Name: 优化细胞分裂监测细胞示踪染料的染色和扩散建模方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 49 s
Description: 学习使用荧光染料标记免疫细胞并通过流式细胞术分析细胞分裂的方法。该技术结合峰值建模软件可定量评估不同刺激条件下的增殖反应，为免疫学研究提供直接的细胞分裂测量手段。

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作者们特别感谢多年来在这些方法的开发过程中提供技术与学术贡献的以下人员：Bruce Bagwell（Verity Software House）、Nadège Bercovici（IDM）、Lizanne Breslin（Zynaxis Cell Science 和 PTI Research）、Brian Gray（PTI Research）、Jan Fisher（达特茅斯医学院）、Alice Givan（达特茅斯医学院）、Betsy Ohlsson-Wilhelm（SciGro, Inc.）以及 Mary Waugh（达特茅斯医学院）。作者们还感谢流式细胞术研究方法与应用年度课程中鲍登学院2006届班级，图2中展示的数据即由该班级生成。
流式细胞术在罗斯威尔公园癌症研究所的流式细胞术实验室进行，该实验室部分由美国国立卫生研究院共享仪器项目（NIH Shared Instrument Program）的设备资助建立，并获得美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）对罗斯威尔公园癌症研究所的核心资助（5 P30 CA016056-29）支持。部分实验也在宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心流式细胞术与细胞分选资源实验室完成，该实验室同样部分由美国国立卫生研究院共享仪器项目的设备资助建立，并获得美国国家癌症研究所资助 NIH #2P30 CA016520 的支持。图3和图5所示工作还部分得到了美国国立生物医学成像与生物工程研究所（National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIBIB）授予PTI Research, Inc.的小企业创新研究（SBIR）资助 EB00228 的支持。

