Name: 水平整体安装:厚三维组织横截面皮肤的新型加工和成像方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 了解厚三维皮肤组织横截面加工与成像方案，使用小鼠皮肤样本和共聚焦显微镜技术。该方法保留抗原性和结构完整性，实现毛囊和立毛肌的完整可视化，适用于发育生物学和组织学研究。

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作者感谢赛默飞世尔科技公司的资助，并感谢伦敦国王学院尼康影像中心在共聚焦图像采集过程中提供的支持。

所有动物实验均经过当地伦理审批，并根据英国政府内政部许可证的条款进行。
1. 皮肤采集与冷冻保存
<ol>
	<li>准备工作。
	<ol>
		<li>准备一个100毫米培养皿，加入25 mL 4%多聚甲醛（PFA），另准备两个100毫米培养皿，各加入25 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
		<li>用最佳切割温度化合物（O.C.T.）填充矩形可剥离冷冻模具，填充至其容积的三分之二。</li>
		<li>将一块可用于后续步骤放置冷冻块的金属板放入-80 °C冰箱中预冷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮肤取材、固定与冷冻保存。
	<ol>
		<li>使用干燥的电动剃毛器修剪动物尸体背部区域。 
		注意：本示例中使用的是出生后第21天的野生型小鼠。</li>
		<li>取下皮肤上感兴趣区域。 
		注意：小鼠皮肤的背中区（图1a）含有最高比例且排列均匀、方向一致的毛囊，有利于切片时获得最佳取向。去除皮下非真皮组织并非必需，但可根据需要进行。</li>
		<li>根据毛囊生长方向，将取得的皮肤修剪成适合放入冷冻模具底部的矩形片状。 
		注意：初学者可选择较小的皮肤样本，因其在孵育和安装过程中不易缠绕。本例展示的是一块约1 cm2的背部皮肤，可适配22 × 30 × 20 mm的冷冻模具（图2a）。</li>
		<li>根据皮肤样本厚度，在25 mL 4% PFA中室温固定10–30分钟（图1b）。</li>
		<li>用25 mL PBS洗涤皮肤样本两次，每次至少5分钟（图1b）。</li>
		<li>将皮肤样本在纸巾上轻压，小心去除多余的PBS，以免在冷冻过程中产生结晶，影响冷冻切片效果。 
		注意：本方案无需标准蔗糖梯度处理，但使用者可根据需要自行加入此步骤。</li>
		<li>注意每块皮肤样本中毛囊的方向。可借助解剖显微镜进行观察辅助（尤其是首次操作者）。将皮肤样本放入盛有O.C.T.的冷冻模具中，并用镊子去除附着在剪短毛发表面的气泡，确保皮肤各区域均与O.C.T.充分接触并平衡（图2a和2b）。</li>
		<li>将皮肤推至O.C.T.填充块的底部，使其紧贴模具底面。 
		注意：皮肤可按任意方向放置，只要记录毛囊走向以便正确切片即可。在将冷冻块安装至冷冻切片机进行切片时，模具方向可重新调整。请在冷冻模具上标记毛囊方向，因为此步骤决定了后续冷冻切片的切割取向。</li>
		<li>将冷冻块转移至-80 °C冰箱内的金属板上，以防止组织漂浮或移位。</li>
		<li>监控冷冻过程，确保皮肤始终保持在冷冻模具底部的正确位置，因为未察觉的气泡可能导致皮肤上浮至O.C.T.表面。 
		注意：含组织的冷冻模具可在-80 °C长期保存超过一年，并可重复用于后续切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于组织切片制备的小鼠皮肤取样和PFA固定方法示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 小鼠皮肤的取材与固定。 
(a) 从小鼠尸体的背中区取皮肤组织。该区域的毛囊分布均匀且排列整齐，因此在切片过程中可实现最佳取向，如箭头所示。(b) 将皮肤组织切成适合嵌入冷冻模具的适当大小的方块后，用4% PFA固定15分钟，并用PBS洗涤两次，每次5分钟。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 厚组织切片
<ol>
	<li>冷冻切片机上样品的准备与组织定位。
	<ol>
		<li>准备一个100 mm的培养皿，加入15 mL PBS，放置在冷冻切片机附近便于取用的位置。同时，准备一个12孔板，每孔加入2.5 mL PBS，并根据样品进行标记，用于在4 °C下长期保存切片。使用镊子操作切片。</li>
		<li>将冷冻切片机的温度调节至-20 °C。 
		注意：温度会影响切片效果，但通常以-20 °C作为起始温度较为合适。</li>
		<li>为获得约两个毛囊厚度的切片，将冷冻切片机调整为切割150 µm厚的切片。 
		注意：切片厚度可根据用户需求及后续成像所用显微镜的限制进行调整。 
		注意：样品的取向对于获得具有正确毛囊方向的皮肤切片至关重要。这需要将样品正确安装在冷冻切片机的样品块上。确保切片平面与毛囊方向平行（图2c）。如前所述，皮肤样品中切片平面的正确取向是决定后续成像质量的关键步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="毛囊切片过程；用于组织学分析的示意图和切片机设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 包埋、冷冻保存与切片。 
(a) 在冷冻模具上标记毛囊（HF）的方向（由黑色箭头指示）对于冷冻切片过程中正确的取向至关重要。(b) 切片平面必须与毛囊的取向对齐，以获得完整保留毛囊全长的切片。( c) 根据冷冻模具上黑色箭头所示的毛囊取向进行切片。( d) 使用金属镊子收集较厚的组织横切面，并( e) 转移至含有1×PBS的100 mm培养皿中。( f) 在室温下，PBS会溶解包裹厚组织横切面的O.C.T.包埋剂（由白色箭头指示），随后切片在PBS中自由漂浮。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>冷冻切片。
