Name: 软件辅助跟踪动态细胞突变中蛋白质浓度的图形用户界面 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 了解如何使用半自动化图像分析软件追踪丝状伪足动态变化并定量分析蛋白质浓度分布。该方法适用于神经元、HeLa及COS细胞，为细胞生物学研究提供可靠的空间分辨蛋白动力学分析工具。

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作者感谢德国研究基金会（DFG）的资助（EXC-1003 至 MG）。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>在含有 4.5 g/L D-葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、丙酮酸、10% 胎牛血清和 10 单位/毫升青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养 HeLa 或 COS 细胞。在不含 L-谷氨酰胺、谷氨酸或天冬氨酸的培养基中培养神经元，并补充 0.5 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、无血清神经元补充剂和 10 单位/毫升青霉素/链霉素。</li>
	<li>当细胞融合度达到 40% 时，按照制造商说明书使用转染试剂将细胞与目标质粒共转染。将转染后的细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 15–18 小时。</li>
	<li>为减少成像过程中因蒸发引起的 pH 值和渗透压变化，在成像前将预热至 37 °C 的含 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的培养基加入细胞培养腔室至总体积的 90%。为密封盖子，先在盖子内侧涂一层薄薄的真空脂，然后轻轻将其压在含有转染细胞的培养腔室上。</li>
</ol>
2. 图像采集
注意：丝状伪足的长度范围为 2-10 µm13。丝状伪足的平均生长速度为 0.05-0.1 µm/s13,14。
<ol>
	<li>使用显微镜配备60倍或100倍物镜且不进行像素合并（此处使用转盘共聚焦显微镜）采集图像。采用高于1赫兹（Hz）的采集速率以追踪 filopodia 动态。为最大限度减少离焦伪影，应对接近基底膜的 filopodia 进行成像。即 底物表面）</li>
	<li>为确保追踪顺畅，需调整相机的曝光时间与激光强度，使信噪比（SNR）大于4。避免各单独通道出现信号饱和即 8 位图像的像素值为 255，16 位图像的像素值为 65,535，这将影响后续的图像分析。</li>
	<li>为避免串色，仅使用与显微镜激光线和滤光片兼容的荧光标签（详见参考文献） 15).</li>
</ol>
3. 图像预处理
注意：使用 ImageJ 或其他可用软件对图像进行预处理16,17。
<ol>
	<li>如果样品在移动，使用可用的软件校正横向漂移（例如 在分析前使用 ImageJ 的修复平移宏（https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ）。排除存在轴向漂移（即 z 方向移动）的影片。</li>
	<li>正确的背景（即 细胞外区域的灰度值），漂白（即 由于荧光蛋白受损导致的荧光强度持续减弱，以及可能的串色干扰（即 使用可用软件对双通道中单一荧光探针的信号进行分离（即一个荧光探针在两个通道中的信号）例如 http://imagej.net/Category:插件 和 16,17). 
	注意：软件不会改变各个通道的荧光强度。</li>
	<li>为确保后续图像分析，将对应特定蛋白通道的视频以灰度模式保存为“.tiff”堆叠文件格式，并存入工作文件夹。 
	注意：尺寸（即 所有通道的堆栈大小（尺寸、长度）必须相同。</li>
</ol>
4. 图像分析——步骤1：加载图像
注意：此处描述的软件使用 Matlab（以下简称编程软件）编写，仅可在此程序中运行。
<ol>
	<li>从以下网站下载包含图像分析所需全部文件的压缩文件夹：&#160;https://campus.uni-muenster.de/zh/einrichtungen/impb0/细胞中的纳米级作用力/软件/。解压缩并将文件复制到工作文件夹中。</li>
