标对不同群体或刺激的增殖反应进行定量比较。与现有方法（如氚化、thy 掺入或 KI 67 表达）相比，该技术的主要优点是 DI 稀释提供了细胞分裂的直接测量方法，可以与其他 ME 流式细胞术测量方法（如免疫表型和细胞因子产生）结合使用。膜染料染色方法的视觉演示很有帮助，因为细胞对染料的吸收非常迅速。

因此，良好的技术是获得明亮均匀染色的关键。分离人外周血单核细胞后，在 300 倍 G 和室温下离心 5 分钟，以尽量减少血小板污染。然后在 HBSS 加 1% BSA 中以每毫升 10 至第七个细胞的浓度重悬沉淀，并将它们置于冰上。

取出并保留 500 μL Eloqua，然后将另外 500 μL 等分试样的细胞转移到 12 x 75 mm 的锥形聚丙烯管中。加入 3.5 mL HBSS，在洗涤过程中以 400 倍 G 和室温离心细胞 5 分钟，将 PKH 26 GL 试剂盒中的 0.5 mL 稀释剂 C 标记载体加入另一个 12 x 75 mL 锥形聚丙烯管中，小心吸出超级 natin，留下不超过 15 至 25 μL 的残留液体，注意不要去除任何细胞。接下来，向细胞沉淀中加入 0.5 毫升稀释剂 C 标记载体，吸出并分配溶液数次以获得单细胞悬液。

现在通过将两微升 PKH 26 添加到含有稀释剂 C 的试管中来制备两种 XD 原液，现在立即将细胞悬液移液到新鲜制备的两种 XPKH 26 染料溶液中，同时吸出和分配混合物数次，以均匀分散细胞整个染料。1 分钟后，加入 1 毫升热灭活血清，以阻止染料吸收到细胞膜中。离心后，细胞小心吸出上清液，而不去除沉淀。

然后将沉淀分散在含有 10% 热灭活血清的 4 毫升完全培养基中，并将细胞悬液转移到新鲜的聚丙烯管中。在 HBSS 加 1%BSA 中洗涤细胞两次 充分染色的细胞将在沉淀中呈现明显的粉红色调复苏后，将细胞沉淀悬浮在 1 毫升 HBSS 加 1% BSA 中，对细胞进行计数，然后调整体积，使终浓度为每毫升 10 至第七个细胞。根据表中概述的流式细胞术方案对细胞进行染色后，使用前五个试管设置前向散射和侧向散射参数以及所有四个荧光检测器中的信号。

特别是用于监测管 2 中 PKH 26 荧光的检测器。验证所有 PKH 26 染色细胞在刻度上是否在第三到第四个十年中显示为单个对称峰，最后一个通道中几乎没有细胞。接下来，使用颜色补偿软件和为试管 1 到 5 收集的列表模式文件，为用于监测其他三种荧光染料的检测器中的每个荧光灯建立颜色重叠矩阵。

然后将此矩阵应用于示例 6 的列表模式文件。验证 PKH 26 标记的存在不会改变检测 7 个 A a D 阳性细胞的能力。现在将这个刚刚建立的颜色重叠矩阵应用到管 7 的列表模式文件中。

在 FE 与 PC 图上识别 CD 3 阳性、CD 4 阴性和 CD 3 阳性 CD 4 阳性群体。确认抗 CD 3、FE 和抗 CD 4 A PC 的存在不会改变检测 7 A A D 阳性细胞的能力。最后，将管 7 的颜色重叠矩阵应用于管 8 的列表模式 File。

现在打开一个包含增殖分析模块的程序。从要分析的数据集中加载刺激的 PKH 26 染色文件。接下来，选择用于分析的参数，在这种情况下，PKH 26 门控在活的 7 a a d 阴性 cd、3 个阳性淋巴细胞和前向散射与侧向散射上，以排除小碎片和大聚集体。

在定义这些区域时，请小心包括通常发现爆炸的高前向散射区域。接下来，打开增殖向导。单击开始选项卡以打开数据文件，然后加载未刺激的 PKH 26 阳性对照。

定义对应于未分割单元格的亲本峰的位置。分析文件，注意父峰位置和宽度的值。如果需要固定的峰宽，请选中锁定 SD 加载 P KH 26 阴性对照，并通过设置 PKH 26 阴性细胞上方的 dimus 子代的峰通道来调整代数。

