再加上高灵敏度指纹碳水化合物自动分析模块化高通量筛选胞外多糖平台

这种方法的总体目标是快速可靠地筛选微生物胞外多糖生产者并鉴定其碳水化合物指纹图谱。这是利用未开发的胞外多糖多样性的重要步骤。我们的方法有助于加快微生物胞外多糖领域的聚合物研究。

它能够针对特定应用快速鉴定具有不同特性的新型多糖变体。该技术的主要优点是将不同的胞外多糖检测系统组合在一个模块化和完全自动化的筛选概念中。这使得它非常快速和可靠。

该技术也可以在没有自动化平台的实验室中手动进行，因此其使用非常灵活，并且可以根据不同的筛选需求进行调整。该胞外多糖 （EPS） 筛选平台具有模块化设置，可将方案分为两个主要部分，即自动筛选和碳水化合物指纹图谱。第一个任务是培养用于筛选的菌株并通过离心去除细胞。

菌株在 96 孔板中以葡萄糖作为碳源培养，在 30 摄氏度和 1， 000 RPM 的微量滴定板振荡器上覆盖有透气密封膜。在筛选当天，按照协议文本中的说明准备机器人工作台和存储轮播。从板上取下透气密封膜，并将主要培养物分配到转盘位置 1-1 至 1-4。

启动自动化机器人程序。为了在培养后去除细胞，将主要培养的深孔板从转盘转移到离心机中，并在 4， 300 x g 和 20 摄氏度下离心 30 分钟。对于过滤前的沉淀，将微量滴定板以及 pH 指示剂微量滴定板从转盘移至工作台。

同时将过滤板（确保完全去除所有细菌细胞）与收集板一起转移到其工作台位置。离心后，将 180 μL 主要培养上清液转移到过滤板中。从主要培养上清液中吸出 150 μL，将 50 μL 分液分液到微量滴定板中，过滤前进行沉淀，取 100 μL 液分液到 pH 指示板中。

用 2-丙醇沉淀上清液以评估 EPS 的产生。使用 12.5 毫升多步移液器向每个孔中手动添加 150 微升 2-丙醇。在室温下以 900 RPM 的速度摇动微量滴定板 10 分钟后，目视观察表明 EPS 产生的纤维或薄片的形成。

将主培养板放回转盘后，检查发酵液，离心后发酵液应显示沉淀减少。粘度的增加是 EPS 生产的另一个指标。第二项任务是通过 96 孔过滤确保从粘性发酵液中完全去除细胞。

过滤板在 3， 000 x g 和 20 摄氏度下离心 10 分钟。然后将板放回其转盘初始位置，并按照方案文本中的说明进行凝胶过滤的平衡。接下来，将 35 微升滤液移液到平衡凝胶过滤板的中心，将 50 微升滤液移液到用于沉淀的微量滴定板中。

将凝胶过滤板移至离心机，然后将所有其他板从工作台移回转盘中的起始位置。将所有板储存回转盘中后，请注意滤板中的残留物所示的高粘度上清液。缺少滤液会导致以下分析模块中出现假阴性结果。

自动筛选的第三项任务是通过 96 孔凝胶过滤从生长培养基中去除剩余的单体糖。将凝胶过滤板在 1， 000 x g 和 20 摄氏度下离心 2 分钟。通过机器人机械手准备工作台以处理凝胶滤液。

为了检测凝胶过滤后的剩余葡萄糖，我们使用 50 μL 吸头将 25 μL 双蒸水转移到新鲜的微量滴定板中。吸出 20 微升双蒸水、5 微升空气和 5 微升凝胶滤液，并分配到同一板中。取 200 微升吸头，从工作台位置 1-2 吸出 50 微升葡萄糖测定试剂混合物，开始第一次测定。

将微量滴定板移入培养箱中。孵育 30 分钟后，将板从培养箱移至微量滴度读数仪，并记录 418 和 480 纳米处的吸光度。为了通过苯酚-硫酸法测定总碳水化合物含量，将 20 微升凝胶滤液移液到微量滴定板中。

