医疗器械细菌高通量鉴定驱蚊聚合物

这种聚合物微阵列技术的总体目标是鉴定能够调节细菌附着于非生物表面的合成聚合物。这种方法可以帮助加快发现简单、经济高效的生物材料的进展，这些生物材料可以抑制细菌附着在医疗器械上。与一次测试一种材料的传统生物材料研究相比，该技术的主要优势在于它能够在单个资产中同时筛选数百种聚合物。

首先，根据文本方案制备聚合物溶液并将其添加到 384 孔板的孔中。创建一个程序，一式四份打印聚合物，由 1536 个点组成，排列为 48 行和 32 列，一次打印 32 种聚合物溶液，以便在打印每个部分后可以停止打印机，以便清洁针脚。现在将琼脂糖包被的玻片放在平台上，并确保良好的真空密封以将玻片固定到位。

要调整打印头以使所有针脚处于相同高度，请手动将打印头降低到载玻片上，并确认针脚同时向上移动。将孔板放在板支架上，孔 A1 位于支架右上方，并确保孔板牢固固定。出现提示时，确认载玻片和孔板就位。

打印一个部分，以便清洁部分之间的引脚。然后用蘸有丙酮的纸巾彻底清洁针脚。然后是干燥的薄纸，以确保针脚完全干燥。

当微阵列完全打印出来后，将它们放在载玻片架中，然后转移到真空烘箱中，在40摄氏度下干燥，以去除聚合物斑点中的N&P。然后使用紫外线对板消毒 30 分钟。在用细菌接种载玻片之前，根据文本协议测量背景荧光。

在培养和制备用于微阵列的接种物后，根据文本方案，将 UV 灭菌的聚合物微阵列置于矩形四孔板中，并加入 6 毫升混合细菌培养物。将板在 37 摄氏度下孵育 5 天，轻轻搅拌。孵育后，使用 PBS 轻轻冲洗微阵列两次。

然后每毫升添加 1 微克 DAPI 的 PBS 溶液，孵育 30 分钟。接下来，将微阵列转移到新的四孔板中，用 PBS 覆盖微阵列，然后轻轻旋转。然后更换 PBS 一次并重复洗涤。

冲洗后，在气流下干燥微阵列，然后贴上密封膜并将玻璃盖玻片贴在微阵列载玻片上。当胶水干燥时，用 70% 乙醇对外表面进行消毒。使用配备 20 倍主观镜头的荧光显微镜，在明场和带状通道中捕获每个聚合物点的单个图像。

要用聚合物涂覆盖玻片，请在四氢呋喃或其他适当溶剂中制备 HIT 聚合物溶液。使用旋涂机，用聚合物溶液以 2000 RPM 的速度旋涂合适尺寸的圆形玻璃盖玻片 10 秒。将涂有涂层的盖玻片放入 40 摄氏度的对流烘箱中干燥过夜。

并在接种细菌之前使用紫外线对盖玻片消毒 30 分钟。将 UV 灭菌的盖玻片放入标准的 12 或 24 孔板中，并与细菌一起孵育，如本视频前面所示。孵育后，使用 0.1 摩尔二甲胂酸盐缓冲液洗涤涂层盖玻片两次，然后用每体积重量 2.5% 的戊二醛和 0.1 摩尔二甲胂酸盐缓冲液，固定样品两小时。

用 1% 四氧化锇在室温下将盖玻片后固定 1 小时。在乙醇系列中以每种浓度将它们脱水 30 分钟之前。然后，使用溅射镀膜机和 60% 至 40% 的金-铂合金混合物，使用 30 毫安的电流和 0.75 托的真空对样品进行镀膜。

使用 SEM 拍摄图像后，目视比较未包被的盖玻片和涂有琼脂糖或 HIT 聚合物的盖玻片的图像，以确认聚合物的细菌结合或排斥能力。为了评估各种溶剂与导管末端渗出部分的相容性，以及它们溶解 HIT 聚合物的能力，将导管片浸入溶剂中并孵育 12 小时，然后目视评估导管的完整性和溶剂的透明度。为了通过 SEM 分析导管上的细菌附着，请在丙酮中制备 10% 聚合物溶液。

将 200 微升微量移液器吸头压入导管切割件的中部以固定它，并将该件插入聚合物溶液中约 30 秒。在环境条件下干燥涂层件 30 分钟，然后通过将导管件再次浸入聚合物溶液中来涂上第二层涂层，并在环境条件下干燥过夜。在接种的 LB 中孵育涂层和未涂层的导管片后，根据文本方案，使用一毫升 PBS 清洗导管。

然后使用 PBS 中的 10% 多聚甲醛固定细菌 30 分钟。用 PBS 洗涤后，使用 DAPI 对导管上的细菌进行 20 分钟的染色。用 1 毫升 PBS 洗涤前。

观察样品在腔室中的排列。使用以下设置，拍摄导管片的共聚焦图像。通过在 100 微米长的导管上对 50 张图像进行 z 轴堆叠来完成共聚焦成像。

紫外线处理并与细菌孵育后，使用 1 毫升 PBS 洗涤碎片 2 次，然后将它们转移到含有 10% 甲醛 PBS 溶液的 48 孔板中 30 分钟。固定样品后，用 PBS 进行另一次洗涤并在室温下干燥过夜。然后用导电碳盘安装在短线上，并使用溅射镀膜机镀金。

成像前，使用扫描电子显微镜。该图显示了通过微阵列分析确定的细菌对许多聚合物的附着。未使用聚合物打印的斑点充当阴性对照，因为琼脂糖强烈抵抗细菌结合，因此荧光非常低。

显示的聚合物是合金结合的，尽管在大多数情况下，聚合物的驱虫性能在测试的细菌种类之间有很大差异。这反映了不同物种之间附着机制之间的巨大差异。通过与琼脂糖进行比较，很容易识别低结合聚合物。

高结合聚合物很可能在阵列中被鉴定出来，并可用作后续实验的阳性对照。对于在 DAPI 通道中不显示自发荧光的聚合物，可以直观地对光斑图像进行定性比较。进行了扩大实验以测试涂层更大的表面，以确认已确定的 22 种适当聚合物的抗菌性能。

此处显示的是 SEM 分析的用于涂覆玻璃盖玻片的性能最佳的样品。这些图显示了通过共聚焦显微镜和 SEM 分析的导管切片。两种显微方法的优点是允许在表面直接进行细胞计数，从而提供明确的数据，因为细胞附着的减少很容易看到。

按照此程序，可以测试血清或血液成分以确定它们对细菌结合的影响。可以使用动物模型来评估聚合物涂层在临床上的潜力。不要忘记，与化学品和病原生物一起工作可能是危险的。

在处理和处置过程中应采取必要的控制措施，以减轻人身和环境风险。