	<li>安装完成后，打开编程软件并运行“filopodiaAnalysisM3.fig”文件，将弹出如图所示的图形用户界面窗口#1。 图2A.</li>
	<li>使用按钮在 GUI 窗口 #1 中加载与特定目标蛋白对应的已保存的堆叠式 '.tiff' 文件 &#60;1b&#62; 用于蛋白A， &#60;1c&#62; 对于蛋白B， &#60;1d&#62; 用于蛋白C。参见 图2 和 表1 详情请见。 
	注意：GUI 窗口 #1 中显示的蛋白 A 作为最终比率分析的参考通道。</li>
	<li>通过点击创建来自蛋白质通道的细胞叠加图像 &#60;1a&#62;.</li>
	<li>点击 &#60;2a&#62; 指定第一帧 &#60;2b&#62; 用于分析的最后一个帧。</li>
	<li>可选地，使用按钮裁剪包含目标丝状伪足的感兴趣区域（ROI） &#60;2小时&#62;，使用按钮旋转图像 &#60;2i&#62;，或使用手绘工具删除不需要的区域 &#60;2j&#62;. 
	注意：为了简化图像分析，建议分离出感兴趣区域（ROI）即 裁剪、旋转、删除）以及其它预处理步骤（背景扣除、漂白校正等），使用 ImageJ 完成。</li>
	<li>移动滑块 &#60;2c&#62; 对每一帧进行质量控制，并检查在整个视频中伪足是否始终保持清晰可见。</li>
</ol>
5. 图像分析——步骤2：生成轨迹
<ol>
	<li>点击按钮 &#60;3a&#62; 在图形用户界面窗口#1中打开图形用户界面窗口#2（参见 图2B).</li>
	<li>点击按钮 &#60;4&#62; 在GUI窗口#2中生成叠加的细胞体的掩膜（在GUI窗口#1中点击后生成） &#60;1a&#62;该程序还会生成掩膜的边界，其中采用凸包算法来获取顶点坐标。</li>
	<li>点击按钮 &#60;5&#62;；此时会出现一个光标。使用光标在伪足首次出现的帧中（通过移动窗口2中的滑块来定位）先选择基部（测量伪足尖端距离的起点），然后选择伪足的尖端。 
	注意：为尽量减少数据输出中的误差，应将基点沿轴向垂直置于丝状伪足尖端正下方。将基点置于其他位置（例如 侧向偏移可能会在细胞体内引入荧光值的方向性偏差。</li>
	<li>使用阈值长度（超出该长度后丝状伪足将发生弯曲）进行选择 &#60;6c&#62;. 
	注：此长度定义为基点（使用选定）与 &#60;5&#62;）以及细胞体的边界（即 测量从丝状伪足开始生长的区域起算的距离，单位为像素。</li>
	<li>指定用于近似丝状伪足形状的线段数量 &#60;6a&#62;. 
	注意：片段的最小数量取决于丝状伪足达到的最大长度及其弯曲程度。所选片段数量不得超过基部与顶端之间像素的总数即 超过第5.4步中定义的阈值长度的片段数量）。选择超过第5.4步中设定的阈值长度的片段数量。即 基部与尖端之间像素数量）将导致对丝状伪足长度的高估。</li>
	<li>指定扫描宽度，该宽度作为水平扫描器用于放置节点，单位为 &#60;6b&#62;. 
	注意：这些节点被程序用于将连接丝状伪足基部与顶端的直线与其主体部分进行拟合即 （用于创建骨架）。作为起点，输入一个像素值，该值等于最大长度乘以一个系数 <img alt="方程" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" />.</li>
	<li>在框中指定扫描半径（以像素为单位） &#60;6d&#62;使用一个比观察到的帧间尖端位移大约50%的值。 
	注意：使用过大的扫描半径可能会在不存在真实丝状伪足尖端的帧中捕获不需要的凸包点（例如 平面外运动或信噪比过低。</li>
	<li>在方框中指定弯曲角度 &#60;6e&#62;. 
	注意：角度阈值由整个分析过程中丝状伪足弯曲的最大角度决定。设定角度阈值有助于软件在丝状伪足向细胞体方向弯曲时，排除从其侧面生长出的非目标结构的追踪。该程序对相对于垂直轴倾斜角度小于45度的丝状伪足可稳定工作。</li>
	<li>要开始跟踪，请单击 &#60;轨迹&amp;#38;Analyze&#62; 在GUI窗口#2中点击按钮。勾选GUI窗口#2中的“历史轨迹”框，以保存完整的追踪记录供日后参考。 
	注意：追踪程序完成后，每个帧中丝状伪足的长度将保存在“dynamics.xlsx”文件名为“length_vel”的工作表中，以供后续参考。同样，所有其他追踪参数均保存在“dynamics.xlsx”文件名为“parameters”的工作表中。</li>
