Name: 医疗器械细菌高通量鉴定驱蚊聚合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 了解高通量微阵列技术用于筛选抑制细菌附着的合成聚合物。该方法可同时检测数百种聚合物，加速发现适用于医疗器械的生物材料，降低感染风险并改善患者预后。

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作者感谢EASTBIO（由英国生物技术和生物科学研究理事会资助的苏格兰东部生物科学博士培训合作伙伴关系）（S. V.）以及医学研究理事会（P.J.G）提供的经费支持。

1. 琼脂糖包被载玻片的制备
注意：在制备聚合物微阵列之前，需先用琼脂糖 I-B 涂覆氨基烷基硅烷修饰的玻片，以尽量减少非特异性背景结合，并实现对结合或排斥细菌的聚合物进行评估6。硅烷涂层有助于琼脂糖与玻片的结合。
<ol>
	<li>在250 ml瓶中，用蒸馏水配制2% (w/v)的I-B型琼脂糖溶液。</li>
	<li>将瓶盖松松盖上后，放入微波炉中，每次加热30秒，间歇加热至完全溶解。注意瓶盖不可拧紧，以避免压力积聚。加热过程中应定期取出瓶子并轻轻旋转混匀。</li>
	<li>确认固体已完全溶解且溶液澄清透明。将该琼脂糖溶液倒入100 ml烧杯中，并置于65 °C水浴中以维持液态。</li>
	<li>将硅烷化处理的载玻片浸入琼脂糖溶液中，确保涂层均匀，然后用纸巾擦拭载玻片背面。</li>
	<li>将载玻片涂层面向上放置于无尘环境中（e.g.，置于柜子或通风橱内），干燥至少24小时。</li>
	<li>通过肉眼观察确认涂层均匀。可通过向载玻片哈气来检测涂层情况——未涂层区域会出现冷凝水雾。仅完全且均匀涂层的载玻片可用于微阵列点样。</li>
</ol>
2. 打印用聚合物溶液的制备
<ol>
	<li>配制一系列预成型聚合物的溶液（1% w/v），包括聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚氨酯，溶于 NN-甲基吡咯烷酮（NMP）置于玻璃小瓶中。（每种聚合物制备1 ml）。涡旋振荡至聚合物完全溶解。聚合物的合成方法在其他文献中有详细描述。6.</li>
	<li>使用微量移液器，向384孔微孔板的每个孔中加入25 µl聚合物溶液，确保无交叉污染，且每孔含有唯一的聚合物。至少设置2个孔加入NMP作为阴性对照。在孔板模板或电子表格文件中记录每孔聚合物溶液的身份信息。</li>
</ol>
3. 使用接触式打印机打印聚合物微阵列
注意：微阵列的打印使用接触式打印机完成。有关聚合物微阵列打印的具体说明如下。关于打印机的使用方法和安全建议的一般性指导，请遵循制造商提供的用户手册。尽管我们使用的是接触式打印机，但也可使用合适的手动 stamping 装置。
<ol>
	<li>如打印机用户手册中建议，创建一个程序（参见步骤3.3），使用32针微阵列打印头（排列为8行×4列），以四重复的方式打印384种液体（聚合物溶液或NMP）。</li>
	<li>打印1,536个点，排列为48行×32列。将程序设置为分12个区域进行打印， 即一次可处理32种溶液，以便在打印每个部分后停止打印机，从而清洁针头。</li>
	<li>创建打印程序：
	<ol>
		<li>打开软件，从可用选项中选择“创建新程序”。选择“描述”选项卡以输入实验的详细信息。选择“头部”选项卡，并选择“32针微阵列头部”。</li>
		<li>选择“来源”选项卡，设置板架类型（来源板架（1×5））、板类型（384×6,000 孔板）、总板数（1）和来源顺序（按列）。</li>
		<li>在“载玻片设计”选项卡中，选择“3x1”载玻片，并选择按“场编号”进行阵列排列。然后选择“阵列模式”，输入“布局”为“点阵视图”，“模式尺寸”中的“行数”（6）、“列数”（8）、“行间距”（750）和“列间距”（560）。选择一个切片优先打印。</li>
		<li>在“幻灯片布局”选项卡中输入用于打印的幻灯片数量。选择“打印”选项卡以输入打印参数（每次蘸墨 stamp 数：1，每点 stamp 数：5，stamp 时间：200 msec，蘸墨时间：100 msec）。 
		注意：现已创建一个用于以四份重复打印384种液体（聚合物溶液或NMP）的程序，使用32针微阵列打印头（排列为8行×4列）。该程序总共应打印1,536个点，排列为48行×32列，行间距为750 µm，列间距为560 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将涂有琼脂糖的载玻片放置于平台上，并确保形成良好的真空密封以固定载玻片位置。</li>
	<li>调整打印头，使所有针脚处于同一高度。通过手动将打印头降至载玻片上，观察针脚是否同时上升，以确认高度一致。若存在高度差异，可通过上下调节针脚上的套筒进行校正。</li>
	<li>将培养板以正确的方向放置在板架上， 即A1 孔位于支架的右上方，并确保孔板固定牢固。</li>
	<li>使用高度调节器，确保板架的高度在吸取聚合物溶液时，使针头不会触碰到孔底。 
	注意：这对于实现均匀的聚合物点样以及避免聚合物溶液溢出至相邻孔中，从而防止交叉污染至关重要。</li>
	<li>选择“开始”选项卡，并将“运行类型”设置为“正常”。点击“运行”，并确认载玻片、孔板， 等等。，根据提示就位。</li>