1. 使用PKH26细胞示踪染料进行细胞膜的一般性标记（参考文献25；图1）
<ol>
	<li>在步骤 1.1 至 1.9 中使用无菌操作技术。采用实验室常规方法制备约 107 个人外周血单个核细胞或淋巴细胞（hPBMC、hPBL），并在最后一步增加 300 × g 离心，以最大限度减少血小板污染。将细胞重悬于 HBSS + 1% BSA 中，浓度为 107/ml，置于冰上，并保留 500 μl 分装样本（5 × 106 个细胞）用于步骤 2。</li>
	<li>将 5 × 106 个细胞（500 μl）转移至一支 12 × 75 mm 的锥形聚丙烯管中。用 3.5 ml HBSS 洗涤一次。小心吸除上清液，残留液体不超过 15–25 μl，注意勿吸走细胞。将此管用于步骤 1.4 中制备 2 倍浓度的细胞悬液。</li>
	<li>在步骤 1.2 的细胞洗涤过程中，向另一支 12 × 75 mm 锥形聚丙烯管中加入 0.5 ml 稀释剂 C 标记载体（来自 PKH26GL 试剂盒）。将此管用于步骤 1.5 中制备 2 倍浓度的 PKH26 溶液。</li>
	<li>向步骤 1.2 中洗涤后的细胞沉淀中加入 0.5 ml 稀释剂 C 标记载体，反复吹打 3–4 次以获得单细胞悬液（2 倍浓度细胞）。避免产生气泡和过度混匀，以免降低细胞活力和回收率。</li>
	<li>在完成步骤 1.4 的 2 倍浓度细胞悬液制备后，立即向步骤 1.3 准备的稀释剂 C 管中加入 2.0 μl 乙醇配制的 1.0 mM PKH26 染料储备液（来自 PKH26GL 试剂盒），涡旋混匀，使染料均匀分散，从而制备 2 倍浓度（4 μM）染料溶液。</li>
	<li>在完成步骤 1.5 的 2 倍浓度染料溶液制备后，立即用移液器将步骤 1.4 中的 2 倍浓度细胞悬液快速加入染料溶液中，同时反复吹打 3–4 次，使细胞在染料中充分分散。切勿：将 1.0 mM 染料直接加入细胞；将 2 倍浓度细胞倾倒入染料溶液；或在涡旋过程中将 2 倍浓度细胞加入染料溶液。由于染色几乎瞬间完成，上述方法所得染色强度均匀性低于推荐方法（图 2）。</li>
	<li>染色 1 分钟后，加入 1.0 ml 热灭活血清或 HBSS + 5% BSA 以终止染料对细胞膜的摄取。若蛋白用量不足，可能导致染料聚集，这些聚集物在洗涤过程中会随细胞沉淀，造成实验中其他细胞的非特异性标记。若使用含 10% 热灭活血清的培养基（CM）或 HBSS + 1% BSA 作为终止试剂，应在 15 ml 锥形聚丙烯管中进行染色，并加入至少 5.0 ml 终止试剂，以确保所有未结合染料被充分吸附。</li>
	<li>将标记后的细胞在约 400 × g 条件下离心 5 分钟。小心吸除上清液，避免吸走细胞。用 4 ml CM 或 HBSS + 1% BSA 洗涤沉淀两次，每次重新离心前需充分重悬细胞。为最大限度减少管壁吸附染料的残留并提高洗涤效率，建议在第一次重悬后将细胞转移至新的聚丙烯管中。注意：染色充分的细胞沉淀会呈现明显的粉红色。</li>
	<li>将洗涤后的细胞沉淀重悬于 1.0 ml HBSS + 1% BSA 中。计数细胞，计算细胞回收率，并调整体积使最终浓度为 107/ml。若操作得当，细胞回收率应 ≥85%。若细胞回收率 &lt; 70%，应先查明原因再继续后续操作。取出 150 μl 分装样本（1.5 × 106 个细胞），置于冰上用于步骤 2。</li>
</ol>
2. 仪器准备及检测设置对照（表1）
<ol>
	<li>从第1.1步保存的细胞悬液中，取50 μl（5×105）未染色细胞，分别加入五个1.8 ml Eppendorf管（编号1、3、4、5和7）中；从第1.9步中取50 μl（5×105）PKH26pos细胞，分别加入三个管（编号2、6和8）中。</li>
	<li>向1–8号管中每管加入10 μl IgG封闭液（每管100 μg IgG；见试剂表），在室温（20–25 °C）孵育10分钟。</li>
	<li>向4、5、7和8号管中加入表1所示的足量抗体，所有样品（1–8号管）在室温下避光孵育30分钟。</li>
	<li>向所有样品中加入1.5 ml HBSS+1% BSA，通过离心（400 × g，5分钟）沉淀细胞，并用1.5 ml HBSS+1% BSA洗涤一次，小心吸弃上清以避免细胞丢失。</li>
	<li>将每份样品重悬于500 μl HBSS+1% BSA中。如流式细胞仪检测需要，可转移至12 × 75 mm圆底管中。根据表1所示，向3、6、7和8号管中各加入10 μl 100 μg/ml 7-AAD日常工作液（见试剂表）。冰上孵育30分钟后，用于流式细胞仪设置和染色验证（第3步）。</li>
</ol>
3. 流式细胞仪设置与染色验证
<ol>
	<li>验证流式细胞仪是否正常运行，使用实验室既定的每日质量控制程序。确认在将用于检测的每个光谱窗口中信号均能被清晰检测到，并确认检测器在用于增殖监测的光谱窗口中的响应与信号强度呈线性正比关系。14.</li>
	<li>使用线性显示刻度采集第1管的FSC与SSC数据。调节每个检测器的放大倍数，使淋巴细胞群位于散点图的左下象限，且在任一参数上均未超出量程，同时避免因阈值设置导致信号中断。在步骤3.3至3.7中，对所有样本采集未设门控的FSC与SSC数据。</li>
	<li>采集第1管数据，所有4个荧光检测器均不进行颜色补偿，并采用对数显示刻度。调节每个检测器的高压（HV），使未染色淋巴细胞的自发荧光位于刻度范围内，且极少或没有细胞聚集在第一通道。为每个直方图设定分析边界，对应于未染色细胞中最亮的2%细胞。</li>