	<li>可选地，如果在所有帧中未能自动检测到丝状伪足，请使用以下步骤进行手动校正。
	<ol>
		<li>使用窗口2中的滑块访问相应帧，并手动选择丝状伪足的尖端。 
		注意：在图形用户界面窗口#2的跟踪窗口中，未检测到凸包点的帧将用蓝色区域表示。在启动跟踪程序之前，必须勾选“历史轨迹”按钮，以便访问该帧中的节点坐标。</li>
		<li>使用基部（随后是尖端）作为参考点进行选择 &#60;6f&#62; 在 GUI 窗口 #2 中。按照步骤 5.4-5.8 所述，为该帧指定其他参数，如“扫描长度”、“精确测量时间”和“最大弯曲角度”。</li>
		<li>点击按钮 &#60;6i&#62; 保存新参数（针对该单帧）。需对蓝色区域指示的所有帧重复上述步骤。</li>
		<li>完成后，使用以下步骤重新初始化跟踪程序 &#60;7&#62;. 
		注意：如果程序在视频中突然从一个丝状伪足切换到另一个，也可使用此校正方法。作为替代方案，可考虑对包含多个丝状伪足的视频进行剪裁。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 图像分析——步骤3：时空蛋白质分析
<ol>
	<li>进行时空分析时，选择由&#60;8b&#62;表示的方框，随后选择目标蛋白通道（&#60;8c&#62; 和/或 &#60;8d&#62; 和/或 &#60;8e&#62;）。 
	注意：进行比率分析（&#60;9a&#62;、&#60;9b&#62; 和/或 &#60;9c&#62;）前必须先选择蛋白A，因为蛋白A将作为参考蛋白。</li>
	<li>单击&#60;8a&#62;，利用步骤5.9中生成的轨迹开始沿丝状伪足长度追踪蛋白。</li>
</ol>
7. 图像分析——步骤4：比率法蛋白质分析
<ol>
	<li>勾选框 &#60;9b&#62; 或 &#60;9c&#62;，然后点击按钮 &#60;9a&#62; 以获得时空比率图。 
	注意：为避免相对蛋白浓度的误读，比率图像并非以 X/Y 形式绘制，而是以 log(X/Y) 形式绘制。为便于后续使用，比率图以“.png”和“.fig”格式文件导出，原始绘图数据则保存在“dynamics.xlsx”文件中。</li>
</ol>
8. 图像分析——步骤5：丝状伪足尖端分析
<ol>
	<li>勾选复选框 &#60;8f&#62;，并使用 &#60;8g&#62; 和 &#60;8h&#62; 指定从基部起算的尖端长度和阈值长度。点击 &#60;push button&#62; 将数据保存至文件 'dynamics.xlsx'。点击 &#60;Analyze Protein Intensities&#62; 生成丝状伪足尖端的蛋白质强度轨迹，并保存用于比值分析。 
	注意：尖端长度决定用于分析的尖端像素数量。软件将返回每帧中尖端区域像素的平均强度值。阈值长度决定从基部到尖端的最小距离，当丝状伪足（丝状伪足尖端）开始生长时，该距离即被触发（程序也从此开始追踪尖端的强度值）。因此，尖端长度必须小于阈值长度。</li>
	<li>使用 &#60;9d&#62; 或 &#60;9e&#62; 选择要分析的比值。</li>
	<li>点击比较按钮 &#60;9a&#62; 生成比值数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种详细的实验方案，用于追踪丝状伪足的生长动态，并通过凸包算法分析这些动态结构中相对蛋白质浓度。利用该软件，可在单次运行中对最多3个通道进行两两比较，从而分析两个通道的相对浓度即 在整个伸展/回缩循环过程中测定蛋白质，并将图像和数据文件分别存储在不同的文件夹中。除了常规操作外，该软件还提供多个可调整参数，以便针对具体实验优化分析。这些参数调整的详细说明以及故障排除方法见方案部分及 表1.
图像分析并不局限于特定类型的显微镜，而是受限于时间序列的图像质量。鉴于其重要性，应在采集过程中针对每个通道优化图像质量。我们的实验表明，该算法对信噪比（SNR）较高的丝状伪足效果最佳 &#62;4，使用放大倍数高于40倍且无像素合并的物镜，以1 Hz频率采集。当然，这仅在荧光染料与滤光片设置兼容的情况下适用（即 无串色现象；详见第2步实验方案）。考虑到相对强度是相互比较的，该分析对单个细胞间绝对荧光信号强度的微小差异不敏感。因此，为获得有意义的数据，需设定一个明确定义的参考通道（例如 细胞质标记物）具...