	<li>一次打印一个部分（每次32个溶液，共12个部分），每部分之间清洁针头。用浸有丙酮的纸巾彻底清洁针头，再用干燥的纸巾擦拭，确保针头完全干燥。</li>
	<li>微阵列打印完成后，将其放入载玻片架中，并在45 °C的真空烘箱中过夜干燥，以去除聚合物斑点中的NMP。经紫外光照射灭菌30分钟后，微阵列即可用于细菌接种。</li>
	<li>在将细菌接种到载玻片之前，先测量背景荧光（如第5节所述）。在计算细菌结合量时需使用此测量值。</li>
</ol>
4. 细菌接种至聚合物微阵列
注意：确保良好的无菌操作技术。所有培养物操作均应在无菌环境中进行，可使用本生灯或在超净工作台中操作。培养物的培养需根据各物种的具体要求，调节氧气供应、培养基和温度。
<ol>
	<li>通过从平板上挑取单菌落接种至5 ml LB液体培养基（LB：10 g L-1 胰蛋白胨，5 g L-1 NaCl，10 g L-1 酵母提取物）中，制备过夜培养物。于37 °C、200 rpm振荡条件下培养过夜。</li>
	<li>向过夜培养物中加入甘油（终浓度为10%），制备冻存菌种，并将菌种保存于-80 °C。</li>
	<li>为测定解冻后细菌冻存液的细胞数量，对每种菌液进行系列稀释，并在固体培养基上过夜培养。准确测定冻存液中的细胞数量可确保每种菌种接种量的准确性6。</li>
	<li>制备用于微阵列实验的接种液。单一菌种培养物按上述方法培养后直接用于微阵列实验。BacMix-1为包含肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，K. pneumoniae）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus，S. saprophyticus）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）的细菌混合物。BacMix-2为包含变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）、S. aureus、K. pneumoniae和粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E. faecalis）的细菌混合物。</li>
	<li>为制备混合培养物，将各过夜培养物等体积混合（各3 ml），并用新鲜LB培养基稀释四倍（终体积约50 ml）。</li>
	<li>将经紫外灭菌的聚合物微阵列置于矩形四孔板中，加入6 ml混合细菌培养物，在37 °C、轻度振荡（30 rpm）条件下孵育5天。</li>
	<li>孵育结束后，用磷酸盐缓冲液（PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4）轻轻冲洗微阵列两次，随后加入含1 µg ml-1 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料的PBS溶液，孵育30分钟。</li>
	<li>将染色后的微阵列玻片转移至新的孔板中，用PBS覆盖并轻轻振荡洗涤，更换一次PBS。在气流下干燥。将玻璃盖玻片覆盖于微阵列玻片上，并用胶密封固定。待胶干燥后，用70%（v/v）乙醇对外表面进行灭菌处理。</li>
	<li>根据各菌种的生物安全等级，安全处置培养物。</li>
</ol>
5. 芯片成像与分析
<ol>
	<li>在明场和 DAPI（激发/发射 = 358 nm / 361 nm）通道中，分别采集每种聚合物点的单张图像。使用荧光显微镜手动完成，或使用配备 20 倍物镜的自动荧光显微镜（由图像采集软件控制的 X-Y-Z 载物台）进行采集。 
	注意：有关操作软件及调节显微镜以获取明场和 DAPI 通道图像的步骤，请参阅操作手册18。确保所有微阵列图像采集时的增益和曝光时间保持一致。</li>
	<li>通过选定 DAPI 通道中每个点的区域，并使用图像处理软件对荧光强度进行量化，获得每个点的平均荧光强度。</li>
	<li>对于每个点的背景荧光，获取仅用不含细菌的培养基孵育的重复微阵列上聚合物点的图像。从点的荧光强度中减去背景荧光，以获得来自细菌的荧光信号。</li>
	<li>计算代表每种聚合物的四个点的平均归一化值，用于比较不同聚合物对细菌的结合能力6。</li>
	<li>将表现出最低细菌结合（荧光强度最低）的聚合物确定为“命中”聚合物6。</li>
</ol>
6. 用于“命中”验证的盖玻片包被
<ol>
	<li>聚合物包被盖玻片：
	<ol>
		<li>将“命中”聚合物配制成四氢呋喃（THF）或其他合适溶剂中的溶液（约 2% w/v）。</li>
		<li>使用旋涂仪以 2,000 rpm 转速旋涂适当尺寸的圆形玻璃盖玻片 10 秒。 
		注意：若无旋涂仪，也可采用浸涂法对盖玻片或其他材料进行包被，但旋涂可获得更均匀的表面。</li>
		<li>将包被后的盖玻片置于 40 °C 鼓风烘箱中过夜干燥，并在接种细菌前用紫外光照射 30 分钟进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖包被盖玻片作为阴性对照：
	<ol>
		<li>通过等离子体处理 10 分钟或浸入 1 M NaOH 溶液 4 小时的方法清洁盖玻片。</li>