这将设置子代数。模型完成后可以精确拟合。重新加载刺激的 PKH 26 阳性文件。

如果明显的可区分的世代峰值，请选择 model 选项下的浮动设置。如果对数十年不完全是 4.0，请按照本文中的讨论调整代间距。现在，分析受刺激的样品并确认亲本峰位置的区域保持不变。

最后，为数据集中的每个实验文件选择 analyze （分析） 以应用。该模型刚刚创建并记录了数据集中每个实验文件的最佳拟合产生的所需增殖指标。第一系列数据说明了混合技术对 PKH 26 荧光分布的影响。

培养时，使用刚刚描述的方法用细胞示踪染料对 U 9 37 髓系细胞进行染色，第一个直方图显示了未染色的对照数据。调整细胞仪设置，将来自这些细胞的自发荧光置于第一个十年，第一个通道中没有或很少的细胞积累。第二个直方图显示了良好的 PKH 26 染色。

两个 x 细胞与两个 x 染料快速混合，得到明亮、均匀且对称的荧光分布，但在用于先前直方图的仪器设置下没有细胞脱垢。当将两个 x 细胞添加到两个 x 染料中而不立即混合时，获得更异质的荧光分布。如果这些微弱标记的细胞亚群出现在本实验最终直方图的后期时间点，则它们将被错误地解释为子细胞，当将 3 μL 浓乙醇染料原液意外直接添加到 0.5 mL 的 2 x 细胞悬液中时，也会发生混合不良，产生极其暗淡和右偏的荧光强度分布。

这里的典型结果来自增殖实验，其中 PKH 20 染色的人外周血单核细胞在有或没有刺激的情况下培养。显示了抗 CD 3 和 IL 2 试剂。培养 96 小时后，收获细胞并用抗 CD、3 FE、抗 CD 19 A PC 和 7 A a d 复染。

在第一种设门策略中比较了两种不同的设门策略，即 CD 3 与 7 的点图。A A D 用于选择活的 7 个 a d 阴性 CD 3 个阳性 T 细胞。然后使用前向和侧向散射区域来门控大聚集体，同时仍然包括爆破淋巴细胞。

未染色对照的 R 一加 R 二门控事件由灰色直方图表示，PKH 26 染色但未刺激的细胞以蓝色表示，未刺激对照中活但未分裂的 T 细胞的明亮对称均一染色。这些数据的门控方式与上图相同，但在这种情况下，细胞受到抗 CD 3 和 IL 2 的刺激。R 1 加 R 2 门控事件的 PKH 26 直方图现在包含大部分分裂的细胞，强度降低，由每代子代的彩色峰表示。

尽管一些明亮未分裂的细胞仍然保持在蓝色的亲本峰中。请注意，高度分裂的细胞的强度尚未与测量未染色细胞的区域重叠，这会混淆基于此处最低强度子代中的细胞数的指标估计。分析的数据与前两组图相同，但仅使用光散射和 CD 3 来选择活的 T 细胞。

这种设门策略排除了许多但不是全部死细胞，如 CD 3 与 7 个 A A D 点图中剩余的 7 个 A A D 阳性死细胞的少量残留群体所证明的那样。使用细胞示踪芯片时，用于免疫表型分析的荧光染料的选择可能会产生具有挑战性的补偿问题，因为未分裂细胞的染色强度非常亮。在本实验中，用 PKH 26 标记 24 小时龄的外周血单核细胞，然后用 CD 3 和 CD 4 抗体加活力染料复染。

在这一系列数据中，用两个微摩尔 PKH 26 标记的细胞用抗 CD 3 FZ 7 A a D 和抗 CD 4 A PC 复染，然后使用与之前相同的 R 1 加 R 2 门控策略进行分析，因为 PKH 26 进入 A PC 通道的重叠很少， CD 4 个阳性和阴性事件均得到明确解决，无论是否进行赔偿。这些数据说明了即使最终 PKH 26 浓度增加到 4 微摩尔，活的 CD 3 阳性 CD 4 阳性 T 细胞如何保持良好的分辨率。由于 PKH 26 与每 CP 通道的显着重叠，因此将抗 CD 4 与 2 微摩尔 PKH 26 和活性芯片联合使用，结果要差得多。

