Name: 再加上高灵敏度指纹碳水化合物自动分析模块化高通量筛选胞外多糖平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学习模块化高通量筛选平台，快速鉴定微生物胞外多糖产生菌并分析其碳水化合物指纹图谱。该方法结合自动化培养、过滤和凝胶过滤技术，显著加速多糖研究与新菌株发现。

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我们衷心感谢 Thomas Howe 和 Jörg Carsten 在液体处理系统的编程与技术支持方面提供的帮助。

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

采用苯酚-硫酸法检测多糖：不同单糖在此方法中表现出不同的吸收峰及摩尔消光系数9。这导致含有多种糖类且比例各异的多糖聚合物也呈现不同的吸收峰。16种市售多糖聚合物各自的吸收峰波长见表5。这些聚合物被溶解于ddH2O中（1 g/L），在150 rpm条件下搅拌过夜，随后采用苯酚-硫酸法进行测定。其中，结冷胶在470 nm处显示出最低的吸收峰，而硬葡聚糖和透明质酸的吸收峰最高，为484 nm。基于上述结果，本筛选平台选择480 nm作为检测波长。各聚合物的相对吸光度以1 g/L葡萄糖所得吸光度（设为100%）为基准进行计算。最低的相对吸光度值为硬葡聚糖和琥珀酰聚糖，均为92%。此结果符合预期，因为硬葡聚糖仅含葡萄糖，而琥珀酰聚糖中葡萄糖与半乳糖的比例为7:1。这两种市售聚合物具有不同的干燥失重和灰分含量，因此未能达到理论值约110%。木聚糖表现出最高的相对吸光度，达311%。其原因是木糖以呋喃糖形式为主，具有较高的摩尔消光系数。在葡萄糖浓度为0.1 g/L时达到定量限，检测限则出现在浓度&#60;0.05 g/L时。然而，在筛选中对产多糖阳性菌株的检测限高于0.7 g/L，因此该方法表现出良好的检测性能。为了获得可靠结果，通过葡萄糖检测试剂盒测定凝胶过滤后残留的葡萄糖含量，并从苯酚-硫酸法测得的数值中扣除该值。
葡萄糖测定自动稀释：研究了培养后葡萄糖测定（稀释1:100）的性能。具体操作为，将10 µl上清液转移至深孔板中的990 µl ddH2O中，并通过反复吸取和排出180 µl溶液十次进行混匀。第二个关键步骤是从凝胶过滤后的葡萄糖检测试剂中准确移取仅5 µl等分试样进行1:10稀释。为实现该稀释，首先使用50 µl吸头转移25 µl ddH2O，随后同时吸取20 µl ddH2O和5 µl凝胶过滤液。此操作可确保更有效地从吸头中排出5 µl等分试样。两个稀释步骤均通过多种葡萄糖标准品在葡萄糖检测试剂中进行了验证。两种代表性浓度的结果见表6。培养后葡萄糖含量测定的1:100稀释对两个标准品均表现出高精密度，变异系数CV &#60;1.2%。同时，较高浓度标准品的准确度误差达11.6%。然而，由于葡萄糖测定仅用于反映培养后的残余葡萄糖含量，对聚合物检测无显著影响，因此该误差可忽略不计。凝胶过滤后残余葡萄糖的1:10稀释结果非常可靠，变异系数CV &#60;1.4%，准确度误差 &#60;2.1%。
蒸发因素的考虑：从第一步到第一次葡萄糖检测需要3.5小时。为了确定该时间段是否对未加盖的MTP储存产生影响，将50 µl葡萄糖检测校准标准品分别在加盖与不加盖的条件下于机器人样品架中存放3.5小时。在校准范围（45至4.5 mg/L）内，样品浓度几乎未增加。由蒸发引起的浓度升高低于2.1%，仅在两个最低浓度（1.8和0.9 mg/L）时升高达到12.4%（表7）。
凝胶过滤：大量未代谢的葡萄糖会干扰从水解聚合物中对葡萄糖的定量检测。因此，在培养后需要进行凝胶过滤步骤以去除残留的葡萄糖。此外，凝胶过滤还可将含有聚合物的上清液中的盐类及除葡萄糖以外的单糖类碳水化合物进行纯化，从而在单体分析中最小化分析背景。在凝胶过滤步骤中，将35 µl滤液置于孔的中心位置。为了验证自动化系统中凝胶过滤的稳健性，对8个浓度范围从0.045至9 g/L的葡萄糖校准标准品进行了过滤（n = 8）。每个浓度的葡萄糖含量均比初始值降低了95%以上（表8）。因此，凝胶过滤在不同浓度的葡萄糖条件下均表现出非常好的效果。此外，还通过葡萄糖检测试剂盒测定凝胶过滤后残留的葡萄糖含量，并将其从苯酚-硫酸法测定结果中扣除，以获得水解聚合物中正确的葡萄糖当量含量。