		<li>将盖玻片浸入含有 1% (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的乙腈溶液中过夜。用丙酮清洗盖玻片 3 次，然后放入 100 °C 烘箱中 1 小时。</li>
		<li>将干燥的盖玻片浸入保持在 60 °C 水浴中的 1% 琼脂糖水溶液进行浸涂。将包被琼脂糖的盖玻片置于无尘环境中水平放置 24 小时，并在接种细菌前用紫外光照射 30 分钟进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 使用扫描电子显微镜（SEM）进行盖玻片的贴附与分析
<ol>
	<li>使用紫外光灭菌30分钟后，将盖玻片（聚合物/琼脂糖包被或未包被的玻璃）放入标准的12孔板或24孔板中（根据盖玻片的大小选择），并按照第4节所述方法与细菌共孵育。</li>
	<li>与细菌孵育后，用0.1 M卡卡迪拉特缓冲液（pH 7.4）清洗未包被和已包被的盖玻片各两次，然后在0.1 M卡卡迪拉特缓冲液（pH 7.4）中加入2.5%（w/v）戊二醛固定2小时。</li>
	<li>在室温下用1%（w/v）四氧化锇对样品进行后固定处理1小时，并依次用50%、70%、90%和100%（v/v）乙醇溶液各清洗30分钟进行脱水。</li>
	<li>根据标准操作规程19在CO2中干燥样品。干燥时间取决于样品的性质。</li>
	<li>使用溅射镀膜仪，在30 mA电流和0.75 Torr真空条件下，用金/钯合金（60/40%）对样品进行镀膜处理，然后按照标准操作规程20在电子显微镜下观察。 
	注意：四氧化锇具有高毒性，必须采取充分的安全防护措施，以管理其在储存、操作和处置过程中带来的风险。</li>
	<li>通过肉眼比较未包被盖玻片与包被有琼脂糖或“命中”聚合物的盖玻片图像，确认这些聚合物对细菌的结合/排斥能力。 
	注意：抗附着能力应表现为存在细胞数量的明显减少，易于观察。</li>
	<li>选择最具潜力的“命中”非结合性聚合物，用于与医疗器械（e.g.，中心静脉导管）相关的包被研究6。</li>
</ol>
8. 导管涂层溶剂的选择
<ol>
	<li>评估各种溶剂与导管内置部分的相容性，以及其溶解“命中”聚合物的能力。将 cath-1 部分切成长度为 5 mm 的圆柱形片段，并使用数字游标卡尺进行测量。</li>
	<li>评估多种溶剂，如乙酸、氨水、丙酮、乙腈、乙醚、四氢呋喃（THF）、二甲基甲酰胺（DMF）、N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）、乙醇、甲醇、乙二醇、甲苯和二甲苯。将导管片段浸入溶剂中 12 小时，肉眼观察导管完整性及溶剂澄清度。 
	注意：应选择不会导致导管膨胀或解体、且不会使溶剂变浑浊的溶剂。该溶剂必须能够溶解“命中”聚合物。</li>
</ol>
9. 通过共聚焦显微镜分析导管上的细菌黏附
<ol>
	<li>在丙酮或其他根据第8节确定的合适溶剂中配制2.5% (w/v)的聚合物溶液。将5 mm长的导管片段放入小玻璃瓶（5 ml）中，加入1 ml聚合物溶液浸泡2分钟。去除多余的聚合物溶液后，将导管片段置于40 °C的真空烘箱中过夜干燥。</li>
	<li>将解冻的细菌菌种混合，制备接种液，使每种细菌在50 ml LB6中的细胞数约为106个。</li>
	<li>用紫外光对涂覆和未涂覆的导管片段进行30分钟的灭菌处理，然后在24孔板中加入1 ml接种后的LB培养基，在37 °C下孵育3天，并轻轻振荡6。</li>
	<li>孵育结束后，用PBS洗涤导管（2次，每次2 ml），再用含10%多聚甲醛的PBS固定细菌30分钟，随后用PBS洗涤（1 ml）。用DAPI（1 µg ml−1）对导管片段上的细菌染色20分钟，再用PBS洗涤（1 ml）。</li>
	<li>使用以下参数获取导管片段的共聚焦图像：405 nm蓝色二极管激光器，检测器范围414至502 nm，针孔—Airy1，图像尺寸—1,024 × 1,024像素，体素宽度—105.2 nm，Z轴步进间距—0.5 µm，放大倍数—40X 1.25。</li>
	<li>通过对导管100 µm长度范围内连续采集50张Z轴图像完成共聚焦成像。</li>
	<li>使用合适的分析软件分析图像：在Z平面内使用“扩展景深”功能将Z轴堆叠图像投影为单张图像，以获得导管片段的二维图像。 
	注意：应对此图像进行背景校正（使用“平整背景”功能）后，进一步分析细菌覆盖的导管面积。</li>
</ol>
10. 通过扫描电镜分析细菌在导管上的附着
<ol>
	<li>在丙酮中配制10%（w/v）的聚合物溶液。</li>
	<li>将200 µl微量移液器的吸头尖端压入导管切段的中段以固定导管，然后将导管段浸入聚合物溶液中约30秒。在常温条件下干燥涂覆后的导管段30分钟。再次浸入聚合物溶液进行第二次涂覆，并在常温下过夜干燥。</li>
	<li>经紫外处理并接种细菌孵育后，用PBS（2次，每次1 ml）洗涤导管段（n = 3），然后转移至含有PBS中10%甲醛的48孔板中固定30分钟。固定后，用PBS（1 ml）洗涤导管段，在室温下过夜干燥，使用导电碳盘将样品固定在样品台上，并使用溅射镀膜仪进行镀金处理（见步骤7.5）。</li>
	<li>使用扫描电子显微镜6获取图像。</li>
</ol>