	<li>不进行颜色补偿，使用步骤 3.2 和 3.3 中设定的 HV 值，采集第 2 管的数据，收集 FSC、SSC 以及所有 4 个荧光检测器中的信号。对于用于检测 PKH26 荧光的检测器，确认所有 PKH26阳性 细胞在量表上呈现为一个单一的对称峰，位于3rd-4th 十年，最后一个通道中细胞极少或无细胞。如果出现多个峰或峰形偏斜，请仔细注意减少盐分和混匀技术，重复步骤1图2如有必要，调整染料浓度。</li>
	<li>使用步骤 3.3 中设定的参数，采集第 3 管的数据，收集 FSC、SSC 以及所有 4 个荧光检测器中的信号。对于用于检测 7-AAD 荧光的检测器，确认 7-AAD阳性 细胞位于第3.3步设定的2%边界以上（即，非活细胞与活细胞的 7-AAD 能够很好地区分阴性 细胞）</li>
	<li>使用第3.3步中设定的参数，采集第4管的数据，收集FSC、SSC以及所有4个荧光检测器中的信号。验证CD8阳性 细胞与未染色细胞能够清晰区分（即，落在第3.3步为FITC检测器设定的2%边界以上）。对第5管重复操作，并确认CD8位置 细胞与未染色细胞能够清晰区分（即 位于第3.3步为APC检测器设定的2%边界以上。</li>
	<li>使用步骤 3.3 中设定的参数，对第 6、7 和 8 号管进行数据采集，收集 FSC、SSC 及所有 4 个荧光检测器中的信号。</li>
	<li>使用为第1-5管收集的列表模式文件及您的颜色补偿软件，为每种荧光染料在用于检测其他三种荧光染料的检测器中建立颜色重叠矩阵。将该矩阵应用于样本6的列表模式文件，并验证PKH26标记的存在是否影响7-AAD的检测能力阳性 细胞</li>
	<li>将第3.8步得到的颜色重叠矩阵应用于样本7的列表模式文件，并验证：a) 出现3个分辨良好的亚群（CD3阴性CD4阴性，CD3位置CD4阴性 和 CD3阳性CD4阳性) 可在FITC与APC散点图上进行鉴定；且b) 抗CD3-FITC与抗CD4-APC的存在不影响7-AAD的检测能力阳性 细胞。如果抗CD3-FITC的存在改变了PKH26检测器所采集数据的上边界2%阈值，则应根据需要重新调整该边界。</li>
	<li>将第3.8步得到的颜色重叠矩阵应用于样本8的列表模式文件。如果PKH26标记的存在导致FITC、7-AAD或APC检测器的2%边界相较于第3.3步中使用自发荧光对照设定的边界发生变化，则根据需要使用第7管重新调整相应边界。 表1 并验证仍可区分 CD3阳性CD4阳性，CD3阳性CD4阴性和 CD3阴性CD4阴性 使用调整后的边界对细胞进行处理。</li>
</ol>
4. 通过染料稀释法监测细胞分裂的增殖模型选择
<ol>
	<li>确定代际间距，该值取决于流式细胞仪的通道数和对数级数。对于数字仪器，此值通常为4或5个级数，由数字信号处理器中的分档数决定。对于模拟仪器，由于级数通常不是整数，因此需要通过实验精确测定级数以实现准确建模。为此，使用与实验相同的检测器高压设置，采集一组经校准的荧光微球混合物的数据，这些微球具有制造商指定的相对荧光强度。微球峰的位置可用于校准对数尺度，以确定每个对数级数对应的强度范围。具体方法是将每种微球类型的通道号对其制造商指定值的对数作图，通过微球数据点拟合一条最佳直线，其斜率即为每通道对应的相对强度单位数。将该斜率乘以总通道数，即可得到全量程范围内的对数级数，由此可进一步计算出对应荧光强度两倍下降的通道数（即，子代代际间隔）可以计算14.</li>
	<li>决定使用代际间的固定间距，还是允许间距浮动。 标准 （固定）设置将使用步骤4.5中确定的世代间距值来分配每个世代的位置，通常在直方图缺乏明显峰时使用。 漂浮 该设置允许根据直方图的形状确定每一代峰的位置，通常在可明显区分各代峰时使用。</li>
	<li>决定使用固定峰宽还是浮动峰宽。固定峰宽采用未刺激对照样本计算的标准差（SD）来拟合所有代次，通常在样本缺乏可区分的代次峰时选用。浮动峰宽允许程序为每一代次独立调整标准差（SD），适用于具有可区分代次峰的情况。</li>
	<li>运行包含增殖分析模块的程序（此处为 ModFit LT Version 3.3）。加载经刺激的 PKH26阳性 待分析数据集中的文件（例如，经刺激的96小时PKH26标记细胞培养阳性 细胞经与第8管相同的方式复染 表1).</li>
	<li>选择分析参数，本例中为在活细胞（7-AAD阴性）门控内分析PKH26（585/42）阴性CD3阳性 淋巴细胞以及FSC与SSC以排除小碎片和大聚集体（图3）。在界定这些区域时，需注意包含前向散射光较高的区域（原始细胞通常位于此处），并注意在刺激培养中CD3的表达可能下调。</li>
	<li>使用增殖向导创建新的增殖模型。使用 开放数据文件 （开始选项卡），加载未刺激的 PKH26位置 对照文件，并确定亲代分布中对应于未分裂细胞的峰道位置。</li>
	<li>分析 未刺激的PKH26文件阳性 对照，记录亲本峰位置和峰宽（标准差）的数值。如果需要固定峰宽（SD），请勾选 锁相检测器 SD.</li>
	<li>加载PKH26阴性 对照（例如，PKH26 的 96 小时培养阴性 细胞经与第7管相同的方式复染 表1）。通过将最微弱一代的峰值通道设置在PKH26以上，调整代数数量。阴性 对照。这决定了模型能够准确拟合的子代代数，通常为6-9代。</li>
	<li>打开 刺激样本的数据文件（例如，经刺激的96小时PKH26标记细胞培养位置 细胞经与第8管相同的复染处理 表1）并确认第4.7步中定义的亲本峰位置及标准差（SD）区域保持不变。若需要固定的世代间距，请选择 标准 模型选项；否则选择 漂浮 选项。</li>
	<li>分析 使用第4.9步中定义的相同模型，对数据集中的每个实验文件进行拟合。为了获得最佳拟合效果，可能需要对母峰位置进行微小调整，最佳拟合的判断依据包括目视效果和约化卡方值。RCS）值。</li>
	<li>记录数据集中每个实验文件经最佳拟合后所得的所需增殖参数。有关可能参数的全面描述，请参见参考文献22。</li>
</ol>