丙酮酸检测：首先，研究了水解步骤中中和并稀释（1:10）的三氟乙酸（TFA）基质是否会影响酶促反应。因此，该完整检测方法分别在有基质和无基质条件下各进行了一次，结果均显示出可靠的检测效果。最终，成功测定了16种市售聚合物中的丙酮酸含量，结果如图3所示。众所周知，在这16种聚合物中，只有琥珀酰葡聚糖和黄原胶天然含有丙酮酸。通过本研究的丙酮酸检测方法，这两种聚合物均被准确识别。此外，在硬葡聚糖、文莱胶和木聚糖中也检测到显著量的丙酮酸。总体而言，该方法的能力得到了验证，丙酮酸检测表现出高性能，证明其可在水解后有效检测多种聚合物中的丙酮酸。
碳水化合物指纹图谱：在完成自动化筛选中的所有分析模块后，根据以下标准选择潜在的EPS生产菌株进行碳水化合物指纹图谱分析：1）离心后和/或过滤后观察到黏性现象；2）过滤前后均出现沉淀，观察到纤维状或片状物视为阳性；3）苯酚-硫酸法测定的葡萄糖当量值。数值 &#62;700 mg/L 被判定为阳性，300 至 700 mg/L 之间的值被判定为疑似 EPS 产生菌。当两项或三项标准被评定为阳性时，菌株将被选中进行进一步的碳水化合物指纹图谱分析。这些标准可根据 EPS 筛选的具体研究目的进行调整。例如 低粘度胞外多糖（EPS）。本研究旨在筛选高效的EPS生产菌株。在筛选仅产生少量EPS的菌株时，应降低以葡萄糖当量表示的评估阈值。
技术优势与未来应用：本方案的一个显著特点是其步骤和各个分析模块的模块化设计。这些步骤和模块可以以不同方式组合，根据具体需求进行调整，并且能够轻松引入新的模块。此外，各分析模块也可单独使用，例如，水解模块与高通量PMP衍生化模块联用，可在96孔板体系中对不同聚合物溶液（1 g/L）进行单体组成分析。对于无法获得液体处理系统的实验室，整个筛选过程可完全手动操作，且无需更改移液方案。然而，使用液体处理系统可将通量提高至每天最多768个菌株（手动筛选时为192个菌株）。本文所述方案适用于多种属微生物的筛选，因而可在一个流程中对大规模菌种库进行筛选，以发现新的胞外多糖（EPS）生产菌株并分析其碳水化合物指纹图谱（图4）。此外，通过详细的单糖分析，还可针对含有稀有糖类（如岩藻糖、糖醛酸或甚至未知糖类）的多糖进行靶向筛选。同时，也可检测特定比例的多种糖类组合，从而简便地鉴定已知EPS的结构类似物或新型EPS。

微生物胞外多糖（EPS）是一类结构高度多样的聚合物，具有多种生物学功能。它们通常由复杂的重复单元构成，这些重复单元在单体类型（糖、糖衍生物、糖酸）、单体之间的连接方式及其取代基方面各不相同。微生物多糖的结构多样性赋予了这类分子不同的理化特性，使其可应用于食品1、化妆品2,3、建筑化学4或水处理5等多个领域。为了进一步拓展这些生物来源且可持续的聚合物的应用范围，发现新的天然微生物多糖以及构建结构改造的多糖变体是极具前景的研究方向。无论采用哪种策略，都需要一种快速筛选方法，以高效检测大量微生物菌株的多糖生成能力，并分析其产物。因此，我们近期开发了一种基于96孔板的高通量筛选平台，可用于分析天然分离菌株或基因工程改造菌株所产生的微生物多糖，并可鉴定其单体组成6。
利用该平台对约500株天然分离株进行第一轮初筛，仅发现约10%至20%的分离菌株能够产生胞外多糖（EPS）（数据未显示）。这意味着在所采用的实验条件下，80%至90%的分析菌株不产生EPS，因此无需进一步分析其详细的碳水化合物指纹图谱。由于单体组成的高度精密鉴定过程耗时较长，尤其是数据分析部分，若能采用一种快速的初筛方法来鉴定出EPS阳性菌株，将显著提高整体效率。此外，还可减少超高效液相色谱-紫外-电喷雾电离质谱（UHPLC-UV-ESI-MS）所需的试剂、耗材和检测时间。同时，尽管该方法的多个分析模块在一方面保证了高度的可靠性，但在另一方面也使得同时手动处理两块以上的96孔板变得复杂，从而限制了该方法潜力的充分发挥。基于上述原因，我们决定开发一种自动化筛选平台。为此，我们将现有的碳水化合物指纹图谱技术的模块化格式，与一种基于吸光度测定的全自动快速总糖含量检测方法相结合。
苯酚-硫酸法仍是快速测定细菌和植物多糖总碳水化合物含量的首选方法7,8。该方法最初由 Dubois et al.9 描述，并已针对不同应用和样品量进行了优化，甚至可适用于96孔板的小规模检测10,11。苯酚-硫酸法通过一个数值来测定样品中总的碳水化合物含量，该数值综合了样品中所有单糖、寡糖和多糖形式的碳水化合物。