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<li>May, R. M., Magin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+micropattern+to+reduce+bacterial+colonization%2C+platelet+adhesion+and+fibrin+sheath+formation+for+improved+biocompatibility+of+central+venous+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters.</a> Clin. Transl. Med. 4, (2015).</li>
<li>Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptide+melimine+coating+for+titanium+and+its+in+vivo+antibacterial+activity+in+rodent+subcutaneous+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models.</a> Biomaterials. 85, 142-151 (2016).</li>
</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

细菌附着于表面是一个复杂的过程，受多种因素影响，包括细菌种类、表面特性、周围介质以及物理环境。尽管已知某些化学基团会影响细菌的结合（例如聚乙二醇通常具有抗附着性11），但将聚合物的生物学效应与其化学结构相关联仍十分困难，这使得针对特定功能的聚合物理性设计充满挑战。在缺乏详细附着机制的情况下，其他研究尝试模拟天然存在的抗污表面，但往往需要漫长且复杂的优化过程21。本文所介绍的微型化高通量方法通过并行筛选数百种聚合物，能够高效发现值得进一步研究的候选材料，从而克服了上述难题。
微阵列方法的结果主要用于鉴定可能的候选先导物质。图2展示了22种候选物质，其中至少有一种物种的结合率较低，而图3则显示了结合能力的显著降低。在图2中所示的22种低结合聚合物均被进一步用于放大实验，其中性能最优的（在抗污性和涂层特性方面）被确定为PU83、PA13和PA515（图4和图5）。聚丙烯酸酯类聚合物在聚合方法上具有更高的灵活性，因此选择其中结合率最低的聚丙烯酸酯PA13用于导管涂层研究（图6和图7）。对其他候选物质的更深入研究也已开展，并已在其他文献中报道6。
经过多次实验迭代，我们发现一些细微步骤对实验成功和可重复性至关重要。使用琼脂糖底层包被不仅有助于聚合物在玻片上的黏附，还能提供洁净的背景，因为琼脂糖对细菌定植具有高度抗性。同样，聚合物点样的一致性（无论在同一芯片内还是不同芯片之间）也极为关键，因此芯片的打印过程必须严格控制。为确保点样均匀，需仔细调节打印头针头的位置，并保证384孔板中各孔加样均匀。由于我们使用的部分聚合物具有一定程度的自发荧光，因此在细菌孵育前获取每张玻片的背景荧光数据至关重要。为消除变异并获得可靠的数据，建议进行微阵列的重复实验。
此处使用的染色剂（DAPI）对细菌种类无选择性，可非特异性地结合DNA。因此，在引入细菌培养物后，良好的无菌操作技术至关重要，因为污染可能不易被察觉，从而干扰实验结果的解读。后续使用扫描电子显微镜的实验也是如此，在这些实验中仅能区分杆菌和球菌，而无法分辨其属或种。
在微阵列筛选之后，应选择有前景的聚合物进行进一步验证。在本示例中，通过微阵列上荧光信号的明显降低，初步筛选出七种感兴趣的聚合物，并通过将其涂覆于较大表面积表面，确认了其对细菌黏附的抑制作用。图4和图5展示了在玻璃盖玻片上实现的结合量减少情况，这是一种用于检测聚合物作为整体涂层（而非微阵列点）行为的有效方法。随后，将这些聚合物涂覆于医疗器械表面，以全面量化其对细菌黏附的抑制效果。在这些涂覆实验中，所选溶剂（见方案第8部分）必须对目标基底（此处为导管）无损害，同时仍具备溶解目标聚合物的能力，以实现有效涂覆。本研究中使用了丙酮，除具备上述特性外，丙酮还具有低沸点，可快速蒸发，从而形成均匀的涂层。
所选择的验证方法将取决于具体研究的应用。由于电子显微镜和荧光显微镜能够直接对单个细胞的附着情况进行定量分析，我们选用这些技术作为整体染色微阵列检测的补充。结果如图6和图7所示，体现了互补性验证方法的重要性。图6中的共聚焦图像清晰地展示了单个细胞的形态，而扫描电镜（SEM）则额外提供了对聚合物表面形貌的评估，此处显示其表面光滑且均匀。这些方法受限于所用显微镜的视野范围，因此必须拍摄一系列图像，以确保结果的可靠性。上述方法无法对整个表面的细菌黏附进行定量，仅能通过若干小区域的结果推断整体覆盖情况。我们认为这对于所描述的应用已足够充分。可通过计数整个涂层与未涂层导管片段表面黏附的细菌数量来评估细菌结合的减少程度，相关方法已在其他文献中描述22。然而，此类方法要求被筛选的生物材料表面具有统一的表面积，而在使用具有复杂几何结构的医疗器械进行实验时，这一点往往难以维持。
显然，任何拟用于临床的设备都必须经过大量进一步测试，以确保其在人体中的安全性和有效性。本文所介绍的方法仅代表这一过程的起点，后续工作必须包括对结果的验证 体内 活性。在这种情况下，研究静脉导管时，初步工作可探究血液成分和完整细胞与聚合物的结合情况。还应考虑血液成分对细菌结合的影响，可通过在灭活血清或去纤维化血液存在下重复结合实验来实现。23. 该技术的最终测试将在一个 在体 例如皮下植入物感染模型24.
我们展示了聚合物微阵列方法在筛选表面改性聚合物方面的潜力。这类聚合物（既包括抑制也包括促进细菌结合的聚合物）在医学、食品工业和生物技术领域具有广泛的应用，因此该方法可能在多个研究领域中具有重要价值。尽管本研究中使用了细菌，但该方法也可适用于其他细胞类型，同样可借鉴用于其他化学微阵列。