	<ol>
		<li>使用冷冻切片机切割切片。用镊子取出含有包埋皮肤组织的O.C.T.化合物（图2d）。 
		注意：使用可在X、Y和Z轴方向独立移动和调节的冷冻切片机，以实现最佳的样本定位。这有助于获得理想对齐的组织横截面。</li>
		<li>将切片从冷冻切片机转移至盛有PBS的100 mm培养皿中，并继续切割下一片。不要将样本直接收集在载玻片上（图2e）。 
		注意：在室温下，PBS会溶解O.C.T.，从而释放出易于用镊子操作的皮肤切片（图2f）。 
		注意：在溶解多个100 µm厚的组织切片后，100 mm培养皿中的PBS可能需要更换为新鲜PBS，可根据实际情况进行更换。</li>
		<li>用镊子将漂浮的皮肤切片转移至已正确标记的12孔板中，每孔加入2.5 mL PBS（图3a，左图）。 
		注意：样本可在4 °C条件下保存至少两天。对于切片后含有皮肤的O.C.T.块的长期保存，应用一滴新鲜O.C.T.密封切削面。待O.C.T.液滴冻结后，用Parafilm膜包裹使用过的O.C.T.块，并放回-80 °C冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 免疫荧光标记。
<ol>
	<li>按照先前所述方法，至少提前2小时配制PB缓冲液（PBS中添加0.5%脱脂奶粉、0.25%鱼皮明胶和0.5% Triton X-100）5。 
	注意：为便于染色缓冲液重复使用并保存抗体，可在PB缓冲液中加入叠氮化钠。</li>
	<li>标记1.5 mL微量离心管，每管加入500 µL PB缓冲液。使用镊子小心将皮肤切片从PBS转移至含有PB缓冲液的独立离心管中进行封闭（图3a，右图）。确保所有皮肤切片完全浸没。将微量离心管置于摇床（往复式）上，以不超过每分钟10次振荡的速度，在室温下孵育1小时。 
	注意：摇床速度不得超过每分钟10次振荡，否则可能导致组织缠绕。
	<ol>
		<li>虽然可在同一微量离心管中放入多个切片，但为节约抗体，建议每管仅放置一个切片。如需进一步减少抗体用量，可将体积减少至250 µL。 
		注意：如有需要，可用96孔板替代微量离心管。然而，将较厚的组织横切面置于1.5 mL微量离心管中，因液体扰动更充分，可实现更有效的抗体渗透。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为每一片皮肤切片分别标记新的1.5 mL微量离心管，每管加入500 µL PB缓冲液及适量的一抗。封闭1小时后，将皮肤切片转移至新配制的含一抗的离心管中，于4 °C孵育过夜。 
	注意：本实验中使用的一抗包括：FITC标记的鼠抗人CD49f（1:50浓度）和山羊抗小鼠/大鼠整合素α8抗体（1:100浓度）。</li>
	<li>次日，为每个样本准备两个独立的1.5 mL微量离心管，每管加入500 µL PBS。将皮肤切片在室温下洗涤两次，每次1小时。</li>
	<li>准备若干独立的1.5 mL微量离心管，每管加入500 µL PB缓冲液，并加入适当浓度的二抗及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。 
	注意：本实验中使用的二抗为Alexa Fluor 488标记的驴抗大鼠IgG和Alexa Fluor 555标记的驴抗山羊IgG，浓度均为1:500；DAPI使用浓度为1:100。</li>
	<li>小心将皮肤样本转移至含有二抗和DAPI的PB缓冲液中，于室温下在旋转仪或摇床上以低速孵育1小时。</li>
	<li>将切片保存在含二抗和DAPI的PB缓冲液中，置于4 °C，可保存长达四天；若在PBS中添加叠氮化钠，保存时间可能更长。</li>
</ol>
<img alt="染色与封片过程；显微镜载玻片制备；染色、封片、完成步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 免疫荧光标记与封片。 
(a) 漂浮的组织横切片可在4 °C条件下保存于12孔板中至少两天。在进行免疫荧光（IF）标记前，将感兴趣的组织横切片转移至含有PB缓冲液的1.5 mL微量离心管中用于封闭，如箭头1所示。进行IF标记时，需遵循步骤3中详述的多步操作流程。步骤3的每一部分均需将组织横切片小心转移至新配制的微量离心管中，管内分别含有初级抗体溶液、次级抗体溶液或洗涤缓冲液，如箭头2所示。(b) 完成IF标记后，在甘油滴中借助解剖显微镜将组织横切片展开并压平。(c) 当组织横切片完全展平于盖玻片底部后，使用普通显微镜载玻片进行封片。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 显微观察的封片
<ol>
	<li>成像前，将皮肤切片转移至含有 500 µL PBS 的独立微量离心管中，以洗去二抗和 DAPI。</li>
	<li>使用 1,000 µL 移液器，但需剪去枪头前端约 0.5 cm，以便正确吸取高黏度的甘油。在解剖显微镜下（图 3b），将 22 × 50 mm 盖玻片放置于深色背景上。</li>
	<li>在盖玻片上加入一滴 100% 甘油（图 3b）。将皮肤切片从微量离心管转移至甘油液滴中。利用解剖显微镜和尖头镊子小心展开卷曲的皮肤切片。 
	注意：由于切片漂浮在甘油液滴中，可借助组织自然恢复原有形态的趋势进行理顺。切勿强行将其拉直至非自然状态，以免造成组织损伤。</li>
	<li>当皮肤切片全长已正确展开并平整地置于盖玻片上后，将其封固于普通载玻片上。此步骤可进一步使皮肤切片展直。 
	注意：避免产生气泡（图 3c）。</li>
	<li>在接下来的两天内对甘油封片的皮肤切片进行成像。 
	注意：长期储存会负面影响组织状态和成像质量。本示例中，所有图像均使用直立共聚焦显微镜配合 20 倍物镜获取。</li>
</ol>