肌动蛋白调控蛋白的时空控制与丝状伪足的动力学相关1,2。因此，通过时间追踪整个丝状伪足长度上空间分辨的蛋白质浓度，对于深入理解这些动态结构的起始、延伸、稳定或塌陷机制至关重要3,4。与在细胞质中进行的蛋白质分析不同——后者许多细胞形态变化发生在较大尺度上，丝状伪足是持续屈曲5和弯曲的动态微结构，因而无法采用简单的线扫描等方法进行分析。
用于追踪丝状伪足形态的不同软件解决方案均有提供 6,7,8,9同样，已开发出用于追踪细胞体内蛋白质动态变化的比率成像分析软件。 10,11为了整合丝状伪足形态的自动追踪与时空蛋白质分析，我们近期开发了一款基于凸包算法的图像分析软件 12. 这种新型分析方法，其操作方式为 通过 图形用户界面（GUI）首次结合了丝状伪足长度上的相对蛋白质浓度与生长速度，从而能够独立于这些动态结构的运动，精确测量蛋白质的时空分布 12.
该软件的设计理念（源代码可免费获取，详见下文）在于，凸包的一个顶点将与丝状伪足的尖端重合（图1A）。通过在后续帧中寻找凸包的最近顶点，即可在整个视频中追踪移动的尖端。一旦在每一帧中检测到尖端位置，便利用该位置与丝状伪足基部的一个参考点相连，绘制出一条轴线（图1B）。随后，沿垂直于该轴线方向上光强中值像素最大的位置，确定一系列等距的节点，利用这些节点构建出一条贴合丝状伪足形态的骨架结构。基于这一自适应骨架，可生成延时图像（kymograph），用于追踪丝状伪足的生长过程以及沿其长度方向上最多三个通道的蛋白质浓度变化（图1C）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> 
图1：图像分析软件的工作原理。（A）软件背后的算法。在步骤1中，用户指定丝状伪足的参考点（基部）和顶点（尖端）。在步骤2-1中，通过具有最大强度值的中值像素获取丝状伪足的主干。在步骤3中，利用该主干生成空间蛋白强度分布图。在步骤2-2中，软件自动追踪后续帧中的尖端位置。整个过程循环迭代。（B）算法运行时的真实丝状伪足截图，展示了用于追踪的凸包等关键结构要素。（C）该算法可测量参数的概览。本图改编自参考文献12。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
图像分析软件通过图形用户界面在Matlab（以下简称编程软件）中运行。为最大限度地提高特定实验条件下的灵活性和鲁棒性，用户可调整一系列追踪参数（例如 允许的弯曲角度和帧间运动），并对视频进行一些校正（例如 裁剪、轮作、去除不需要的物体）（图 2A 和 表1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>图形用户界面</td>
			<td>编号</td>
			<td>强制性</td>
			<td colspan="5">描述</td>
			<td>名称（在图形用户界面中）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>1a</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">加载代表细胞体的堆叠 .tiff 文件（勾选框中）或从通道创建叠加的细胞体</td>
			<td>细胞体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>1b</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">加载对应于蛋白1的堆叠图像文件</td>
			<td>蛋白1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>1c</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">加载对应于蛋白2的堆叠图像文件</td>
			<td>蛋白2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>1d</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">加载对应于蛋白3的堆叠图像文件</td>
			<td>蛋白质 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>1e</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">重置为预加载的堆叠图像文件</td>
			<td>重置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2a</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">滚动滚动条以在 GUI 窗口 #2 中确定分析的初始帧</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2b</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">滚动滚动条以在GUI窗口#2中确定用于分析的最终帧</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2c</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">表示当前帧的滚动条</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2d</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">像素的灰度值，低于该值的所有像素将被设为零</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2e</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">像素灰度值的阈值，高于该值的所有像素将被设为最大值</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2f</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">设定由指定像素的强度值 &#60;2e&#62; &amp;#38; &#60;2f&#62;</td>
			<td>设置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2g</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">播放强度调整后的视频</td>
			<td>播放</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2 h</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">裁剪图像</td>
			<td>作物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2i</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">旋转图像</td>
			<td>旋转</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>2j</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">删除整个堆栈中的区域</td>
			<td>删除区域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>3a</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">单击以打开“分析窗口”（图形用户界面窗口 #2）</td>
			<td>追踪窗口</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1</td>
			<td>3b</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">输入像素的尺寸（单位：微米）</td>
			<td>输入像素大小</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>4</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">单击以生成重叠细胞体的边界/边缘图像</td>
			<td>边界</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>5</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">单击以选择丝状伪足的基部和尖端</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6a</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">输入段或节点的数量</td>
			<td>片段数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6b</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">输入扫描长度（垂直于轴向）</td>
			<td>扫描宽度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6c</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">输入丝状伪足开始弯曲的长度阈值</td>
			<td>精确测量之后</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6d</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">输入尖端检测圆的半径（即下一帧中可定位顶点的区域）</td>
			<td>探针尖端检测半径</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6e</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">输入丝状伪足相对于垂直轴的最大弯曲角度</td>
			<td>角度阈值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6f</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">为该特定帧添加基部和尖端的参考点</td>
			<td>选择参考</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6g</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">输入该特定帧中filopodia开始弯曲的长度阈值</td>