手动从转盘中取出板并将其放入液体处理站。包括一式三份含有 20 微升不同葡萄糖浓度的校准板。在位置 1 放置一个废液容器，在位置 2 放置一个 300 微升吸头盒，在位置 3 放置一个装有 110 毫升新鲜制备的苯酚硫酸的 250 毫升槽。

使用带有 300 微升吸头的 8 通道移液器将 180 微升苯酚硫酸转移到所有板的每一行中。用盖子盖住所有微量滴定板，并在室温下以 900 RPM 振荡 5 分钟混合。在 80 摄氏度的烘箱中孵育 35 分钟以进行颜色反应。

在通风橱下冷却板后，测量 480 纳米处的消光。如果来自自动筛选的菌株满足以下三个标准中的至少两个，则被指定为 EPS 阳性。粘度控制、聚合物检测和计算葡萄糖当量。

葡萄糖当量使用此方程计算。筛查平台的 Carbohydrate Fingerprint 包含最后三个手动执行的任务。任务 2 中阳性结果的剩余滤液为任务 5 中的凝胶滤液提供了基础。

任务 6 是凝胶滤液的 96 孔微量水解。为此，首先使用 12 通道 50 μL 移液器将 20 μL 凝胶滤液转移到新的 PCR 板中。然后使用 1.25 毫升多步移液器向每个孔中加入 20 微升四摩尔三氟乙酸。

用热塑性弹性体盖垫盖住 PCR 板，并将 PCR 板放入特殊的夹紧装置中。通过将夹紧装置倒置 10 次来混合溶液。离心 PCR 板并将其固定在夹紧装置中后，将固定的夹紧装置放入预热的沙浴中，并在 121 摄氏度下孵育 90 分钟。

使用 12 通道 200 微升移液器，加入 3.2% 氨溶液，将 pH 值调节至约 8。用热塑性弹性体盖垫盖住 PCR 板，并使用夹紧装置手动摇晃。最后一项任务是通过高通量-1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮或 HTPMP 方法分析碳水化合物指纹图谱。

要开始此过程，请使用 12 通道 50 微升移液器将 25 微升中和的水解物转移到新的 PCR 板中。加入 75 微升衍生化试剂混合物，并用热塑性弹性体盖垫盖板。将 PCR 板置于 70 摄氏度的 PCR 循环仪中 100 分钟，然后冷却至 20 摄氏度。

将 20 微升等分试样转移到新的微量滴定板中，然后使用 12 通道 200 微升移液器向每行添加 130 微升 19.23 毫摩尔乙酸。通过吸液和分液直接混合至少 6 次，并将所有液体转移到带有微量滴度收集板的 0.2 微米滤板中。将板以 1， 000 x g 离心 5 分钟，取下滤板，并用硅胶盖垫密封微量滴定收集板。

将微量滴定板放入 UHPLC-UV-ESI-MS 中，用于测定碳水化合物指纹图谱。下表显示了使用该筛选平台成功鉴定的三种典型新型菌株的结果。表格的左侧部分显示了关于粘度形成、聚合物生产和总水解葡萄糖当量的自动筛选模块的结果，这些结果被用作详细碳水化合物指纹图谱分析的评估参数。

基于校准糖以及未知糖、二聚体和取代基的碳水化合物指纹图谱在表格的右侧给出。通过使用这些信息，可以计算单体组成并与已知的聚合物结构进行比较。此外，还可以对感兴趣的单体组合物和稀有碳水化合物进行靶向筛选。

一旦掌握，这项技术可以在短短 5 小时内完成 386 种菌株。按照此程序，可以包括其他分析，如已经存在的丙酮酸或乙酸盐或磷酸盐的进一步分析，以回答胞外多糖声明的其他问题。开发后，这项技术以其高灵敏度为我们在基因工程微生物胞外多糖生产者领域的研究铺平了道路，以探索改变的胞外多糖生物合成途径对驻留化学结构的影响。

看完这个视频后，你应该对如何以非常快速和可靠的方式鉴定新型胞外多糖生产者有一个很好的了解。