聚合物微阵列是一种微型化的高通量平台，可将多达7,000种聚合物1打印在玻璃载片上，用于与原核或真核细胞进行平行分析2。本文所述方法基于我们于2010年首次报道的技术3。该筛选系统已应用于多种细胞类型，包括人肝细胞4、干细胞5、肾小管上皮细胞2、细菌3,6以及原生动物病原体7。在每种情况下，均鉴定出促进或抑制研究对象细胞黏附的聚合物材料8。此外，DNA与合成阳离子聚合物形成的复合物也已被用于微阵列形式，以高通量筛选基因转染候选材料9。除了用于细胞-基底相互作用的筛选外，聚合物微阵列还被用于评估材料性能10。
合成聚合物调控细菌在表面黏附能力的研究已有充分依据3,6,11。已知多种因素，包括聚合物表面的电荷、疏水性及表面粗糙度，均会影响细菌的结合。传统方法通过逐个或经验性地设计和测试单一材料来发现抗细菌结合的生物材料，这类方法耗时耗力、成本高昂且效率低下。聚合物微阵列为此类局限性提供了一种理想的替代方案。
附着在表面的细菌以一种称为生物膜的复杂群体形式生长——这类生物膜对多种环境胁迫和抗生素具有高度抗性。这在一定程度上归因于其致密的胞外基质（由蛋白质、多糖和核酸组成）12，另一方面则归因于生物膜中大量存在的耐受性强的&#34;持留细胞&#34;13。尽管表面附着及随后生物膜形成的精确机制难以表征，但普遍认为表面生长可分为三个不同阶段14-16。最初是可逆性附着，随后细菌发生更强的黏附，并通过产生胞外蛋白和多糖基质形成生物膜，同时细胞开始增殖。最终，成熟的生物膜释放出自由生活的浮游细胞，这些细胞可在其他部位引发新的感染。能够阻止细菌初始附着、从而抑制生物膜形成早期阶段的抗细菌聚合物，可能为减少感染提供一种极佳的解决方案。鉴于抗生素耐药性的上升（以及表面附着细菌本身具有的更高耐药性12），非抗生素方式的感染控制手段尤其受到关注。在医院环境中，抗细菌聚合物涂层可直接用于医疗领域，以减少通常在植入器械周围形成的医院获得性感染17。
本文描述了一种高通量筛选方法，用于检测381种聚合物对多种与医院内感染相关的致病菌的抗黏附活性，随后进行阳性结果验证，并对中心静脉导管材料进行涂覆和检测（图1）。简言之，通过接触式点样将聚合物点在琼脂糖包被的玻璃载片上，干燥并灭菌后，将微型阵列与临床上重要的细菌培养物共同孵育。孵育结束后，轻轻洗涤微阵列，并对黏附的细菌细胞进行荧光染色和可视化检测。随后，对能够抑制细菌黏附的聚合物进一步在更大尺度上进行研究，将其涂覆于玻璃盖玻片上，并通过电子显微镜观察。最终，筛选出的具有抗黏附性能的聚合物被涂覆于商用导管表面，结果显示其可使细菌附着减少近100倍。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>05066&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>硅烷化处理载玻片</td><td>Sigma</td><td>S4651</td><td></td></tr><tr><td>聚合物</td><td>本实验室合成</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>NMP</td><td>Sigma</td><td>494496</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Oxoid</td><td>CM1018</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷包被的玻片</td><td>Sigma</td><td>Silane-prep</td><td></td></tr><tr><td>卡可基酸缓冲液</td><td>Sigma</td><td>97068</td><td></td></tr><tr><td>导管 1</td><td>Arrow International</td><td>CS12123E</td><td></td></tr><tr><td>导管 2</td><td>Baxter Healthcare</td><td>ECS1320</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接触式点样仪</td><td>Genetix</td><td>Qarraymini</td><td></td></tr><tr><td>微阵列显微镜</td><td>IMSTAR</td><td>Pathfinder</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Speedline Technologies</td><td>6708D</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Media Cybernetics</td><td>Image-Pro Plus</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Philips</td><td>XL30CP</td><td></td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Bal-Tec</td><td>SCD050</td><td></td></tr></tbody></table>

用于医疗器械的细菌排斥聚合物高通量筛选

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

医疗器械常与医院获得性感染相关，这不仅给患者和医疗系统带来巨大负担，还加剧了抗菌素耐药性问题。减少器械相关感染的一个可行途径是为这些器械开发具有抗细菌黏附性能的聚合物涂层，从而在初始附着阶段阻止细菌的结合。本文介绍了一种基于微阵列并行筛选数百种聚合物的方法，用于识别此类抗黏附聚合物。该高通量方法成功鉴定出一系列具有潜力的聚合物，能够有效抵抗多种临床相关细菌单独以及多物种群落状态下的黏附。其中一种聚合物PA13（聚甲基丙烯酸甲酯-共-二甲基丙烯酰胺）在涂覆于两种市售中心静脉导管表面后，显著降低了多种医院分离菌株的附着率。所描述的方法可广泛应用于需要调控细菌附着性能的各类聚合物筛选场景。

