用于软件辅助追踪动态细胞突起中蛋白质浓度的图形用户界面

该图像分析软件的总体目标是对整个丝状伪足长度上的凸起动态和相对蛋白质浓度进行并行分析。该方法有助于我们深入理解细胞生物学中的关键问题，特别是参与丝状伪足延伸与回缩的各个蛋白质的作用机制。该技术的主要优势在于其提供的自适应形态追踪算法，能够对凸起动态进行定量评估，并实现空间分辨的蛋白质定位分析。

首先，按照文本方案中的说明，在添加了补充物的培养基中培养神经元、HeLa 或 COS 细胞。当细胞融合度达到 40% 时，使用转染试剂根据制造商说明书将目标质粒转染至细胞中。将转染后的细胞置于 37 摄氏度、5% CO2 的培养箱中孵育 15 至 18 小时。

孵育后，用37摄氏度预热的培养基填充细胞培养腔至90%，培养基中应含有20毫摩尔HEPES，以减少成像过程中因蒸发引起的pH值和渗透压变化。为密封盖子，需在盖子内侧涂上一层薄薄的真空脂，然后轻轻将其压在含有转染细胞的培养腔上。图像分析中最关键的部分可能是图像质量。

我们需要关注的一个问题是信噪比，其值必须大于四。我们可以通过调整相机的曝光时间、激光强度以及确保帧率大于每秒一赫兹来满足这一条件。使用配备60倍或100倍物镜的显微镜进行成像，并且不进行像素合并。图像采集速率不得低于每秒一赫兹，以追踪丝状伪足的动力学过程。

为尽量减少离焦伪影，请对靠近基底膜的丝状伪足进行成像。为确保追踪过程平滑，调整相机曝光时间与激光强度，使信噪比大于四。完成上述设置后，开始图像采集。

按照文本方案中所述的图像预处理步骤完成后，通过下载包含所有图像分析所需文件的压缩文件夹来加载图像。解压后将文件复制到工作文件夹中。安装完成后，通过打开名为 filopodiaAnalysisM3.fig 的文件启动图形用户界面。

在图形用户界面（GUI）中加载各个蛋白质的已保存堆栈TIFF文件。使用按钮1B选择蛋白质A，按钮1C选择蛋白质B，以及可选的按钮1D选择蛋白质C。单击1A创建来自各蛋白质通道的细胞叠加图像。然后单击2A指定分析的第一帧，再单击2B指定分析的最后一帧。

可选地，使用 2H 按钮裁剪包含目标丝状伪足的感兴趣区域（ROI）。使用 2I 按钮旋转图像，或使用手绘工具 2J 删除不需要的区域。移动每个帧的滑块 2C 进行质量控制，并检查丝状伪足在整个视频中是否始终保持清晰可见。

为了生成轨迹，首先在图形用户界面一中点击 3A 按钮，以打开图形用户界面二。在图形用户界面二中点击四号按钮，以生成在点击 1A 后于图形用户界面一中叠加产生的细胞体质量。我们建议花费一定时间优化适用于您实验数据集的参数，例如片段数量、扫描宽度和扫描半径。

移动第二个窗口中的滑块，以确定丝状伪足尖端首次出现的位置。然后点击第五个按钮，光标将出现。使用光标选择测量丝状伪足尖端距离的起始基点。

在伪足首次出现的帧中，跟随其尖端进行追踪。接着，使用图6C设定伪足发生弯曲的阈值长度。然后，在6A框中指定用于近似伪足形态的线段数量。

指定扫描宽度，该参数作为水平扫描器，用于在6B中放置节点。在6D框中指定扫描半径，其数值应比观察到的帧间针尖位移大约50%。然后，在6E框中指定弯曲角度。

在第二个图形用户界面窗口中，勾选该区域的历史轨迹框，以保存完整的追踪流程供日后参考，然后点击“追踪并分析”按钮以开始追踪。进行时空分析时，选择由8B表示的区域，随后选择目标蛋白通道。点击8A，利用先前生成的轨迹，沿丝状伪足长度方向进行蛋白追踪。

对于比率型蛋白质分析，勾选复选框 9B 或 9C，然后点击按钮 9A，以获得时空比率图。要进行丝状伪足尖端分析，请勾选复选框 8F，并使用 8G 和 8H 设置从基部开始的尖端长度和阈值长度。点击按钮，将数据保存到名为 dynamics.xlsx 的 Excel 文件中。

然后，点击“分析蛋白质强度”以生成丝状伪足尖端蛋白质强度的轨迹，并保存用于比率分析。使用图9D或9E选择要分析的相应比率。最后，点击比较按钮（图9A）以生成比率数据。

用红色标记丝状肌动蛋白、绿色标记胞质参考物转染COS细胞后的分析显示，富含肌动蛋白的丝状伪足突起。时间序列显示，富含肌动蛋白的丝状伪足突起快速伸长和回缩。利用图像分析软件，对单个丝状伪足进行了追踪。

图像分析软件可可靠地追踪丝状伪足的延伸，以及单个丝状伪足的生长和回缩速率；化学图谱还可显示肌动蛋白浓度相对于胞质参考值的标准化结果。若正确使用该技术，可实现对伪足突出动态的定量分析，并在空间上解析丝状伪足中蛋白质的浓度分布。在进行实验操作时，需注意成像速度，并保持信噪比大于四，同时避免单帧图像信号饱和。