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<li>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling [Internet]. , Sigma-Aldrich. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf">http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf</a> (2012).</li>
<li>Houlihan, D. D., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Review+of+Clinical+Trials+of+Bone+Marrow+Stem+Cells+in+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease.</a> Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).</li>
<li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory%5BTitle%5D)+AND+%22T+Cells.+Immunol.+Invest%22%5BJournal%5D)">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory.</a> T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).</li>
</ol>

K. Humphrey、J.D. Tario, Jr. 和 P.K. Wallace 已从 Life Technologies, Inc. 与 BD Biosciences 获得用于评估的商业化前细胞示踪试剂。A.D. Bantly 和 J.S. Moore 已从 Life Technologies, Inc. 获得用于评估的商业化前细胞示踪试剂，并从 PTI Research, Inc. 获得资助，用于多种 CellVue 细胞示踪染料的商业化前表征研究。K. Muirhead 任职于 SciGro, Inc.，该公司为 Phanos Technologies, Inc.（PKH 和 CellVue 染料的所有者）提供咨询服务，并为 Sigma-Aldrich 和 Molecular Targeting Technologies, Inc.（这些染料的分销商）提供后备技术支持。 本文的出版及免费访问由 Sigma-Aldrich 赞助。

本文所述方法是在我们联合实验室中发现的、用于人外周血单个核细胞（hPBMC）膜染料标记13,16,18以及利用膜染料或蛋白染料进行淋巴细胞亚群表型分析和增殖追踪时最可靠且能获得最佳结果的操作流程2,11,13,16,18。如图1和图2所示，通过减少生理盐的存在，并采用一种能使所有细胞迅速、均匀地暴露于相同染料浓度的混匀技术，最容易实现明亮且均一的标记效果。由于膜染料染色是通过进入脂双层进行分配而实现的，因此其他影响游离染料浓度的因素也可能影响标记效率。例如，在圆底聚苯乙烯试管中进行标记时，重悬于稀释液C之前盐分的洗涤去除效率较低，同时由于染料吸附在管壁上（尤其是在较低染料浓度下），导致游离染料浓度下降。这两个因素均倾向于产生比使用锥底聚丙烯试管更宽的染色分布（图3、图4及未发表结果）。即使采用优化的染色程序，样本的保存时间和类型也可能影响染色峰的宽度。例如，从新鲜采集的血液中分离的PKH26pos淋巴细胞的变异系数（CV）为14–20%（图3，参考文献13及未发表结果），而从保存24小时的血液样本或TRIMA单采过滤器中分离的淋巴细胞，其变异系数则为25–30%（图4及参考文献18）。
染色的均一性以及排除非活细胞的程度均会影响染料稀释曲线中是否能够明显区分出子代峰，进而影响对拟合观测数据的增殖模型的选择（图5 和 图6）。尽管本文以ModFit（Verity Software House, Topsham, ME）作为生成增殖指数（Proliferation Index）和前体频率（Precursor Frequency）等参数的软件示例（图3、图5 和 图6；表3），其他软件包也包含分析增殖数据的模块，例如FCSExpress（De Novo Software, Los Angeles, CA）和FlowJo（Tree Star, Inc., Ashland, OR）。这些程序均采用非线性最小二乘法分析，通过调整代表连续子代的高斯峰的位置、高度和标准差（或宽度），迭代寻找与原始数据的最佳拟合。增殖指数（PI）和前体频率（PF）是衡量增殖程度最常用的两个指标。根据ModFit的定义，PI用于衡量在整个实验过程中细胞数量的增加，类似于胸苷掺入实验中的“刺激指数”。PF则反映初始细胞群体中对刺激产生增殖反应的细胞所占的比例。然而，在阅读文献时需谨慎，因为不同软件包之间的术语存在一定差异（例如，FlowJo和ModFit对“增殖指数”这一术语的定义和计算方法不同）22。
在使用蛋白染料进行标记和增殖分析时，同样会遇到本文讨论的膜染料相关的关键问题。例如，使用CFSE时（图6）2-4,13,18,24，必须同样注意混匀技术，并排除死亡或濒死细胞，以获得均匀的分布和可区分的子代峰。选择合适的荧光染料用于表型分析和活力评估也至关重要，以避免过度的光谱重叠，导致难以识别抗体阳性细胞，尤其是使用发射可见光的蛋白染料（如CFSE）时2-4,11,13,16,18。降低示踪染料的浓度可减少相邻光谱通道间的补偿问题，但也会限制在子代细胞荧光强度与自发荧光开始重叠之前可监测的细胞分裂次数。 alternatively，使用较新的细胞示踪染料，如远红发射的CellVue Claret（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）或紫光发射的CellTrace Violet（Life Technologies, Grand Island, NY），可能有助于减少补偿问题（图6）。最后，尽管膜染料通常表现出较低的毒性11,26，但使用任一类染料均有可能过度标记细胞。因此，必须始终验证所用示踪染料的浓度是否影响了待追踪细胞的功能（图6）3,13,16,18。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;商业购买&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素D</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Hanks平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Life Technologies</td><td>14175-079</td><td>不含钙和镁，不含酚红</td></tr><tr><td>人IgG科恩组分II和III球蛋白</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>G-4386</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD3-FITC</td><td>BD 生物科学</td><td>349201</td><td>由实验室滴定确定的饱和浓度</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD4-APC</td><td>BD 生物科学</td><td>340672</td><td>由实验室滴定确定的饱和浓度</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD4-PECy7</td><td>BD 生物科学</td><td>348799</td><td>由实验室滴定确定的饱和浓度</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD8-FITC</td><td>BD 生物科学</td><td>347313</td><td>由实验室滴定确定的饱和浓度</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD8-APC</td><td>Caltag（Life Technologies）</td><td>MHCD0805</td><td>由实验室滴定确定的饱和浓度</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD19-APC</td><td>Caltag（Life Technologies）</td><td>MHCD1905</td><td>由实验室滴定确定的饱和浓度</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD25-APC</td><td>BD 生物科学</td><td>340938</td><td>由实验室滴定确定的饱和浓度</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD127-PE</td><td>BD 生物科学</td><td>557938</td><td>由实验室滴定确定的饱和浓度</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD3</td><td>eBiosciences</td><td>16-0037-85</td><td>1.0 mg/mL；无叠氮化物</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD28</td><td>eBiosciences</td><td>16-0289-85</td><td>1.0 mg/mL；无叠氮</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>PKH26红色荧光细胞连接试剂盒，包含乙醇中的10-3M PKH26及稀释液C</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>PKH26GL-1KT &lt;br/&gt; 或&lt;br/&gt; MINI26-1KT</td><td>步骤1中的操作程序同样适用于含有PKH67或其他CellVue染料的试剂盒 </td></tr><tr><td>CellVue Claret 远红荧光细胞标记试剂盒，包含乙醇中的 10-3M CellVue Claret 及稀释液 C</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>MINCLARET-1KT 或 MIDCLARET-1KT</td><td></td></tr><tr><td>5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）</td><td>Invitrogen（Life Technologies）</td><td>C34554</td><td>非荧光性；可被膜酯酶切割，生成具有荧光且可与氨基反应的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定紫染料</td><td>Invitrogen（Life Technologies）</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>无菌 12x75 mm 圆锥形离心管 &lt;br/&gt; 聚丙烯管 &amp;amp; 胶囊 </td><td>VWR</td><td>60818-102</td><td>提高膜染料染色效率（减少染料吸附；吸除上清液时细胞损失更少） </td></tr><tr><td>12x75 mm 圆底 &lt;br/&gt; 聚苯乙烯管</td><td>Becton Dickinson</td><td>21008-936</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪 </td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur &lt;br/&gt; LSRFortessa&lt;br/&gt;</td><td>任何能够检测 FITC、PKH26 和 7-AAD（激发波长 488 nm；发射波长分别为 520 nm、567 nm 和 655 nm）以及 APC（激发波长 633–640 nm；发射波长 660 nm）的流式细胞仪 </td></tr><tr><td>流式细胞仪 </td><td>贝克曼库尔特</td><td>LSRII CyAn</td><td>任何能够检测 FITC、PKH26 和 7-AAD（激发波长 488 nm；发射波长分别为 520 nm、567 nm 和 655 nm）以及 APC（激发波长 633–640 nm；发射波长 660 nm）的流式细胞仪 </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;实验室制备&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素D &lt;br/&gt; 浓缩储备液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 mg/mL（溶于PBS中）。分装后冻存于-80℃20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素D &lt;br/&gt; 工作液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>100 &amp;mu;g/mL 在 PBS 中；每天从 1 mg/mL 冻存液中新鲜配制。 </td></tr><tr><td>IgG 封闭</td><td>NA</td><td>NA</td><td>HBSS + 10 mg/mL 人IgG Cohn组分II和III球蛋白 + 10 mg/mL BSA</td></tr></tbody></table>