考虑到这些因素，选择合适的培养基对于应用该方法至关重要。应严格避免使用含有寡聚或多聚碳水化合物化合物（如酵母提取物）的复杂培养基，因为它们可能导致聚合物含量发生改变。此外，菌株培养过程中需使用大量糖类作为碳源。培养过程中残留的高水平碳水化合物可能会对胞外多糖（EPS）含量的测定产生不利干扰。
因此，建议使用明确且纯净的糖类。在本实验中，我们采用葡萄糖进行细胞培养。培养后剩余的葡萄糖通过凝胶过滤法去除，并通过葡萄糖检测试剂盒进行定量。最终，多糖的葡萄糖当量通过从苯酚-硫酸法测得的总糖含量中减去凝胶过滤后剩余的葡萄糖量来计算。凝胶过滤法与葡萄糖检测联合苯酚-硫酸法可确保结果可靠，并有望成为我们首个完全自动化的检测系统。
在自动筛选平台中新增了两个分析模块，以增加EPS检测系统的信息量：沉淀现象的检测和黏度增加的观察。
多种不同的EPS — 例如 琥珀酰甘露聚糖、黄原胶和结肠酸12 据报道，在糖基的C4和C6位点上被修饰了非碳水化合物性质的丙酮酸缩酮。这些丙酮酸缩酮（与琥珀酸单酯和糖醛酸类似）可通过二价阳离子桥相互作用，赋予聚合物多阴离子特性，从而影响其物理性质。13为了鉴定这些特定的聚合物，建立了丙酮酸测定作为另一个附加的分析模块。这增加了关于多糖取代基及其潜在宏观特性的信息。
整合所有模块后，能够识别不同的胞外多糖（EPS），并快速高效地确定EPS生产菌株。通过该方法，筛选平台可分为两个主要部分（图1）。在自动化筛选（第一部分）中，整个工作流程完全自动化（表1），以快速预筛出产生EPS的菌株。碳水化合物指纹图谱分析（第二部分）则对预筛菌株所产生的EPS的单体组成进行定量测定。为此，数据处理步骤被最小化，以优化对大规模菌株库的筛选效率。该平台可在单次自动化筛选运行中分析384株菌，每天进行两次运行，即可实现每天分析768株菌。此外，碳水化合物指纹图谱分析还能提供所有已鉴定EPS更为详尽的整体信息，从而实现对与已知EPS化学结构仅有微小差异或完全新型的EPS变体进行定向分析与鉴定。

<table><tbody><tr><td>96 孔深孔板 2.0 ml (DWP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>主培养（CP 1-1 至 1-4）、凝胶过滤平衡板（CP 1-6、1-7、2-6 和 2-7）、葡萄糖测定 1:100 稀释（CP 4-1 至 4-4），含 990&amp;nbsp;&amp;micro;l ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>透气封口膜</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S</td><td>预培养和主培养 DWP 的孵育用封口膜</td></tr><tr><td>铝箔封口膜</td><td>Axygen</td><td>PCR-AS-200</td><td>用于甘油保存板在 -80 &amp;deg;C 储存的封口膜</td></tr><tr><td>MCA96 嵌套式一次性吸头 200 &amp;micro;l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>工作台位置（WTP 2-1 至 2-4）</td></tr><tr><td>A/B 玻璃滤膜板 1&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>存放于收集板（CP 2-1 至 2-4）</td></tr><tr><td>96 孔 V 型底微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>用于过滤板的收集板（CP 2-1 至 2-4）</td></tr><tr><td>96 孔 G-25 离心柱</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-5612</td><td>存放于洗涤深孔板（CP 1-6、1-7、2-6 和 2-7）</td></tr><tr><td>96 孔 V 