图2显示了通过微阵列分析测定的细菌在多种聚合物表面的附着情况（归一化荧光强度）。未打印聚合物的点样区域（仅含NMP）作为阴性对照，因为琼脂糖强烈抵抗细菌结合6，记录到的荧光信号非常低。所展示的聚合物均表现为低结合性，但在大多数情况下，不同测试菌种之间聚合物的抗粘附性能存在显著差异。这反映了不同菌种间附着机制的广泛差异。因此，合适聚合物的选择取决于具体应用，但通过与琼脂糖比较，可轻松识别出低结合性聚合物。高结合性聚合物通常可在阵列中被识别，并可用于后续实验的阳性对照。对于在DAPI通道中不产生自发荧光的聚合物，可通过肉眼直观比较点样图像（如图3所示，突出显示一种代表性高结合性聚合物和三种低结合性聚合物示例）。尽管这种比较提供的信息少于统计分析，但可作为所计算强度值的有效视觉验证。
通过微阵列筛选出22种合适的聚合物后，进行放大实验，以验证其在较大表面涂层应用中的抗细菌黏附性能。图中展示了表现最优的示例，用于涂覆玻璃盖玻片（通过扫描电子显微镜分析（图4 和 图5））和导管切片（通过共聚焦显微镜分析（图6）和扫描电子显微镜分析（图7））。这两种显微技术均能实现表面直接细胞计数，提供明确的数据；细胞黏附的减少情况清晰可见。在放大实验中能最好地保持抗黏附性能，且适用于大规模涂层技术的涂层被进一步深入研究。所展示的结果代表了各阶段中表现最佳的聚合物。
<img alt="聚合物微阵列过程；抗细菌黏附；示意图；荧光成像；SEM分析。" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：通过聚合物微阵列鉴定用于生物医学应用的抗细菌黏附聚合物的步骤。 SEM = 扫描电子显微镜。 
<img alt="荧光强度与聚合物名称关系图；细菌菌株比较；数据分析结果。" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2：通过微阵列分析测定一系列聚合物上的细菌结合情况。 多种聚丙烯酸酯/丙烯酰胺（PA）和聚氨酯（PU）材料上观察到较低的细菌结合。结果显示了多种细菌物种（C. jejuni、C. difficile、C. perfringens、S. mutans）以及两个菌群（BacMix-1 和 BacMix-2）在聚合物微阵列上的结合情况。细菌结合以背景校正后的平均DAPI荧光强度（归一化）表示。误差条代表标准偏差。改编自参考文献6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌结合聚合物示意图；用于聚合物分析与比较的荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：聚合物斑点的示例图像。 显示BacMix-2在代表性聚合物上细菌附着情况的荧光（DAPI）和明场显微镜图像。图中包含一种强结合性聚合物，用于与几种非结合性聚合物（PU-20、PA-336和PU-179）进行对比。比例尺 = 100 µm。改编自参考文献6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌分布分析；SEM图像，BacMix-1和BacMix-2在不同材料表面的比较。" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：使用玻璃盖玻片的放大实验。 扫描电镜（SEM）图像显示细菌在未涂层玻璃和涂有“命中”聚合物的玻璃表面的附着情况（选自表1）。比例尺 = 20 µm。
<img alt="细菌生长比较，柱状图；BacMix-1 与 BacMix-2 在不同底物上的表现。" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过扫描电镜图像的细胞计数定量细菌结合能力。 比较在最佳“命中”聚合物涂层表面单位面积上附着的细胞数量。以琼脂糖作为“非结合”表面的对照，玻璃作为结合表面的对照。误差线表示标准偏差。
<img alt="细菌分布，荧光显微镜；实验显示细菌浓度差异。" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6：涂层与未涂层导管切片上细菌结合能力的比较。 共聚焦图像对比了与BacMix-2共孵育后的未经处理导管（cath-1）（A）和经PA13涂层处理的导管（B）。图像使用40倍物镜拍摄（比例尺 = 20 µm）。改编自参考文献6。
<img alt="在10μm尺度下比较表面纹理的电子显微镜图像；A：致密，B：稀疏。" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7： 涂层与未涂层导管切片上细菌结合的比较 扫描电镜图像显示未经处理的导管（cath-1）的对比A）以及涂有PA13的导管（B孵育于由BacMix-2组成的细菌混合液后）. 比例尺 = 10 µm改编自参考文献6.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>聚合物</td>
			<td>单体 1</td>
			<td>单体 2</td>
			<td>单体 3</td>
			<td colspan="3">单体比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA465</td>
			<td>MEMA</td>
			<td>DEAEMA</td>
			<td>HEA</td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA475</td>
			<td>MEMA</td>
			<td>DEAEA</td>
			<td>HEMA</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA513</td>
			<td>MEMA</td>
			<td>DEAEMA</td>
			<td>MMA</td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA515</td>
			<td>MEMA</td>
			<td>DEAEA</td>
			<td>MMA</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA13</td>
			<td>MMA</td>
			<td>DMAA</td>
			<td>-</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU1</td>
			<td>PEG2000</td>
			<td>HDI</td>
			<td>-</td>
			<td>4.9</td>
			<td>5.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU16</td>
			<td>PEG2000</td>
			<td>MDI</td>
			<td>-</td>
			<td>4.9</td>
			<td>5.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU161</td>
			<td>PEG2000</td>
			<td>MDI</td>
			<td>BD</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5.2</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU7</td>
			<td>PEG900</td>
			<td>BICH</td>
			<td>-</td>
			<td>4.9</td>
			<td>5.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU83</td>
			<td>PEG900</td>
			<td>HMDI</td>
			<td>BD</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5.2</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU227</td>
			<td>PPG-PEG-1900</td>
			<td>HDI</td>
			<td>-</td>
			<td>4.9</td>
			<td>5.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU129</td>
			<td>PPG425</td>
			<td>BICH</td>
			<td>DMAPD</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5.2</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU10</td>
			<td>PTMG2000</td>
			<td>BICH</td>
			<td>-</td>
			<td>4.9</td>
			<td>5.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU179</td>
			<td>PTMG2000</td>
			<td>HDI</td>
			<td>NMAPD</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5.2</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU20</td>
			<td>PTMG2000</td>
			<td>MDI</td>
			<td>-</td>
			<td>4.9</td>
			<td>5.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU5</td>
			<td>PTMG2000</td>
			<td>HDI</td>
			<td>-</td>
			<td>4.9</td>
			<td>5.2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：图2中细菌非结合“命中”聚合物的组成。