优化的细胞分裂监测染色与增殖建模方法——基于细胞示踪染料

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

荧光细胞示踪染料结合流式细胞术和成像细胞术，是研究不同类型细胞间相互作用及其命运的有力工具 体外 和 体内.1-5 尽管使用此类染料的出版物实际上已有数千篇，但一些最常见的细胞示踪应用包括对以下方面的监测：
<ol>
	<li>干细胞与祖细胞的静息、增殖和/或分化6-8</li>
	<li>抗原驱动的膜转移9 和/或前体细胞增殖3,4,10-18 以及</li>
	<li>免疫调节与效应细胞功能1,18-21。</li>
</ol>
市面上可购得的细胞示踪染料在化学性质和荧光特性上差异较大，但绝大多数根据其细胞标记机制可分为两类。“膜染料”以PKH26为代表，是一类高度亲脂性的染料，能够稳定地但以非共价方式分配进入细胞膜1,2,11。“蛋白染料”以CFSE为代表，是一类可与氨基反应的染料，能与细胞蛋白形成稳定的共价键4,16,18。这两类染料各有其优势与局限性。因此，成功使用这些染料的关键——尤其是在多色实验中需同时使用多种染料追踪不同细胞类型时——在于理解影响每类染料最佳应用的核心问题2-4,16,18,24。
本文所述方案强调了使用细胞示踪染料时导致结果不佳或不一致的三个常见原因。这些原因是：
<ol>
	<li>无法实现明亮、均匀且可重复的标记。这是任何细胞示踪研究的必要起点，但在使用膜染料时，需关注的变量与使用蛋白染料或抗体等平衡结合试剂时有所不同。</li>
	<li>荧光染料组合次优和/或未包含关键的补偿对照。示踪染料的荧光强度通常比抗体荧光强 102 - 103 倍。因此，必须验证示踪染料的存在不会影响对其他探针信号的检测能力。</li>
	<li>无法获得峰拟合软件的良好拟合结果。此类软件可基于前体细胞频率或其他指标，对不同细胞群体或刺激条件下的增殖反应进行定量比较。然而，获得良好拟合需要排除可能扭曲染料稀释曲线的死亡/将死细胞，并确保模型的假设与实际观察到的染料稀释曲线特征相匹配。</li>
</ol>
此处给出的示例说明了在使用膜染料和/或蛋白质染料监测细胞增殖时，这些变量如何影响实验结果。