型底微孔板</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>用于凝胶过滤板的收集板（CP 3-1 至 3-4）</td></tr><tr><td>嵌套式一次性吸头 SBS 50 &amp;micro;l</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>转盘位置（CP 4-6、4-7 和 5-1 至 5-6）</td></tr><tr><td>250 ml 储液槽</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>水（WTP 1-1）、葡萄糖测定试剂混合液（WPT 1-2）、pH 5.6 醋酸铵缓冲液（CP 5-7）</td></tr><tr><td>96 孔 F 型底微孔板（MTP）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>沉淀 1（CP 6-1 至 6-4）、pH 值测定（CP 7-1 至 7-4）、沉淀 2（CP 8-1 至 8-4）、苯酚-硫酸法（CP 8-5 至 8-8）、葡萄糖测定（CP 9-1 至 9-9）、空白板（WTP 3-1、3-2）</td></tr><tr><td>96 孔硅胶盖垫&amp;nbsp;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>MTP 板的覆盖垫</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l 移液吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>用于手动操作</td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;l 移液吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>用于手动操作</td></tr><tr><td>96 孔 PCR 微孔板&amp;nbsp;</td><td>Brand</td><td>781350</td><td>水解、PMP 衍生化</td></tr><tr><td>TPE（热塑性弹性体）盖垫&amp;nbsp;</td><td>Brand</td><td>781405</td><td>水解、PMP 衍生化</td></tr><tr><td>0.2&amp;nbsp;&amp;micro;m Supor 滤膜板</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>用于 UHPLC-ESI-MS 分析样品的过滤，配合 MTP 收集板使用</td></tr><tr><td>LHS 吸头 5-300&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Brand</td><td>732150</td><td>Brand LHS 系统</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>葡萄糖测定</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>葡萄糖测定、丙酮酸测定</td></tr><tr><td>DA-64（&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(羧甲基氨基甲酰基)-4.4'-双(二甲氨基)-二苯胺钠盐）</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>丙酮酸测定</td></tr><tr><td>丙酮酸氧化酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>丙酮酸测定</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Carl-Roth</td><td>P749.3</td><td>丙酮酸和葡萄糖测定</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Carl-Roth