优化的细胞分裂监测染色与增殖建模方法——基于细胞示踪染料

该方法的总体目标是利用细胞示踪染料，直接量化复杂细胞群体中不同免疫细胞亚群的细胞分裂程度。该方法首先用一种已知可稳定结合细胞蛋白或非共价嵌入细胞膜的荧光染料标记亲代细胞群体，以追踪对刺激产生反应的细胞；随后通过荧光抗体染色，并结合多参数流式细胞术进行分析，从而检测所关注的免疫细胞类型在刺激下的差异性反应。但需使用未标记示踪染料的对照样本，以确定可与自发荧光区分的子代细胞最低荧光强度；同时，使用经示踪染料标记但未受刺激的对照样本，以确定未分裂细胞的荧光强度检测阈值。通常情况下，刺激后细胞因增殖而荧光强度逐渐减弱，呈现出广泛的荧光强度分布，而无反应的细胞则荧光强度不变。

最终，利用峰形建模软件估算不同细胞世代中细胞的相对频率，可实现基于增殖指数或前体细胞频率等指标，对不同细胞群体或刺激条件下的增殖反应进行定量比较。该技术相较于现有方法（如氚标记胸腺嘧啶掺入法或KI-67表达检测）的主要优势在于，CFSE稀释能够直接测量细胞分裂，且可与其他多色流式细胞术检测指标（如免疫表型分析和细胞因子产生）联合使用。对膜染料染色方法进行直观演示十分必要，因为细胞对染料的摄取极为迅速。

因此，良好的实验技术是获得明亮且均一染色的关键。在分离人外周血单个核细胞后，于室温下以300 × g离心五分钟，以尽量减少血小板污染。然后将细胞沉淀重悬于HBSS缓冲液（含1% BSA）中，浓度为每毫升10的7次方个细胞，并置于冰上。

取出并保留500微升Eloqua，然后将另外500微升细胞等分试样转移至一个12 × 75毫米的锥形聚丙烯管中。加入3.5毫升HBSS，并在室温下以400 × g离心5分钟以洗涤细胞。在洗涤过程中，从PKH 26 GL试剂盒中取出0.5毫升稀释液C标记载体，加入另一个12 × 75毫米的锥形聚丙烯管中。小心吸除上清液，残留液体不超过15至25微升，并注意不要吸走任何细胞。接着，向细胞沉淀中加入0.5毫升稀释液C标记载体，反复吹打溶液数次，以获得单细胞悬液。

现在通过将两微升的PKH26加入含有稀释液C的离心管中来制备两倍浓度的XD储备液。立即用移液器将细胞悬液加入新配制的两倍PKH26染料溶液中，并同时反复吸打混合液数次，以使细胞在染料中均匀分散。一分钟后，加入一毫升热灭活血清以终止染料进入细胞膜。离心后，小心吸除上清液，切勿扰动沉淀。

然后将沉淀重悬于含有10%热灭活血清的4毫升完全培养基中，并将细胞悬液转移至一个新的聚丙烯管中。用含1%BSA的HBSS充分洗涤细胞两次，染色充分的细胞在沉淀中会呈现明显的粉红色。将细胞沉淀重悬于1毫升含1%BSA的HBSS中后，计数细胞，并调整体积以获得每毫升10的7次方个细胞的终浓度。根据表格中所述的流式细胞术方案对细胞进行染色后，使用前五支试管设定前向散射和侧向散射参数，以及所有四个荧光检测器的信号。

特别是用于检测第二管中 PKH26 荧光的检测器。需确认所有经 PKH26 染色的细胞在图谱上表现为第三到第四对数区间内的单一对称峰，末尾通道中仅有极少或没有细胞。接下来，使用颜色补偿软件以及为第一至第五管收集的列表模式文件，为每种荧光染料在用于检测其余三种荧光染料的检测器中建立颜色重叠矩阵。

然后将该矩阵应用于第六个样本的列表模式文件，以验证PKH26标记的存在是否会影响检测七A a D阳性细胞的能力。现在，将刚刚建立的颜色重叠矩阵应用于第七管的列表模式文件。

在FE对PC的图上鉴定CD3阳性CD4阴性和CD3阳性CD4阳性细胞群。确认抗CD3-FE和抗CD4-APC的存在不影响检测7AAD阳性细胞的能力。最后，将第7管的颜色重叠矩阵应用于第8管的列表模式文件。

现在打开一个包含增殖分析模块的软件。从待分析的数据集中加载经刺激处理的 PKH26 染色文件。接下来，选择分析参数：在此情况下，选择活的、7-AAD 阴性、CD3 阳性淋巴细胞中的 PKH26 信号，并利用前向散射光与侧向散射光图排除小碎片和大聚集体。