成功使用细胞示踪染料来监测免疫细胞功能和增殖涉及多个关键步骤。我们描述了以下方法：1）使用膜染料获得明亮、均一且可重复的标记；2）选择荧光染料及数据采集条件；3）选择基于染料稀释的细胞增殖定量模型。

荧光细胞示踪染料结合流式细胞术和成像细胞术，是研究细胞相互作用与命运的有力工具。

该方法的总体目标是利用细胞示踪染料，直接量化复杂细胞群体中不同免疫细胞亚群的细胞分裂程度。该方法首先用一种已知可稳定结合细胞蛋白或非共价嵌入细胞膜的荧光染料标记亲代细胞群体，以追踪对刺激产生反应的细胞；随后通过荧光抗体染色，并结合多参数流式细胞术进行分析，从而检测所关注的免疫细胞类型在刺激下的差异性反应。但需使用未标记示踪染料的对照样本，以确定可与自发荧光区分的子代细胞最低荧光强度；同时，使用经示踪染料标记但未受刺激的对照样本，以确定未分裂细胞的荧光强度检测阈值。通常情况下，刺激后细胞因增殖而荧光强度逐渐减弱，呈现出广泛的荧光强度分布，而无反应的细胞则荧光强度不变。最终，利用峰形建模软件估算不同细胞世代中细胞的相对频率，可实现基于增殖指数或前体细胞频率等指标，对不同细胞群体或刺激条件下的增殖反应进行定量比较。该技术相较于现有方法（如氚标记胸腺嘧啶掺入法或KI-67表达检测）的主要优势在于，CFSE稀释能够直接测量细胞分裂，且可与其他多色流式细胞术检测指标（如免疫表型分析和细胞因子产生）联合使用。对膜染料染色方法进行直观演示十分必要，因为细胞对染料的摄取极为迅速。因此，良好的实验技术是获得明亮且均一染色的关键。在分离人外周血单个核细胞后，于室温下以300 × g离心五分钟，以尽量减少血小板污染。然后将细胞沉淀重悬于HBSS缓冲液（含1% BSA）中，浓度为每毫升10的7次方个细胞，并置于冰上。取出并保留500微升Eloqua，然后将另外500微升细胞等分试样转移至一个12 × 75毫米的锥形聚丙烯管中。加入3.5毫升HBSS，并在室温下以400 × g离心5分钟以洗涤细胞。在洗涤过程中，从PKH 26 GL试剂盒中取出0.5毫升稀释液C标记载体，加入另一个12 × 75毫米的锥形聚丙烯管中。小心吸除上清液，残留液体不超过15至25微升，并注意不要吸走任何细胞。接着，向细胞沉淀中加入0.5毫升稀释液C标记载体，反复吹打溶液数次，以获得单细胞悬液。现在通过将两微升的PKH26加入含有稀释液C的离心管中来制备两倍浓度的XD储备液。立即用移液器将细胞悬液加入新配制的两倍PKH26染料溶液中，并同时反复吸打混合液数次，以使细胞在染料中均匀分散。一分钟后，加入一毫升热灭活血清以终止染料进入细胞膜。离心后，小心吸除上清液，切勿扰动沉淀。然后将沉淀重悬于含有10%热灭活血清的4毫升完全培养基中，并将细胞悬液转移至一个新的聚丙烯管中。用含1%BSA的HBSS充分洗涤细胞两次，染色充分的细胞在沉淀中会呈现明显的粉红色。将细胞沉淀重悬于1毫升含1%BSA的HBSS中后，计数细胞，并调整体积以获得每毫升10的7次方个细胞的终浓度。根据表格中所述的流式细胞术方案对细胞进行染色后，使用前五支试管设定前向散射和侧向散射参数，以及所有四个荧光检测器的信号。特别是用于检测第二管中 PKH26 荧光的检测器。需确认所有经 PKH26 染色的细胞在图谱上表现为第三到第四对数区间内的单一对称峰，末尾通道中仅有极少或没有细胞。接下来，使用颜色补偿软件以及为第一至第五管收集的列表模式文件，为每种荧光染料在用于检测其余三种荧光染料的检测器中建立颜色重叠矩阵。然后将该矩阵应用于第六个样本的列表模式文件，以验证PKH26标记的存在是否会影响检测七A a D阳性细胞的能力。现在，将刚刚建立的颜色重叠矩阵应用于第七管的列表模式文件。在FE对PC的图上鉴定CD3阳性CD4阴性和CD3阳性CD4阳性细胞群。确认抗CD3-FE和抗CD4-APC的存在不影响检测7AAD阳性细胞的能力。最后，将第7管的颜色重叠矩阵应用于第8管的列表模式文件。现在打开一个包含增殖分析模块的软件。从待分析的数据集中加载经刺激处理的 PKH26 染色文件。接下来，选择分析参数：在此情况下，选择活的、7-AAD 阴性、CD3 阳性淋巴细胞中的 PKH26 信号，并利用前向散射光与侧向散射光图排除小碎片和大聚集体。在定义这些区域时，需谨慎包含前向散射信号较高的区域，因为原始细胞通常位于此处。接下来，打开增殖向导。单击开始选项卡以打开数据文件，然后加载未刺激的PKH26阳性对照。确定对应于未分裂细胞的亲代峰的位置。分析文件，记录亲代峰的位置和宽度值。如果需要固定峰宽，请勾选“锁定标准差”（lock SD），加载PKH26阴性对照，通过将第二代子代峰的通道设置在PKH26阴性细胞之上，调整分裂代数。设置子代细胞的代数。模型在完成后可进行准确拟合。重新加载刺激后的 PKH26 阳性文件。如果可明显观察到不同世代的峰，应在模型选项下选择“浮动”设置。如果对数数量级不恰好为4.0，则需根据文章所述调整世代间距。现在分析刺激后的样本，并确认亲代峰位置的区域保持不变。最后，针对数据集中的每个实验文件选择“分析”，以应用刚刚创建的模型，并记录每个实验文件经最佳拟合后所得的所需增殖参数。该第一组数据展示了混合技术对PKH26荧光分布的影响。培养的 U937 髓系细胞采用上述方法用细胞示踪染料进行染色，第一个直方图显示了未染色对照组的数据。流式细胞仪的设置已调整，使这些细胞的自发荧光信号位于第一对数级，且第一通道中无或仅有极少数细胞聚集。第二个直方图展示了良好的 PKH26 染色效果。将两倍浓度的细胞与两倍浓度的染料迅速混合后，得到的荧光分布明亮、均一且对称，但在先前直方图所用的仪器设置下，未出现超出量程的细胞。当两倍浓度的细胞与两倍浓度的染料未立即混合时，获得的荧光分布则更为不均一。这一微弱标记细胞的小亚群若在本实验最终直方图的后续时间点中出现，可能会被错误地解读为子代细胞。此外，当不慎将3微升高浓度乙醇染料原液直接加入0.5毫升两倍浓度的细胞悬液时，也出现了混合不良的情况，导致荧光强度分布极弱且向右偏斜。