</td><td>3904.3</td><td>丙酮酸和葡萄糖测定</td></tr><tr><td>硫胺素焦磷酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>丙酮酸测定</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>丙酮酸测定</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>沉淀</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>苯酚-硫酸法</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>苯酚-硫酸法</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>水解</td></tr><tr><td>氨水溶液</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>水解、PMP 衍生化</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>水解、PMP 衍生化</td></tr><tr><td>酚红&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>水解、PMP 衍生化</td></tr><tr><td>1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>PMP 衍生化</td></tr><tr><td>LC-MS 级甲醇</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>PMP 衍生化</td></tr><tr><td>LC-MS 级乙腈</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>PMP 衍生化</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>PMP 衍生化</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>PMP 衍生化</td></tr><tr><td>甲基红</td><td>Alfa Aesar</td><td>36667</td><td>pH 值测定</td></tr><tr><td>自动化液体处理系统&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>工作台设置见 &lt;strong&gt;图 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>液体处理工作站 LHS</td><td>Brand</td><td>709400</td><td>工作台设置见 &lt;strong&gt;图 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>吸头适配器</td><td>Brand</td><td>709434</td><td>工作台设置见 &lt;strong&gt;图 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Liquid Ends MC 20-300&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Brand</td><td>709416</td><td>工作台设置见 &lt;strong&gt;图 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>60 mm 适配器</td><td>Brand</td><td>709430</td><td>工作台设置见 &lt;strong&gt;图 2&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

自动化模块化高通量胞外多糖筛选平台结合高灵敏度碳水化合物指纹图谱分析