<ol><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+dermal+BMP+signalling+regulates+stem+cell+activation+during+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration.</a> Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+self-renewal+and+differentiation+phases+in+the+niche+of+infrequently+dividing+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).</li>
<li>Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+relationship+between+stem+cells+and+their+progeny+in+the+basal+layer+of+human+epidermis%3A+a+new+view+based+on+whole-mount+labelling+and+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis.</a> Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2-positive+dermal+papilla+cells+specify+hair+follicle+type+in+mammalian+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis.</a> Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).</li>
<li>Niculescu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+integrin+alpha-6+in+mouse+epidermis+leads+to+skin+fragility+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation.</a> Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basement+membrane+of+hair+follicle+stem+cells+is+a+muscle+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche.</a> Cell. 144 (4), 577-589 (2011).</li>
<li>Desciak, E. B., Maloney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifacts+in+frozen+section+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Surg%22%5BJournal%5D)">Artifacts in frozen section preparation.</a> Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).</li>
<li>Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+dermal+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Defining dermal adipose tissue.</a> Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slide+preparation+for+single-cell-resolution+imaging+of+fluorescent+proteins+in+their+three-dimensional+near-native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment.</a> Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).</li>
<li>Sada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+cellular+lineage+hierarchy+in+the+interfollicular+epidermis+of+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
</ol>