本文描述了一种高通量微阵列方法，用于鉴定可减少细菌在医疗器械表面黏附的聚合物。

医疗器械常与医院获得性感染相关，这给患者和医疗系统带来巨大负担，以及……

该聚合物微阵列技术的总体目标是鉴定出能够调控细菌在非生物表面附着的合成聚合物。该方法有助于加快发现简单且具有成本效益的生物材料，以抑制细菌在医疗器械上的附着。与传统生物材料研究中一次仅测试一种材料的方法相比，该技术的主要优势在于能够在单次实验中同时筛选数百种聚合物。首先，根据文本方案制备聚合物溶液，并将其加入384孔板的各孔中。创建一个打印程序，以四重复方式打印聚合物，共1536个点，排列为48行×32列，每次打印32种聚合物溶液，以便在每部分打印完成后可暂停打印机，对针头进行清洗。随后将涂有琼脂糖的载玻片放置于平台上，并确保形成良好的真空密封，以固定载玻片位置。为调整打印头使所有针头处于同一高度，手动将打印头降下接触载玻片，并确认所有针头同时向上移动。将孔板放置在板架上，使A1孔位于板架的右上角，并确保孔板牢固固定。当系统提示时，确认载玻片和孔板已正确就位。一次打印一个区域，以便在区域之间清洁针头。然后用浸有丙酮的纸巾彻底清洁针头，再用干燥的纸巾擦拭，确保针头完全干燥。微阵列完全打印完成后，将其放入载玻片架中，并转移至设定为40摄氏度的真空烘箱中干燥，以去除聚合物点样中的N&P。然后使用紫外光对载玻片进行30分钟的灭菌处理。在用细菌接种载玻片之前，根据文本方案测量背景荧光值。根据文本方案培养并制备微阵列的接种物后，将经紫外线灭菌的聚合物微阵列置于矩形四孔板中，并加入六毫升混合细菌培养物。在37摄氏度下轻柔振荡培养五天。培养结束后，用PBS轻轻冲洗微阵列两次。然后加入含1微克/毫升DAPI的PBS溶液，孵育30分钟。接着将微阵列转移至新的四孔板中，用PBS覆盖微阵列并轻轻振荡。随后更换一次PBS，重复洗涤步骤。清洗后，在气流下干燥微阵列，然后贴上封片膜，并将玻璃盖玻片固定在微阵列载玻片上。待胶水干燥后，使用70%乙醇对外表面进行消毒。使用配备20倍物镜的荧光显微镜，在明场和strappy通道中分别采集每个聚合物点的单张图像。为了用聚合物包被盖玻片，需在四氢呋喃或其他合适溶剂中配制HIT聚合物溶液。使用旋涂仪，将适量聚合物溶液在适宜尺寸的圆形玻璃盖玻片上以2000 RPM转速旋涂10秒。将包被后的盖玻片置于40摄氏度的对流烘箱中过夜干燥。在接种细菌前，使用紫外光对盖玻片灭菌30分钟。将经紫外灭菌的盖玻片放入标准的12孔或24孔板中，并按照本视频前面演示的方法与细菌共孵育。孵育结束后，先用0.1摩尔的卡可基酸缓冲液洗涤包被的盖玻片两次，然后用2.5%（质量/体积）戊二醛与0.1摩尔卡可基酸缓冲液混合液固定样品2小时。在室温下用1%的四氧化锇固定盖玻片1小时。随后在乙醇系列溶液中进行脱水，每种浓度处理30分钟。然后使用溅射镀膜仪，在0.75托的真空度和30毫安电流条件下，以60%金与40%铂的合金混合物对样品进行镀膜。使用扫描电镜（SEM）成像后，通过视觉比较未涂层盖玻片与涂有琼脂糖或HIT聚合物的盖玻片图像，以确认聚合物对细菌的结合或排斥能力。为评估不同溶剂与导管末端膨胀部分的相容性及其溶解HIT聚合物的能力，将导管片段浸入溶剂中，孵育12小时，随后通过肉眼观察导管的完整性及溶剂的澄清度进行评价。为通过扫描电镜分析导管上的细菌黏附情况，需在丙酮中配制10%的聚合物溶液。将200微升微量移液器吸头压入导管切割段的中段以固定该段，然后将导管段浸入聚合物溶液中约30秒。在常温条件下干燥涂覆后的导管段30分钟，然后通过再次将导管段浸入聚合物溶液中进行第二次涂覆，并在常温条件下过夜干燥。根据文本方案，将涂覆与未涂覆的导管段在接种的LB培养基中孵育后，使用1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗导管。然后使用 PBS 中的 10% 多聚甲醛固定细菌 30 分钟。用 PBS 洗涤后，使用 DAPI 对导管片段上的细菌染色 20 分钟。再用一毫升 PBS 洗涤。观察样品在腔室中的排列情况。使用以下设置，对导管片段进行共聚焦成像。通过在导管100微米长度范围内进行50层z轴堆叠，完成共聚焦成像。紫外线处理并用细菌孵育后，使用一毫升 PBS 洗涤材料两次，然后转移至含有 PBS 中 10% 甲醛的 48 孔板中，固定 30 分钟。固定样品后，再次用 PBS 洗涤，并在室温下过夜干燥。随后使用导电碳片将样品固定在样品台上，并用溅射镀膜仪进行金镀膜。成像前，使用扫描电子显微镜。该图显示了通过微阵列分析确定的细菌对多种聚合物的黏附情况。未打印聚合物的点作为阴性对照，因为琼脂糖强烈抵抗细菌结合，因此荧光信号非常低。所展示的聚合物具有合金结合特性，尽管在大多数情况下，不同测试菌种对聚合物的抗粘附性能表现出显著差异。这反映了不同菌种之间附着机制存在广泛差异。通过与琼脂糖比较，可轻易识别出低结合能力的聚合物。高结合性聚合物可能在阵列中被鉴定出来，并可作为后续实验的阳性对照。对于在DAPI通道中不显示自发荧光的聚合物，可通过肉眼对斑点图像进行定性比较。为验证所鉴定出的22种合适聚合物的抗细菌黏附性能，已开展放大实验以测试其在较大表面涂层的应用。如图所示，为通过扫描电镜（SEM）分析筛选出的用于包被玻璃盖玻片的最佳性能样品。这些图像显示了通过共聚焦显微镜和扫描电镜（SEM）分析的导管切片。两种显微技术均能够实现对表面细胞的直接计数，从而提供明确的数据，因为细胞黏附的减少可被清晰观察到。采用此方法后，可对血清或血液成分进行检测，以确定其对细菌结合的影响。可使用动物模型来评估聚合物涂层在临床应用中的潜力。请注意，操作化学品和病原生物可能存在危险。在处理和处置过程中应采取必要的控制措施，以降低对个人和环境的风险。