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

许多微生物能够产生并分泌胞外多糖（EPS），这些物质在医学领域、食品应用或替代石油基化学品方面具有重要意义。本文描述了一种可在液体处理系统上自动化的分析平台，能够快速、可靠地分析微生物所产生的EPS类型及其产量。该平台使研究人员能够在高通量（HT）条件下，于一天之内识别新型天然微生物胞外多糖生产者，并分析相应聚合物的碳水化合物指纹图谱。利用该平台，可对菌株保藏库以及通过工程手段获得的菌株变异文库进行筛选。该平台采用模块化设计，可将实验流程分为两个主要部分。第一部分为自动化筛选系统，整合了多种多糖检测模块：通过离心步骤实现黏度形成的半定量分析、通过乙醇沉淀法分析聚合物形成情况，以及通过苯酚-硫酸法测定总碳水化合物含量。该系统单次运行可筛选多达384个菌株。第二部分则针对第一部分筛选出的阳性EPS生产菌株，进行详细的单糖组成分析，包含两个关键模块：利用超高效液相色谱串联紫外检测及电喷雾电离离子阱质谱（UHPLC-UV-ESI-MS）分析单体完整组成，以及通过与显色反应偶联的酶法氧化测定丙酮酸（作为聚合物取代基，即丙酮酸缩酮的存在）含量。该筛选平台的所有分析模块均可灵活组合，并可根据具体需求进行调整。此外，所有模块既可手动操作，也可由液体处理系统完成。因此，该平台具备高度灵活性，可用于识别多种类型的胞外多糖。

我们提出一种自动化、模块化的高通量方法，用于小规模微生物胞外多糖的鉴定与表征。该方法结合快速初筛以分析分泌多糖的总量，以及详细的碳水化合物指纹图谱分析，从而实现对新分离细菌菌株或完整菌株库的快速筛选。

许多微生物能够产生并分泌胞外多糖（EPS），这些物质在医学领域、食品工业等方面具有重要意义。

本方法的总体目标是快速、可靠地筛选微生物胞外多糖产生菌，并鉴定其碳水化合物指纹图谱。这是充分利用尚未开发的胞外多糖多样性所必需的关键步骤。我们的方法有助于加快微生物胞外多糖领域的聚合物研究进程。该技术能够快速鉴定出具有不同特性的新型多糖变体，以满足特定应用需求。此方法的主要优势在于将多种胞外多糖检测系统结合到一个模块化且完全自动化的筛选体系中，从而实现了极高的速度和可靠性。该技术也可在无自动化平台的实验室中手动操作，因此其使用非常灵活，可针对不同的筛选需求进行调整。这种胞外多糖（EPS）筛选平台采用模块化设计，可将实验流程分为两个主要部分：自动化筛选和碳水化合物指纹图谱分析。第一步是培养待筛选的菌株，并通过离心去除菌体细胞。将菌株在96孔板中以葡萄糖作为碳源进行培养，孔板覆盖透气密封膜，并在30摄氏度、1,000 RPM条件下置于微孔板摇床上振荡培养。在筛选当天，按照方案文本所述准备机器人工作台和储存转盘。从孔板上移除透气密封膜，并将主培养物分配至转盘位置1-1至1-4。启动自动机器人程序。培养结束后去除细胞时，将主培养深孔板从转盘转移到离心机中，在 4,300 × g 和 20 摄氏度条件下离心 30 分钟。过滤前沉淀步骤中，将微孔板以及含 pH 指示剂的微孔板从转盘转移至工作台。同时将过滤板和收集板转移至工作台指定位置，其中过滤板可确保完全去除所有细菌细胞。离心后，取180微升主培养上清液加入过滤板中。从主培养上清液中吸取150微升，其中50微升加入微量滴定板中用于过滤前的沉淀处理，另100微升加入pH指示剂板中。通过2-丙醇沉淀上清液以评估EPS的产生。使用12.5毫升多通道移液器手动向每个孔中加入150微升2-丙醇。将微量滴定板在室温下以900 RPM振荡10分钟后，目视观察表明EPS产生的纤维或片状结构。将主培养板放回转盘后，检查发酵液，经离心后其沉淀量应减少。黏度增加是产生胞外多糖（EPS）的另一迹象。第二项任务是通过96孔过滤法确保从黏稠的发酵液中完全去除细胞。在 3,000 × g 和 20 摄氏度条件下，将过滤板离心 10 分钟。然后将板放回其转盘上的初始位置，并按照方案文本所述进行凝胶过滤的平衡。接下来，将 35 微升滤液移液至已平衡的凝胶过滤板中央，将 50 微升滤液移液至用于沉淀的微量滴定板中。将凝胶过滤板转移至离心机，并将工作台上的所有其他板移回旋转架中的原始位置。待所有板均存放回旋转架后，注意观察滤板中残留物所提示的高黏度上清液。滤液缺失可能导致后续分析模块出现假阴性结果。