作者希望披露，本论文的发表由赛默飞世尔科技公司资助。

在这里，我们介绍“水平整体封片”技术，该技术相较于传统的冰冻切片具有多项优势。其一，该方法可使用常规组织学设备和共聚焦显微镜轻松完成。其二，与标准冷冻切片相比，该技术能更优地保持组织完整性。例如，位于皮下层的脂肪细胞（即， 真皮白色脂肪细胞（DWAT）9 在标准冷冻切片中严重受损，使得富含脂肪组织的研究变得不可能。我们的技术能够对该层中的脂肪细胞进行全面分析，并可适用于其他富含脂肪细胞的组织。此外，该方法有助于在谱系示踪研究中更有效地检测间充质细胞 2,10. 
标准冷冻切片本质上无法通过共聚焦显微镜揭示组织真实的三维结构。这意味着在皮肤分析中，较厚的切片更具优势，因为毛囊及其亚结构可能跨越的深度会超过经典冷冻切片常用的10 µm标准厚度。我们注意到，其他组织（例如肠道和脑组织）在以三维结构观察时也面临类似的挑战2,7,11,12,13。有趣的是，已有研究表明我们的技术在肠道某些应用中具有优势14。我们认为，我们所采用的水平整体封片方案有望应用于任何需要进行三维分析的其他组织。

显微成像设备的革新推动了复杂且高分辨率成像仪器的发展。然而，在获取完整的三维（3D）组织横截面显微图像时，样本制备面临巨大挑战，并可能成为决定图像质量的关键限制因素。每一个独立的步骤都需要仔细考量，以保持组织形态和目标蛋白的抗原性，尽量减少制备过程中引入的人为假象，并最大限度地提升最终图像质量。例如，皮肤的传统分析需要能够同时观察表皮和真皮结构的图像，并包含方向正确的毛囊，从而实现对干细胞区室在皮肤稳态中贡献的解剖学分析1,2。这要求对皮肤的包埋和切片方式给予充分关注。重要的是，毛囊的厚度可超过100 µm，远超常规石蜡包埋或冰冻切片的厚度标准，导致其分析质量低于整体封片或厚切片方法3,4,5。
综上所述，显微分析前的每一步样本制备都是影响图像分析的关键因素。本文介绍了一种用于厚组织三维切片分析的新型处理方案，我们称之为“&#34;水平整体封片&#34;”。该方案能高度保留抗原性，并利用标准共聚焦成像设备充分挖掘皮肤厚切片的分析潜力。本指南全面介绍了皮肤组织用于厚组织横切面处理与成像的完整流程，包括组织取材与多聚甲醛（PFA）辅助的冷冻保存（步骤1）、使用冷冻切片机获取厚度为100 µm的组织横切面（步骤2），以及免疫荧光标记与封片（步骤3和4）。代表性结果对比了两种不同组织学制备技术——传统冷冻切片与厚三维组织横切片——的共聚焦图像，突出了该方案潜在使用者采用“&#34;水平整体封片&#34;”的优势。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>明胶（来自冷水鱼皮）</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>甘油</td><td>BDH 实验室用品</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>VWR 化学品</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 包埋模具</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>方形 S-22</td></tr><tr><td>脱脂奶粉粉末</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐（DAPI）</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗人 CD49f 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>小鼠/大鼠整合素 alpha 8 抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记驴抗大鼠 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记驴抗山羊 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀片</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr><td>尖头金属镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Sigma</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 µl 和 1000 µl 移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&amp;micro;l XL 带刻度 TipOne 滤芯吸头（无菌）</td><td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&amp;micro;l 斜面 TipOne 滤芯吸头（无菌）</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>摇床振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片，Menzel Glaeser</td><td>Thermo Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>盖玻片，Menzel Glaeser</td><td>Thermo Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 × 60 mm</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