high-throughput-identification-bacteria-repellent-polymers-for

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

医疗器械细菌高通量鉴定驱蚊聚合物

介绍一种采用芯片内光聚合技术制备聚合物微阵列的方法。同时描述了利用原子力显微镜、水接触角测量、X射线光电子能谱、飞行时间二次离子质谱以及细胞黏附实验对表面进行高通量表征的过程。...

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本文描述了一种合成操纵子的设计，该操纵子编码卷曲纤维的分泌装置及其结构单体。E.

通过构建单个合成卷曲菌毛操纵子工程化黏附性细菌

来源：Venkateswaran, S., 等．用于医疗器械的抗细菌聚合物的高通量筛选．J. Vis. Exp.

通过微阵列筛选高通量鉴定抗细菌聚合物

通过静电纺丝或电喷雾技术，将可生物降解聚合物与具有相似组成的低表面能聚合物共混，制备出二维和三维超疏水聚合物材料。...

用于生物医学应用的超疏水聚合物材料的制备

我们提出一种自动化、模块化的高通量方法，用于小规模微生物胞外多糖的鉴定与表征。该方法结合快速初筛以分析分泌多糖的总量，以及详细的碳水化合物指纹图谱分析，从而实现对新分离细菌菌株或完整菌株库的快速筛选。...

自动化模块化高通量胞外多糖筛选平台结合高灵敏度碳水化合物指纹图谱分析

细菌附着于宿主细胞是宿主定植和感染过程中的关键步骤。本方案描述了制备聚合物偶联的重组黏附素作为仿生材料的方法，该材料可独立于其他细菌因子，用于分析单个黏附素在这些过程中所起的作用。...

用于表征细菌-宿主相互作用的仿生材料

我们提出了一种用于先进材料抗菌性能表征的实验方案。在此，通过两种相互补充的方法测定材料表面的抗菌活性：一种基于琼脂平板扩散试验，另一种则是依据ISO...

用于生物工程应用的先进材料的抗菌性能表征

报道了利用高分辨率光刻工具通过光降解水凝胶分离细菌细胞的方法。综述了该方法的关键实验步骤、结果及其优势。该方法能够从异质性菌群或种群中快速、低成本地分离出具有稀有或独特功能的目标细菌。...

光可降解水凝胶界面用于细菌筛选、选择与分离

本方案介绍了利用自组装深孔PCR板装置进行生物膜生长及生物量测定的方法，适用于高通量96孔带钉盖静态生物膜筛选。...

利用PCR板深孔微孔板装置生成更多的细菌生物膜生物量

本文介绍一种利用市售的基于实时ATP的发光微生物活力检测方法，评估载抗生素聚合物在模拟预防性临床应用中的抗菌效果的实验方案。该方法可实现对药物释放材料长期活性的监测，并可广泛适用于各类抗菌药物递送平台的测试。...

一种测定载药材料纵向抗菌活性的新方法

了解高通量微阵列技术用于筛选抑制细菌附着的合成聚合物。该方法可同时检测数百种聚合物，加速发现适用于医疗器械的生物材料，降低感染风险并改善患者预后。

用于医疗器械的细菌排斥聚合物高通量筛选

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