软件辅助跟踪动态细胞突变中蛋白质浓度的图形用户界面
July 11th, 2017
我们提供了一个软件解决方案，用于半自动跟踪动态细胞突起长度的相对蛋白质浓度。
该图像分析软件的总体目标是沿整个丝状足长平行分析突起动力学和相对蛋白质浓度。这种方法可以真正帮助我们理解细胞生物学中的关键问题，尤其是参与丝状伪足扩展和回缩的单个蛋白质。该技术的主要优点是提供的自适应形状跟踪算法允许对突起动力学和空间分辨蛋白质定位进行定量评估。
首先，按照文本方案中的详细说明，在补充培养基中培养神经元、HeLa 或 COS 细胞。一旦达到 40% 汇合度，按照制造商的说明使用所选构建体对细胞进行横剖。将跨流细胞保存在 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中 15 至 18 小时。
孵育后，用含有 20 毫摩尔 HEPES 的 37 摄氏度预热培养基填充细胞培养室至 90%，以减少图像采集过程中蒸发引起的 pH 值和渗透压变化。要密封盖子，请在盖子内侧涂上一层薄薄的真空润滑脂，然后将其轻轻按压在包含横切细胞的培养室上。图像分析最重要的部分可能是图像质量。
我们必须注意的一件事是信噪比，它必须大于四，我们可以确保，通过调整相机的曝光时间以及激光强度和力，跟踪帧速率必须超过一赫兹。使用具有 60 倍或 100 倍物镜且无像素弯曲的显微镜采集图像。使用不小于 1 赫兹的采集速率来跟踪丝状足动力学。
为了最大限度地减少失焦伪影，请在靠近基底膜的地方对丝状足部进行成像。为确保跟踪流畅，请调整摄像机的曝光时间和激光强度，使信噪比大于 4。完成后，开始图像采集。
按照文本协议中的说明，在图像预处理之后，通过下载包含图像分析所需的所有文件的压缩文件夹来加载图像。将文件解压缩并复制到 work 文件夹中。安装后，通过打开名为 filopodiaAnalysisM3.fig 的文件来启动图形用户界面。
在图形用户界面或 GUI 中加载单个蛋白质保存的堆栈 TIFF 文件。使用按钮 1B 表示蛋白质 A，1C 表示蛋白质 B，可选地使用按钮 1D 表示蛋白质 C.通过单击 1A 从蛋白质通道创建细胞的叠加图像。然后，单击 2A 以分配第一帧，单击 2B 以分配最后一帧进行分析。
或者，使用 2H 按钮裁剪感兴趣的区域或 ROI，其中包含感兴趣的丝状体。使用 2I 按钮旋转图像，或使用徒手绘图工具 2J 删除不需要的区域。移动滑块 2C 进行质量控制，并检查丝状体是否在整个影片中保持清晰可见。
要生成跟踪，首先，单击 GUI 窗口 1 中的 3A 按钮，打开 GUI 窗口 2。单击 GUI 窗口 2 中的 4 按钮，以生成在 GUI 窗口 1 中生成的叠加单元体的质量，然后单击 1A 后。我们建议花一些时间优化实验数据集的参数，例如分段数、扫描宽度和扫描半径。
移动窗口 2 中的滑块，以检查丝状足尖首次出现的位置。然后，单击按钮 5，光标将出现。使用光标选择测量丝状足尖距离的底座。
然后是丝状伪足的尖端在它第一次出现的框架中。接下来，使用 6C 选择丝状伪足将弯曲的阈值长度。然后，在方框 6A 中指定用于近似丝状伪足形状的节段数。
指定扫描宽度（用作水平扫描仪）以将节点放置在 6B 中。在框 6D 中指定扫描半径，使用比观察到的帧间尖端位移大约 50% 的值。然后，在框 6E 中指定弯曲角度。
在 GUI 窗口 2 中选中该框的 history trace（历史跟踪），以保存整个跟踪协议以供将来参考，然后单击 track and analyze（跟踪和分析）按钮开始跟踪。对于空间时间分析，请选择 8B 表示的框，然后选择感兴趣的蛋白质通道。点击 8A，使用先前生成的曲线沿丝足长度启动蛋白质示踪。
对于比率式蛋白质分析，请选中 9B 或 9C 框，然后单击按钮 9A 以获取时空比率图。要执行丝状足尖分析，请选中框 8F 并使用 8G 和 8H 指定从底部开始的针尖长度和阈值长度。单击按钮，将数据保存到名为 dynamics.xlsx 的 excel 文件中。
然后，单击分析蛋白质强度以生成丝状足尖的蛋白质强度痕迹并保存用于比率分析。使用 9D 或 9E 单击要分析的所需比率。最后，单击比较按钮 9A 生成比率数据。
用红色的丝状肌动蛋白标记物和绿色的胞质参考对 COS 细胞进行剖切的分析揭示了富含肌动蛋白的丝状足突起。时间序列显示富含肌动蛋白的丝足突起迅速伸展和缩回。使用图像分析软件，追踪单个丝状伪足。
图像分析软件可靠地跟踪丝足延伸，除了单个丝状伪足的生长和回缩率外，化学图还描述了与胞质参考标准化的肌动蛋白浓度。如果使用得当，该技术可以定量分析沿丝状伪足的突起动力学和空间分辨蛋白质浓度。尝试该过程时，重要的是要记住采集速度并保持信噪比大于 4，同时不要使单个图像饱和。
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概述
本文介绍了一种用于沿动态细胞突起半自动跟踪蛋白质浓度的软件解决方案。该软件能够并行分析突起动力学和蛋白质定位，从而增强我们对细胞生物学的理解。
研究的关键组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 图像分析
- 蛋白质动力学
背景
- 理解突起动力学在细胞生物学中至关重要。
- 细丝突起在细胞延伸和收缩中起着重要作用。
- 定量评估蛋白质定位对研究细胞过程至关重要。
- 自适应形状跟踪算法可以提高分析准确性。
研究目的
- 开发一种分析细丝突起上蛋白质浓度的方法。
- 增强对突起动力学相关蛋白质的理解。
- 为研究细胞行为的研究人员提供工具。
使用的方法
- 在补充培养基中培养神经元、HeLa或COS细胞。
- 使用转染试剂将构建体转染到细胞中。
- 在37°C和5% CO2下孵育转染细胞15-18小时。
- 利用该软件跟踪蛋白质浓度和突起动力学。
主要结果
- 该软件允许对蛋白质定位进行定量评估。
- 它提供了细胞突起动力学的见解。
- 自适应跟踪提高了测量的准确性。