水平整体封片：一种用于皮肤厚三维组织切片的新型制备与成像方案

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

处理感兴趣的组织以获得支持科学论点的显微图像可能具有挑战性。高质量显微图像的获取不仅取决于显微镜本身的性能，更依赖于组织处理的方法，而这些方法通常涉及多个关键步骤。此外，皮肤及其他组织中的间充质细胞类型给组织制备和成像带来了新的难题。本文中，我们介绍了一套完整的流程，从组织取材到显微观察。我们所采用的技术称为“&#34;水平整体封片&#34;，该方法易于掌握，适用于初学者，并可在使用冷冻切片机切割的60–300 µm厚组织切片中实现抗原的有效保存与检测。此类厚度的切片有助于在三维环境中更清晰地展示组织微结构。此外，与传统的冷冻切片或石蜡切片相比，本方案能更好地保存间充质细胞，从而提升免疫染色的图像质量，增强其实验效果与可靠性。我们相信，该技术将有益于所有从事皮肤可视化研究的实验室，并可能适用于其他组织和器官的研究。

为了突出本技术的优势，我们将所建立的厚组织三维切片技术“水平整体封片法”与传统的冷冻切片法进行了比较。传统的冷冻切片按先前所述方法制备5。为了在显微图像中清晰显示表皮结构，我们对整合素α-6（Itga6）进行了免疫染色，Itga6是表皮细胞锚定于基底膜的重要组分6。同时，我们利用整合素α-8对竖毛肌（APM）进行标记，该肌肉负责毛发竖立（即“鸡皮疙瘩”）7。在传统冷冻切片中，大多数通过Itga6标记显示的毛囊并未沿其全长被完整切到，导致每张切片中毛囊多呈不完整状态，而水平整体封片法则能获得更完整的毛囊结构（图4a-4d）。厚组织切片相比传统的10-µm切片可获取更多的Z轴层扫图像，从而实现更完整的三维成像。这一点在研究与毛囊及上方基底膜相关联的APM完整性时尤为明显。在传统冷冻切片中，绝大多数APM结构被分割断裂（图4a-4d）。此外，与冷冻切片贴附于温热载玻片时因冻融效应导致脂肪细胞破坏这一常见的人工假象相比，水平整体封片法能更好地保持皮下组织区室的组织完整性（图4a-b，对比皮下区域）8。
<img alt="皮下组织切片；Itga8、Itga6 标记物；荧光显微镜；毛囊分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4. 水平整体封片与传统冰冻切片的比较。 
(a) 传统的10 µm厚皮肤冰冻切片和(b) 100 µm厚的三维组织横切面分别用整合素α-6（Itga6）和整合素α-8（Itga8）进行标记，以分别显示表皮区室和立毛肌。厚组织横切面的图像表示为大范围Z轴堆叠图像的最大投影。白色框表示被放大的区域，在(c) 传统切片和(d) 水平整体封片切片中展示。在传统切片和水平整体封片切片中分别对(e) 完整毛囊和(f) 完整立毛肌进行定量分析。比例尺表示100 µm。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。每个生物学重复取一个切片（n=3）进行定量分析。非配对t检验 *P&lt;0.05，***P&lt;0.0005。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究提出了一种用于厚型三维组织切片分析的新型处理与成像方案，可充分挖掘共聚焦成像技术的潜力。该方案能够保持抗原性，是一种分析皮肤组织学结构以及其他潜在组织类型的可靠系统。