			<td>精确测量之后</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6h</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">输入该特定帧的检测圆半径</td>
			<td>探针尖端检测半径</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6i</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">输入特定帧的所有参数后，单击以将数值保存至内存和文件，供后续参考</td>
			<td>添加</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6j</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">单击可手动删除该帧的参数设置</td>
			<td>删除</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6k</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">单击可删除为所有帧通过“可选功能面板”手动存储的所有参数</td>
			<td>重置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>6l</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">跟踪前请先签到，以将所有跟踪结果存储在内存中供日后参考</td>
			<td>历史追踪</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>7</td>
			<td>Y</td>
			<td colspan="5">单击以开始追踪</td>
			<td>追踪&amp;#38;Analyze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8a</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">点击开始追踪蛋白质通道强度</td>
			<td>分析蛋白质强度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8b</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">沿丝状伪足长度检测以追踪蛋白通道强度</td>
			<td>整个丝状伪足</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8c</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">用于追踪参考蛋白或蛋白A的检测</td>
			<td>ProteinA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8d</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">检查以追踪蛋白 B</td>
			<td>ProteinB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8e</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">签到以追踪蛋白 C</td>
			<td>ProteinC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8f</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">登录以追踪尖端的平均蛋白质强度</td>
			<td>前沿提示</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8g</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">输入尖端的长度</td>
			<td>尖端长度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8 h</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">输入尖端开始形成的基部最小距离</td>
			<td>阈值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>8i</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">单击可将顶端尖端分析结果保存到文件</td>
			<td>按钮推送</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>9a</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">点击以启动比率法蛋白质分析</td>
			<td>比较</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>9b</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">检测以比较蛋白B相对于蛋白A的情况</td>
			<td>log10(B/A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>9c</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">检测以比较蛋白C相对于A的情况</td>
			<td>log10(C/A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>9d</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">检查以比较在尖端处蛋白B相对于蛋白A的情况</td>
			<td>log10(B/A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>9e</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">在尖端比较蛋白C与蛋白A</td>
			<td>log10(C/A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>10a</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">选择其他颜色映射（默认：Jetplot）</td>
			<td>颜色图</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#2</td>
			<td>10b</td>
			<td>N</td>
			<td colspan="5">编辑颜色映射表</td>
			<td>编辑颜色映射</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：GUI窗口#1和#2中所有功能的概览。
完成此步骤后，程序将生成一个凸包，并在整个视频中自动追踪尖端。从视频中提取的参数，如比值化明暗条带图、生长速度和丝状伪足长度，会实时显示并作为图像和数据文件保存至工作文件夹中。其他参数，如丝状伪足寿命、生长速率和回缩速率，可随后从已保存的数据文件中提取并进一步分析（图2B）。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> 
图2：图像分析软件的图形用户界面。（A）GUI窗口#1用于加载和处理图像。该程序最多可加载3个蛋白通道，其中两个通道进行成对比较。该窗口提供图像追踪前预处理所需的必选功能（蓝色）和可选功能（绿色）。（B）GUI窗口#2用于丝状伪足的追踪，以及蛋白质的时空分析和比值分析。同样，可选功能以绿色标示。本图经参考文献12修改。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
本文介绍了一套详细的样本制备与软件操作方案。我们首先提供关于细胞培养以及获取适用于图像分析的延时成像视频的详细操作步骤。在数据采集部分之后，是图像分析软件操作的详尽说明。在整个方案中，我们指出了在数据采集与处理过程中需要重点关注的关键步骤以及可选功能。最后，我们利用该图像分析软件对来自不同模型系统的丝状伪足进行分析，并以对比本方案所述图像分析软件与其他可用于丝状伪足定量分析的软件程序作为结尾，同时讨论了当前方法的局限性与未来发展方向。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>10% 胎牛血清</td><td>Biochrom AG</td><td>L11-044</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>1% 青霉素/链霉素</td><td>Biochrom AG</td><td>12212</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M 储存液)</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Citrine-N1</td><td>Addgene</td><td>54593</td><td></td></tr><tr><td>Labtech</td><td>Thermo</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Thermo</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>COS 7</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-60</td><td></td></tr><tr><td>3T3 细胞</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nicon Eclipse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Andor</td><td>DU888 Ultra</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦单元</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr></tbody></table>