在定义这些区域时，需谨慎包含前向散射信号较高的区域，因为原始细胞通常位于此处。接下来，打开增殖向导。单击开始选项卡以打开数据文件，然后加载未刺激的PKH26阳性对照。

确定对应于未分裂细胞的亲代峰的位置。分析文件，记录亲代峰的位置和宽度值。如果需要固定峰宽，请勾选“锁定标准差”（lock SD），加载PKH26阴性对照，通过将第二代子代峰的通道设置在PKH26阴性细胞之上，调整分裂代数。

设置子代细胞的代数。模型在完成后可进行准确拟合。重新加载刺激后的 PKH26 阳性文件。

如果可明显观察到不同世代的峰，应在模型选项下选择“浮动”设置。如果对数数量级不恰好为4.0，则需根据文章所述调整世代间距。现在分析刺激后的样本，并确认亲代峰位置的区域保持不变。

最后，针对数据集中的每个实验文件选择“分析”，以应用刚刚创建的模型，并记录每个实验文件经最佳拟合后所得的所需增殖参数。该第一组数据展示了混合技术对PKH26荧光分布的影响。

培养的 U937 髓系细胞采用上述方法用细胞示踪染料进行染色，第一个直方图显示了未染色对照组的数据。流式细胞仪的设置已调整，使这些细胞的自发荧光信号位于第一对数级，且第一通道中无或仅有极少数细胞聚集。第二个直方图展示了良好的 PKH26 染色效果。

将两倍浓度的细胞与两倍浓度的染料迅速混合后，得到的荧光分布明亮、均一且对称，但在先前直方图所用的仪器设置下，未出现超出量程的细胞。当两倍浓度的细胞与两倍浓度的染料未立即混合时，获得的荧光分布则更为不均一。这一微弱标记细胞的小亚群若在本实验最终直方图的后续时间点中出现，可能会被错误地解读为子代细胞。此外，当不慎将3微升高浓度乙醇染料原液直接加入0.5毫升两倍浓度的细胞悬液时，也出现了混合不良的情况，导致荧光强度分布极弱且向右偏斜。

以下是增殖实验的典型结果，其中用PKH20染色的人外周血单个核细胞在有或无刺激剂的条件下进行培养，刺激剂包括抗CD3和IL-2试剂。培养96小时后，收集细胞并用抗CD3、FE抗CD19 APC以及7-AAD进行复染。

比较了两种不同的设门策略。在第一种设门策略中，使用CD3与CD7的散点图，通过A A D选择活的、A A D阴性、CD3阳性的T细胞。随后利用前向散射光和侧向散射光设门排除大的聚集体，同时保留淋巴细胞母细胞。

未染色对照组的R1加R2门控事件由灰色直方图表示，而PKH26染色但未刺激的细胞显示为蓝色。注意未刺激对照组中活的但未分裂T细胞呈现出明亮、对称且均一的染色。这些数据的门控方式与前一张图相同，但在本例中，细胞经抗CD3和IL-2刺激。此时R1加R2门控事件的PKH26直方图主要包含已分裂的细胞，其荧光强度降低，不同子代细胞群以不同颜色的峰表示。

尽管在蓝色亲代峰中仍存在一些明亮且未分裂的细胞。需要注意的是，高度分裂的细胞的荧光强度尚未与未染色细胞的检测区域重叠，否则将干扰此处基于最低荧光强度子代细胞数量的相关参数估算。该组数据的分析方法与前两组图像相同，但仅使用光散射信号和CD3来筛选有活力的T细胞。

该门控策略排除了大部分但并非全部死细胞，如CD3与7-AAD点图中仍残留少量七-A-A-D阳性的死细胞群体所示。在免疫表型分析中使用荧光染料时，若同时使用细胞示踪染料，可能会引发复杂的补偿问题，因为未分裂细胞的染色强度极高。在本实验中，将24小时龄的外周血单个核细胞用PKH26标记，随后用抗CD3和CD4抗体以及活性染料进行复染。

在本组数据中，使用两微摩尔 PKH 26 标记的细胞经抗 CD3 FZ7AaD 和抗 CD4 APC 复染后，采用与之前相同的 R1 加 R2 设门策略进行分析。由于 PKH 26 在 APC 通道中的溢出较少，无论是否进行补偿，CD4 阳性和阴性事件均能被清晰区分。这些数据表明，即使将 PKH 26 的终浓度提高至四微摩尔，活的 CD3 阳性 CD4 阳性 T 细胞仍能保持良好的分辨效果。而使用抗 CD4 PerCP 与抗 CD3 FE 联合两微摩尔 PKH 26 及活细胞染料 Pro3 时，由于 PKH 26 在 PerCP 通道中存在显著溢出，导致结果明显较差。