自动化筛选中的第三项任务是通过96孔凝胶过滤法从培养基中去除残留的单糖。将凝胶过滤板在1,000 × g离心力、20摄氏度条件下离心两分钟。通过机器人操作装置准备工作站，以处理凝胶滤过液。为了检测凝胶过滤后残留的葡萄糖，使用 50 微升吸头将 25 微升双蒸水转移至新的微孔板中。吸取 20 微升双蒸水、5 微升空气和 5 微升凝胶滤过液，并将其加入同一微孔板中。使用 200 微升吸头从工作台位置 1-2 吸取 50 微升葡萄糖检测试剂混合液，以开始第一项检测。将微量滴定板放入孵育箱中。孵育30分钟后，将板从孵育箱转移至微量滴定读板仪，记录在418和480纳米处的吸光度。为采用苯酚-硫酸法测定总碳水化合物含量，用移液器将20 µL凝胶滤液加入微量滴定板中。手动将板从转盘中取出，并放入液体处理工作站中。包括含有不同葡萄糖浓度的校准板，每种浓度设三个复孔，每孔20微升。在位置1放置一个废液容器，在位置2放置一个300微升吸头盒，在位置3放置一个250毫升试剂槽，内含110毫升新配制的苯酚-硫酸溶液。使用带有300微升吸头的8通道移液器，将180微升苯酚-硫酸溶液加入每块板的每一行中。用盖子盖好所有微孔板，并在室温下以900 RPM振荡5分钟进行混匀。在80摄氏度的烘箱中孵育35分钟，以进行显色反应。在通风橱中冷却平板后，在 480 纳米处测定吸光度。若自动筛选获得的菌株满足以下三项标准中的至少两项，则被判定为 EPS 阳性：黏度对照、聚合物检测以及计算的葡萄糖当量。葡萄糖当量通过此方程计算。筛选平台的碳水化合物指纹图谱包含最后三个手动操作的任务。任务二中阳性结果的剩余滤液为任务五中的凝胶滤液提供了基础。任务六是对凝胶滤过液进行96孔微量水解。为此，首先使用12通道50微升移液器将20微升凝胶滤过液转移至新的PCR板中。然后使用多通道移液器向每个孔中加入20微升4摩尔的三氟乙酸。用热塑性弹性体封板膜覆盖PCR板，并将PCR板放入专用夹紧装置中。通过翻转夹紧装置10次来混匀溶液。离心PCR板后，将其固定在夹紧装置中，再将固定好的夹紧装置置于预热的沙浴中，在121摄氏度下孵育90分钟。使用12通道200微升移液器，加入3.2%氨溶液以将pH值调节至约8。用热塑性弹性体封板膜覆盖PCR板，并使用夹紧装置手动振荡。最后一步是通过高通量-1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（HTPMP）方法分析碳水化合物指纹。开始此操作时，使用12通道50微升移液器将25微升中和后的水解产物转移至新的PCR板中。加入75微升衍生化试剂混合液，并用热塑性弹性体密封垫密封PCR板。将PCR板置于PCR仪中，在70摄氏度下反应100分钟，随后冷却至20摄氏度。取20微升等分试样转移至新的微量滴定板中，然后使用12通道200微升移液器向每孔加入130微升19.23毫摩尔/升的乙酸。通过反复吸液和排液至少六次进行直接混匀，并将全部液体转移至带有微量滴定收集板的0.2微米滤膜板。以1,000 × g离心5分钟，取下滤膜板，用硅胶盖板密封微量滴定收集板。将微量滴定板放入超高效液相色谱-紫外-电喷雾电离-质谱仪（UHPLC-UV-ESI-MS）中，用于测定碳水化合物指纹图谱。本表格展示了利用该筛选平台成功鉴定的三个代表性新菌株的结果。表格左侧显示了自动化筛选模块在粘度形成、聚合物产生以及总水解葡萄糖当量方面的结果，这些参数被用作碳水化合物指纹图谱详细分析的评估指标。基于校准的糖类以及未知糖类、二聚体和取代基的碳水化合物指纹图谱显示在表格的右侧部分。利用该信息，可计算单体组成，并与已知的聚合物结构进行比较。此外，还可针对具有研究价值的单体组成和稀有碳水化合物进行靶向筛选。一旦掌握，该技术可在短短五小时内完成386个菌株的检测。在本实验流程基础上，还可加入已有的丙酮酸检测或其他乙酸盐、磷酸盐检测，以进一步探究胞外多糖表达的相关问题。该技术因其高灵敏度，在建立后为我们在基因工程改造的微生物胞外多糖生产领域的研究铺平了道路，使我们能够探索胞外多糖生物合成途径的改变对其化学结构的影响。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何快速且可靠地鉴定新型胞外多糖产生菌的方法。

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