用于软件辅助追踪动态细胞突起中蛋白质浓度的图形用户界面

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

丝状伪足是与细胞迁移和细胞间通讯相关的动态手指状细胞突起。为了更好地理解丝状伪足启动、延伸以及后续稳定或回缩过程中复杂的信号传导机制，确定这些动态结构中蛋白质活性的时间和空间分布至关重要。为了分析丝状伪足中的蛋白质功能，我们近期开发了一种可适应丝状伪足形态变化的半自动追踪算法，从而能够同时分析突起的动态行为以及沿整个丝状伪足长度方向上的相对蛋白质浓度。本文提供了一套详细的分步操作方案，涵盖优化的细胞处理、图像采集和软件分析流程。我们还进一步提供了在图像分析和数据呈现过程中使用可选功能的操作说明，以及针对各个关键步骤的故障排除指南。最后，本文还对所描述的图像分析软件与其他可用于丝状伪足定量分析的程序进行了比较。综上所述，本方案为利用图像分析软件精确分析丝状伪足突起中的蛋白质动态变化提供了完整的技术框架。

利用转染了丝状肌动蛋白标记物（f-tractin18，红色）和细胞质参考标记（绿色）的COS细胞，我们观察到富含肌动蛋白的丝状伪足突起（图3A，上图）。时间序列图像显示，丝状伪足会快速延伸和回缩（图3A，中图）。通过图像分析软件，我们追踪了单个丝状伪足的动态变化。手动测量与图像分析软件测得的丝状伪足长度之间的比较显示，其Pearson互相关系数为0.947，表明该软件能够可靠地追踪丝状伪足的延伸过程12。除了单个丝状伪足的生长和回缩速率外，图3A底部的明暗图还展示了肌动蛋白的荧光强度（上）、细胞质参考标记的荧光强度（中），以及相对于细胞质参考标准化后的肌动蛋白相对浓度（下）。综上所述，这些实验结果证明，该程序能够在COS细胞中可靠地测量单个丝状伪足整个生命周期内的生长动力学以及空间分辨的相对蛋白质浓度...