以下是增殖实验的典型结果，其中用PKH20染色的人外周血单个核细胞在有或无刺激剂的条件下进行培养，刺激剂包括抗CD3和IL-2试剂。培养96小时后，收集细胞并用抗CD3、FE抗CD19 APC以及7-AAD进行复染。比较了两种不同的设门策略。在第一种设门策略中，使用CD3与CD7的散点图，通过A A D选择活的、A A D阴性、CD3阳性的T细胞。随后利用前向散射光和侧向散射光设门排除大的聚集体，同时保留淋巴细胞母细胞。未染色对照组的R1加R2门控事件由灰色直方图表示，而PKH26染色但未刺激的细胞显示为蓝色。注意未刺激对照组中活的但未分裂T细胞呈现出明亮、对称且均一的染色。这些数据的门控方式与前一张图相同，但在本例中，细胞经抗CD3和IL-2刺激。此时R1加R2门控事件的PKH26直方图主要包含已分裂的细胞，其荧光强度降低，不同子代细胞群以不同颜色的峰表示。尽管在蓝色亲代峰中仍存在一些明亮且未分裂的细胞。需要注意的是，高度分裂的细胞的荧光强度尚未与未染色细胞的检测区域重叠，否则将干扰此处基于最低荧光强度子代细胞数量的相关参数估算。该组数据的分析方法与前两组图像相同，但仅使用光散射信号和CD3来筛选有活力的T细胞。该门控策略排除了大部分但并非全部死细胞，如CD3与7-AAD点图中仍残留少量七-A-A-D阳性的死细胞群体所示。在免疫表型分析中使用荧光染料时，若同时使用细胞示踪染料，可能会引发复杂的补偿问题，因为未分裂细胞的染色强度极高。在本实验中，将24小时龄的外周血单个核细胞用PKH26标记，随后用抗CD3和CD4抗体以及活性染料进行复染。在本组数据中，使用两微摩尔 PKH 26 标记的细胞经抗 CD3 FZ7AaD 和抗 CD4 APC 复染后，采用与之前相同的 R1 加 R2 设门策略进行分析。由于 PKH 26 在 APC 通道中的溢出较少，无论是否进行补偿，CD4 阳性和阴性事件均能被清晰区分。这些数据表明，即使将 PKH 26 的终浓度提高至四微摩尔，活的 CD3 阳性 CD4 阳性 T 细胞仍能保持良好的分辨效果。而使用抗 CD4 PerCP 与抗 CD3 FE 联合两微摩尔 PKH 26 及活细胞染料 Pro3 时，由于 PKH 26 在 PerCP 通道中存在显著溢出，导致结果明显较差。在未补偿的数据中，CD4阳性细胞与CD4阴性细胞无法相互区分，即使应用补偿后也仅能勉强分辨。将PKH26的终浓度提高至4 µM后，即使进行补偿处理，仍完全丧失了区分CD4阳性与CD4阴性事件的能力。请注意，包含或不包含抗CD4-CP抗体的样本几乎完全相同。当使用峰形建模软件分析染料稀释曲线以估算连续子代细胞的频率时，连续子代峰的位置和/或宽度可被设定为固定值或浮动值，其参照依据为亲代峰的数值。这些数值由未刺激对照样本估算得出。例如，该 PKH26 强度谱图来自一位中等应答者的未刺激 96 小时培养样本，用于为模态拟合增殖向导工具提供代表未分裂亲代细胞峰的初始位置和宽度估计值。若采用固定峰位置设置，则要求每一代细胞峰的平均荧光强度恰好为前一代峰强度的一半；而采用浮动峰位置设置时，各代细胞峰的最终位置可根据需要偏离预期强度，以获得最佳拟合效果。类似地，峰宽的固定设置要求每一代细胞峰的宽度与亲代或未刺激对照组峰的宽度相同；而峰宽的浮动设置则允许根据需要独立调整最终宽度，以在本表中获得最佳拟合效果。以下展示了之前图中两位不同供体的分析结果，这些供体样本中可清晰分辨出不同代次的峰。 当增殖曲线中无法明显区分不同代次的峰时，同时允许峰位置和峰宽自由浮动可获得最佳的最小化卡方值；而对于可清晰分辨代次峰的情况，则建议固定峰位置。这些数据展示了在流式细胞术免疫抑制实验中，使用两种示踪染料分别监测不同免疫细胞类型增殖历史的方法。图中绿色显示的效应T细胞用CFSE标记，蓝色显示的调节性T细胞用cell view标记。将Claret标记的细胞群体以不同比例混合，并在抗CD3、抗CD28和经照射的辅助细胞存在下培养96小时。随后，收集细胞并用抗CD4、PE-Cy7和活死染料Violet染色。此处展示了在圈出活死染料Violet阴性细胞后，Treg与T效应细胞比例为0.25:1的代表性数据。设置一个光散射门，包含淋巴细胞和原始细胞，但排除聚集体和碎片，随后设置另一个门以纳入CD4阳性事件。通过Cell View Claret染色，可将活的调节性T细胞（Treg）与高度增殖因而CFSE荧光较弱的活效应T细胞（T effector）清晰区分开来。对CFSE阳性的效应T细胞和Cell View Claret阳性的调节性T细胞的增殖谱，采用ModFit峰拟合分析软件进行分析。每样本约分析25,000个事件。其中，48%为有活力的效应T细胞，6%为有活力的调节性T细胞，其余为死亡细胞、辅助细胞和碎片。计算得到的增殖指数反映了在检测期间细胞数量的倍增情况，效应T细胞为3.85，调节性T细胞为1.83。此处展示了调节性T细胞浓度对根据CFSE染料稀释曲线计算出的效应T细胞增殖指数的影响。无论使用 Cell View Claret 标记 Treg 细胞，还是不进行染色，结果均相同，表明染色并未改变 Treg 细胞的功能。如预期所示，在追踪过程中，随着 Treg 细胞浓度的降低，T 效应细胞的增殖程度增加。此外，还根据不同 Treg 与 T 效应细胞比例下的 Cell View Claret 荧光染料稀释曲线计算了 Treg 细胞的增殖指数。正如预期，在缺乏效应T细胞（T effector cells）的情况下，调节性T细胞（Tregs）几乎不发生增殖；但随着效应T细胞浓度的增加，调节性T细胞的增殖程度也随之增强。观看本视频后，您应能充分掌握如何成功利用细胞示踪染料监测细胞增殖，如何选择合适的荧光染料及荧光补偿对照，以及如何根据染料稀释情况选择合适的模型来定量分析细胞分裂。除了该实验步骤外，还可采用其他方法来回答实验问题，例如对特异性抗原T细胞进行染色，或通过流式分选回收处于静息状态或缓慢分裂的干细胞样细胞。非常感谢您的观看。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