在未补偿的数据中，CD4阳性细胞与CD4阴性细胞无法相互区分，即使应用补偿后也仅能勉强分辨。将PKH26的终浓度提高至4 µM后，即使进行补偿处理，仍完全丧失了区分CD4阳性与CD4阴性事件的能力。请注意，包含或不包含抗CD4-CP抗体的样本几乎完全相同。

当使用峰形建模软件分析染料稀释曲线以估算连续子代细胞的频率时，连续子代峰的位置和/或宽度可被设定为固定值或浮动值，其参照依据为亲代峰的数值。这些数值由未刺激对照样本估算得出。

例如，该 PKH26 强度谱图来自一位中等应答者的未刺激 96 小时培养样本，用于为模态拟合增殖向导工具提供代表未分裂亲代细胞峰的初始位置和宽度估计值。若采用固定峰位置设置，则要求每一代细胞峰的平均荧光强度恰好为前一代峰强度的一半；而采用浮动峰位置设置时，各代细胞峰的最终位置可根据需要偏离预期强度，以获得最佳拟合效果。

类似地，峰宽的固定设置要求每一代细胞峰的宽度与亲代或未刺激对照组峰的宽度相同；而峰宽的浮动设置则允许根据需要独立调整最终宽度，以在本表中获得最佳拟合效果。以下展示了之前图中两位不同供体的分析结果，这些供体样本中可清晰分辨出不同代次的峰。

当增殖曲线中无法明显区分不同代次的峰时，同时允许峰位置和峰宽自由浮动可获得最佳的最小化卡方值；而对于可清晰分辨代次峰的情况，则建议固定峰位置。这些数据展示了在流式细胞术免疫抑制实验中，使用两种示踪染料分别监测不同免疫细胞类型增殖历史的方法。图中绿色显示的效应T细胞用CFSE标记，蓝色显示的调节性T细胞用cell view标记。

将Claret标记的细胞群体以不同比例混合，并在抗CD3、抗CD28和经照射的辅助细胞存在下培养96小时。随后，收集细胞并用抗CD4、PE-Cy7和活死染料Violet染色。此处展示了在圈出活死染料Violet阴性细胞后，Treg与T效应细胞比例为0.25:1的代表性数据。

设置一个光散射门，包含淋巴细胞和原始细胞，但排除聚集体和碎片，随后设置另一个门以纳入CD4阳性事件。通过Cell View Claret染色，可将活的调节性T细胞（Treg）与高度增殖因而CFSE荧光较弱的活效应T细胞（T effector）清晰区分开来。对CFSE阳性的效应T细胞和Cell View Claret阳性的调节性T细胞的增殖谱，采用ModFit峰拟合分析软件进行分析。每样本约分析25,000个事件。

其中，48%为有活力的效应T细胞，6%为有活力的调节性T细胞，其余为死亡细胞、辅助细胞和碎片。计算得到的增殖指数反映了在检测期间细胞数量的倍增情况，效应T细胞为3.85，调节性T细胞为1.83。此处展示了调节性T细胞浓度对根据CFSE染料稀释曲线计算出的效应T细胞增殖指数的影响。

无论使用 Cell View Claret 标记 Treg 细胞，还是不进行染色，结果均相同，表明染色并未改变 Treg 细胞的功能。如预期所示，在追踪过程中，随着 Treg 细胞浓度的降低，T 效应细胞的增殖程度增加。此外，还根据不同 Treg 与 T 效应细胞比例下的 Cell View Claret 荧光染料稀释曲线计算了 Treg 细胞的增殖指数。

正如预期，在缺乏效应T细胞（T effector cells）的情况下，调节性T细胞（Tregs）几乎不发生增殖；但随着效应T细胞浓度的增加，调节性T细胞的增殖程度也随之增强。观看本视频后，您应能充分掌握如何成功利用细胞示踪染料监测细胞增殖，如何选择合适的荧光染料及荧光补偿对照，以及如何根据染料稀释情况选择合适的模型来定量分析细胞分裂。

除了该实验步骤外，还可采用其他方法来回答实验问题，例如对特异性抗原T细胞进行染色，或通过流式分选回收处于静息状态或缓慢分裂的干细胞样细胞。非常感谢您的观看。