我们提出了一种软件解决方案，用于沿动态细胞突起长度方向半自动追踪相对蛋白质浓度。

丝状伪足是与细胞迁移和细胞间通讯相关的动态手指状细胞突起。为了更好地理解其复杂的……

该图像分析软件的总体目标是对整个丝状伪足长度上的凸起动态和相对蛋白质浓度进行并行分析。该方法有助于我们深入理解细胞生物学中的关键问题，特别是参与丝状伪足延伸与回缩的各个蛋白质的作用机制。该技术的主要优势在于其提供的自适应形态追踪算法，能够对凸起动态进行定量评估，并实现空间分辨的蛋白质定位分析。首先，按照文本方案中的说明，在添加了补充物的培养基中培养神经元、HeLa 或 COS 细胞。当细胞融合度达到 40% 时，使用转染试剂根据制造商说明书将目标质粒转染至细胞中。将转染后的细胞置于 37 摄氏度、5% CO2 的培养箱中孵育 15 至 18 小时。孵育后，用37摄氏度预热的培养基填充细胞培养腔至90%，培养基中应含有20毫摩尔HEPES，以减少成像过程中因蒸发引起的pH值和渗透压变化。为密封盖子，需在盖子内侧涂上一层薄薄的真空脂，然后轻轻将其压在含有转染细胞的培养腔上。图像分析中最关键的部分可能是图像质量。我们需要关注的一个问题是信噪比，其值必须大于四。我们可以通过调整相机的曝光时间、激光强度以及确保帧率大于每秒一赫兹来满足这一条件。使用配备60倍或100倍物镜的显微镜进行成像，并且不进行像素合并。图像采集速率不得低于每秒一赫兹，以追踪丝状伪足的动力学过程。为尽量减少离焦伪影，请对靠近基底膜的丝状伪足进行成像。为确保追踪过程平滑，调整相机曝光时间与激光强度，使信噪比大于四。完成上述设置后，开始图像采集。按照文本方案中所述的图像预处理步骤完成后，通过下载包含所有图像分析所需文件的压缩文件夹来加载图像。解压后将文件复制到工作文件夹中。安装完成后，通过打开名为 filopodiaAnalysisM3.fig 的文件启动图形用户界面。在图形用户界面（GUI）中加载各个蛋白质的已保存堆栈TIFF文件。使用按钮1B选择蛋白质A，按钮1C选择蛋白质B，以及可选的按钮1D选择蛋白质C。单击1A创建来自各蛋白质通道的细胞叠加图像。然后单击2A指定分析的第一帧，再单击2B指定分析的最后一帧。可选地，使用 2H 按钮裁剪包含目标丝状伪足的感兴趣区域（ROI）。使用 2I 按钮旋转图像，或使用手绘工具 2J 删除不需要的区域。移动每个帧的滑块 2C 进行质量控制，并检查丝状伪足在整个视频中是否始终保持清晰可见。为了生成轨迹，首先在图形用户界面一中点击 3A 按钮，以打开图形用户界面二。在图形用户界面二中点击四号按钮，以生成在点击 1A 后于图形用户界面一中叠加产生的细胞体质量。我们建议花费一定时间优化适用于您实验数据集的参数，例如片段数量、扫描宽度和扫描半径。移动第二个窗口中的滑块，以确定丝状伪足尖端首次出现的位置。然后点击第五个按钮，光标将出现。使用光标选择测量丝状伪足尖端距离的起始基点。在伪足首次出现的帧中，跟随其尖端进行追踪。接着，使用图6C设定伪足发生弯曲的阈值长度。然后，在6A框中指定用于近似伪足形态的线段数量。指定扫描宽度，该参数作为水平扫描器，用于在6B中放置节点。在6D框中指定扫描半径，其数值应比观察到的帧间针尖位移大约50%。然后，在6E框中指定弯曲角度。在第二个图形用户界面窗口中，勾选该区域的历史轨迹框，以保存完整的追踪流程供日后参考，然后点击“追踪并分析”按钮以开始追踪。进行时空分析时，选择由8B表示的区域，随后选择目标蛋白通道。点击8A，利用先前生成的轨迹，沿丝状伪足长度方向进行蛋白追踪。对于比率型蛋白质分析，勾选复选框 9B 或 9C，然后点击按钮 9A，以获得时空比率图。要进行丝状伪足尖端分析，请勾选复选框 8F，并使用 8G 和 8H 设置从基部开始的尖端长度和阈值长度。点击按钮，将数据保存到名为 dynamics.xlsx 的 Excel 文件中。然后，点击“分析蛋白质强度”以生成丝状伪足尖端蛋白质强度的轨迹，并保存用于比率分析。使用图9D或9E选择要分析的相应比率。最后，点击比较按钮（图9A）以生成比率数据。用红色标记丝状肌动蛋白、绿色标记胞质参考物转染COS细胞后的分析显示，富含肌动蛋白的丝状伪足突起。时间序列显示，富含肌动蛋白的丝状伪足突起快速伸长和回缩。利用图像分析软件，对单个丝状伪足进行了追踪。图像分析软件可可靠地追踪丝状伪足的延伸，以及单个丝状伪足的生长和回缩速率；化学图谱还可显示肌动蛋白浓度相对于胞质参考值的标准化结果。若正确使用该技术，可实现对伪足突出动态的定量分析，并在空间上解析丝状伪足中蛋白质的浓度分布。在进行实验操作时，需注意成像速度，并保持信噪比大于四，同时避免单帧图像信号饱和。