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增殖是细胞功能的关键部分，也是评估新药潜在毒性的常用检测指标。因此，测量增殖是细胞生物学中常用的实验方法。本文介绍一种简单且通用的增殖测量方法，适用于贴壁细胞和非贴壁细胞。...

使用点击化学法测定血管平滑肌细胞增殖

利用荧光标记蛋白和延时显微镜技术，可实时观察细胞分裂过程。通过本方案，用户可分析细胞分裂的时间动态、有丝分裂纺锤体的组装以及染色体的排列与分离。此外，还可评估并量化RNA干扰（RNAi）介导的基因敲低后上述事件中出现的异常。...

使用 Drosophila S2 细胞进行细胞分裂的活体成像

患者来源的肿瘤类器官是基础与转化研究中一种复杂的模型系统。本文详细介绍了利用多重荧光活细胞成像技术，对不同类器官表型进行同步动力学评估的方法。...

用于癌症患者来源类器官模型中药物反应的多重活细胞成像

本文展示了一种无需分级步骤即可对细胞表面蛋白进行荧光标记并增强检测的简单且特异的方法。采用二维（2-D）电泳结合Ettan™...

使用CyDye DIGE Fluor最小染料对细胞表面蛋白进行选择性标记

学习使用荧光染料标记免疫细胞并通过流式细胞术分析细胞分裂的方法。该技术结合峰值建模软件可定量评估不同刺激条件下的增殖反应，为免疫学研究提供直接的细胞分裂测量手段。

优化的细胞分裂监测染色与增殖建模方法——基于细胞示踪染料

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