CD 四个阳性和阴性细胞在未补偿数据中无法相互分辨，并且在应用补偿时仅略微分辨。将最终 PKH 26 浓度增加到 4 微摩尔导致即使在应用补偿后，也完全丧失了从 CD 4 阴性事件中分辨 CD 4 阳性的能力。请注意，每个 CP 包含或缺乏抗 CD 4 的样品基本相同。

当使用峰建模软件分析染料稀释曲线以估计连续子代中细胞的频率时，连续子峰的位置和/或宽度可以是固定的或浮动的。关于父峰的值。这些值是从未刺激的对照中估计的。

例如，该 PKH 26 强度曲线来自中度反应者未刺激的 96 小时培养物，用于为 mod fit 增殖向导提供代表未分裂亲本细胞的峰的位置和宽度的首次估计值。使用固定的峰位置设置要求每代峰的平均值正好是前一个峰荧光强度的一半。峰位置的浮点设置允许各代峰的最终位置根据需要与预期强度不同，以获得最佳拟合。

同样，峰宽的固定设置要求每个世代峰的宽度与母峰或未刺激对照峰的宽度相同。峰宽的浮点设置允许根据需要独立改变最终宽度，以获得本表中的最佳拟合。显示了两个不同供体的先前数字的分析结果，其中可区分的代际峰值很明显。

当峰位置和宽度都允许浮动增殖曲线时，在可区分的世代峰不明显的情况下，可以获得最佳的简化卡方值，建议使用固定的峰位置设置。这些数据说明了在流式细胞术免疫抑制测定中使用两种示踪染料分别监测不同免疫细胞类型的增殖历史。绿色所示的 T 效应细胞用 CFSE 标记，蓝色所示的 T 调节细胞用细胞视图标记。

将 Claret 标记的细胞群以不同比例混合，并在抗 CD 3、抗 CD 28 和辐照辅助细胞存在下培养 96 小时。此后，收获细胞并用抗 CD 4、PE 大小 7 和活死紫进行染色。这里。在门控活死紫色阳性细胞后，显示了 treg 与 T 效应子比率为 0.25 比 1 的代表性数据。

应用包括淋巴细胞和原始细胞但排除聚集体和碎片的光散射门，然后是包括 CD 4 阳性事件的门。细胞视图 claret 染色使活的 treg 细胞与高度增殖的活 T 效应细胞易于区分，因此使用 mod fit 峰建模软件分析 CFSE 阳性 T 效应细胞的 CFSE DIM 增殖曲线和细胞视图 Claret 阳性 treg 细胞。分析了大约 25， 000 个事件。

其中 48% 是活的 T 效应子，6% 是活的 T reg，其余是死细胞、辅助细胞和碎片。计算的增殖指数反映了测定期间细胞数的倍数增加，T 效应子为 3.85，Treg 为 1.83。在这里，显示了 tregs 细胞浓度对根据 CFSE 染料稀释曲线计算的 T 效应细胞增殖指数的影响。

无论 treg 细胞是用 cell view claret 标记还是未染色，结果都是相同的，表明 treg 功能未因染色而改变。正如预期的那样，通过跟踪，随着 treg 细胞浓度的降低，tector 增殖的程度增加。还根据细胞视图 claret 染料稀释曲线计算不同 treg 与 T 效应子比率下的 Treg 细胞增殖指数。

正如预期的那样，随着 T 效应细胞浓度的增加，在没有 T 效应细胞的情况下，Tregs 的增殖最小。然而，treg 细胞增殖的程度也有所增加。看完视频，您应该对如何成功使用细胞示踪染料监测细胞增殖，如何选择合适的荧光染料和颜色补偿对照，以及如何选择合适的模型来基于染料稀释来定量细胞分裂有了很好的了解。

除了该程序外，还可以执行其他方法来回答实验问题，例如抗原特异性 T 细胞染色或流式分选以回收静止或缓慢分裂的干细胞样细胞。非常感谢您的观看。