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

软件辅助跟踪动态细胞突变中蛋白质浓度的图形用户界面

光激活定位显微镜（PALM）结合单分子示踪技术，可直接观察并定量活体大肠杆菌（Escherichia...

利用光激活单分子示踪技术在活体细菌细胞中可视化蛋白质-DNA相互作用

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

在本视频方案中，我们使用经改造的双光子显微镜结合轨道追踪方法，对活细胞内荧光标记的溶酶体进行高速、三维的动态追踪。...

在改进的双光子显微镜中进行三维轨道追踪：用于细胞内囊泡追踪的应用

网格蛋白介导的内吞作用是一种快速且高度动态的过程，可将多种蛋白质（包括信号受体）内化。本文所述的实验方案可直接可视化单个内吞事件的动力学过程。这对于理解内吞机制核心组分之间如何相互协调，以及蛋白质货物如何影响该过程至关重要。...

通过全内反射荧光显微镜以单事件分辨率可视化G蛋白偶联受体的网格蛋白介导的内吞作用

本文介绍了一种用于单粒子追踪图像分析的实验方案，可对荧光显微镜检测到的单个粒子的扩散系数、运动类型和簇大小进行定量评估。...

用于荧光显微镜分析膜受体扩散与簇大小的图像处理方案

三维单分子定位显微技术被用于研究活体细菌细胞中荧光标记蛋白的空间位置和运动轨迹。本文所述的实验与数据分析方案基于整合的单分子轨迹，确定胞质蛋白的主要扩散行为。...

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自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

本方案旨在测量铺展细胞边缘突起的动态参数（突起、回缩、皱褶）。...

利用活细胞显微镜测量细胞边缘突出在铺展过程中的动态变化

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利用质量敏感型粒子追踪技术表征膜相关大分子动力学

本文详细介绍了如何制备用于固相支撑脂双层中单蛋白追踪的样品。同时阐述了一种具有单分子灵敏度和高帧率的简易荧光显微镜。最后，我们概述了提取单蛋白轨迹的实验步骤。...

使用荧光显微镜追踪脂双层中的单个蛋白质

了解如何使用半自动化图像分析软件追踪丝状伪足动态变化并定量分析蛋白质浓度分布。该方法适用于神经元、HeLa及COS细胞，为细胞生物学研究提供可靠的空间分辨蛋白动力学分析工具。

用于软件辅助追踪动态细胞突起中蛋白质浓度的图形用户界面

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