处理感兴趣的组织以生成支持科学论点的显微图像可能具有挑战性。高质量……的获取

本组织学与成像方案的总体目标是建立一个能够有效保持皮肤表皮抗原性及结构完整性的可靠系统，从而充分实现共聚焦成像技术的各种应用。该方法有助于解答一些关键科学问题，特别是在需要研究复杂三维组织结构中各类细胞特性的情况下。与传统的组织学技术相比，该技术的主要优势在于其可靠性高且操作简便。此外，该方案可完美配合共聚焦显微镜中的三维分析。首先将从小鼠背部中线区域获取的皮肤修剪成矩形小块，每块大小应适配于冷冻模具底部。此处展示的是一个面积为一平方厘米的背部皮肤样本，可放入一个尺寸为22毫米×30毫米×20毫米的冷冻模具中。固定后，将清洗过的皮肤推至盛有OCT包埋剂的模具底部，使其与底部齐平。在冷冻模具上标记毛囊的方向，因为这将决定冰冻切片时的切面方向。将冷冻块转移至置于-80摄氏度冰箱中的金属板上，以防止组织漂浮或移位。在冷冻过程中需密切监测，确保皮肤始终位于冷冻模具底部并保持正确方向，因为不可见的气泡可能导致皮肤上浮至冷冻模具表面。开始时，将已冻结的冷冻块固定在冷冻切片机载物台上，使毛囊方向与冷冻模具上所示切片平面方向一致。正确调整冰冻切片机上毛囊的精确方向至关重要，因为此步骤决定了切片平面，从而获得完整保留毛囊全长的皮肤切片。使用冰冻切片机切取100 µm厚的切片。用镊子夹住包埋皮肤周围的OCT包埋剂，将切片从冰冻切片机中转移至盛有PBS的100 mm培养皿中。在室温下，PBS 会溶解 OCT 包埋剂，从而得到易于用镊子操作的皮肤切片。切片完成后，使用镊子将漂浮的皮肤切片转移至含有 2.5 毫升 PBS 的 12 孔板的孔中。首先向已标记的 1.5 毫升微量离心管中加入 500 微升 PB 缓冲液，以开始免疫荧光标记。使用镊子小心地将皮肤切片从12孔板转移至用于封闭的离心管中。确保所有皮肤切片完全浸没。将微量离心管置于摇床上，以每分钟10次或更低的振荡频率，在室温下孵育1小时。为每一片皮肤样本标记单独的1.5毫升微量离心管，并加入含有适量一抗的500微升PB缓冲液。封闭一小时后，将皮肤切片转移至新配制的含抗体的离心管中。将切片置于4°C、低速摇床上过夜孵育。第二天，将切片转移至含有500 µL PBS的1.5 mL微量离心管中，在摇床上室温孵育一小时进行洗涤。随后，将切片分别转移至含有500 µL PB缓冲液的1.5 mL微量离心管中，缓冲液中需加入适当浓度的二抗和DAPI。室温下孵育一小时，可选择在摇床上进行；若需要，样品可在4°C保存最多四天，待后续处理。 成像前，将皮肤切片转移至含有500微升PBS的独立微量离心管中，以洗涤二抗和DAPI。然后，在解剖显微镜下，将一块22毫米×50毫米的盖玻片放置于深色背景上。接着，使用剪去末端的1,000微升移液枪，向盖玻片上加入一滴100%甘油。将皮肤切片从微量离心管转移至甘油液滴中。然后，在体视显微镜下观察，用尖头镊子轻轻操作，使卷曲的皮肤切片在甘油中逐渐恢复至其自然形态。切勿强行将切片拉直至非自然状态，以免对组织造成损伤。当切片的整个长度在盖玻片上被正确放置并展平后，将其转移到普通显微镜载玻片上，此步骤将进一步拉直皮肤切片。在接下来的两天内，对以甘油封片的皮肤切片进行成像。该图像显示了一张经典的10微米厚皮肤冷冻切片，经整合素α6和整合素α8标记，分别用于可视化表皮区室和立毛肌。该100微米厚的三维组织横切面以相同方式进行了标记。所示图像为大型Z轴层扫数据的最大投影。将两张图像的细节并排比较，在传统的冷冻切片中，大多数通过整合素α6显示的毛囊并未沿其全长进行切片，导致每张切片中 predominantly 为不完整的毛囊，而与之相比，水平整体封片则更为完整。在传统切片和水平整体封片中均对完整的毛囊及完整的立毛肌进行了定量。每个生物学重复取一张切片进行定量；如图所示，整体封片切片中完整毛囊和立毛肌的比例更高。一旦掌握，该冷冻切片技术每分钟可完成超过15个切片，且若包埋操作正确，可获得完全正确定向的样品。观看本视频后，您应能够充分理解如何在三维环境中处理和分析厚组织横截面。

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科研

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