- 该方法可以应用于各种细胞类型。
结论
- 开发的软件是研究蛋白质动力学的有价值工具。
- 它有助于理解细胞突起和收缩的机制。
- 该方法可以促进未来的细胞生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cell migration and signaling. This semi-automated image analysis workflow enables spatially resolved, reproducible measurement of protein localization and protrusion dynamics, supporting predictive confidence in target validation. Integrating such adaptive tracking tools strengthens portfolio triage by providing robust, quantitative outputs for mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of protein function during filopodial extension and retraction.
- Supports mechanistic de-risking by mapping spatial-temporal protein localization in live cells.
- Facilitates functional target validation through reproducible, high-content imaging data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of modulators affecting protrusion dynamics.
- Standardizes assay conditions with defined signal-to-noise and acquisition thresholds.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for comparative compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein localization data with disease-relevant cell migration models when applicable.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of migration-related targets.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in cell motility and signaling programs.
Pipeline & Workflow Integration
This software-assisted tracking method fits within the early discovery to lead identification continuum, bridging hypothesis-driven mechanistic studies and quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying protein dynamics in live-cell protrusions.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative readouts for downstream screening workflows.
- Analytics: Generates spatial-temporal protein concentration profiles and protrusion kinetics for robust comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant migration models when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable analytical capability for diverse protein localization and cell motility studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms related to cell migration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative image analysis.
- Needs high-quality microscopy infrastructure with defined signal-to-noise and frame rate capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to various cell types exhibiting filopodia, with parameter optimization per system.
- Dependent on maintaining image quality and avoiding saturation for reliable outputs.
