水平整体安装:厚三维组织横截面皮肤的新型加工和成像方案
August 2nd, 2017
这项工作提出了一种新颖的加工和成像协议，用于厚的三维组织横截面分析，可以充分利用共聚焦成像模式。该协议保留抗原性，并代表一个强大的系统来分析皮肤组织学和潜在的其他组织类型。
该组织学和成像方案的总体目标是提供一个强大的系统，以保持皮肤的上皮醇抗原性和结构完整性，从而允许充分利用共聚焦成像模式。这种方法可以帮助回答需要检查复杂三维组织结构中任何类型细胞性质的关键问题。与标准组织学技术相比，该技术的主要优点是它坚固耐用且易于执行。
此外，该方案完美地补充了共聚焦显微镜中的三维分析。首先将从小鼠背侧内侧区域收获的皮肤修剪成矩形块。每块的大小应适合低温模具的底部。
这里展示了一个 1 平方厘米的背侧皮肤区域，适合 22 毫米 x 30 毫米 x 20 毫米的低温模具。固定后，将清洗过的表皮推到 OCT 填充模具的底部，使其与底部齐平。在低温模具上标记毛囊方向，因为这决定了低温统计切割的方向。
将冷冻块转移到零下 80 度冰箱中的金属板上，以防止组织漂浮和脱位。监测冷冻过程，以保持低温模具底部皮肤的方向，因为看不见的气泡会导致皮肤上升到低温模具的表面。首先将冷冻的冷冻块固定到具有毛囊方向的低温恒温器载物台上，如冷冻模具上沿切片平面所示。
在低温恒温器上正确调整准确的毛囊方向至关重要，因为此步骤决定了生成整个毛囊长度完好无损的皮肤切片的剖面。使用低温恒温器切割 100 微米的切片。用镊子抓住嵌入的皮肤片周围的 OCT，并将切片从低温恒温器转移到充满 PBS 的 100 毫米培养物中。
在室温下，PBS 会溶解掉 OCT，留下易于用镊子处理的皮肤切片。切片后，使用镊子将漂浮的皮肤切片转移到含有 2.5 毫升 PBS 的 12 孔板的孔中。首先向标记的 1.5 mL 微量离心管中加入 500 μL PB 缓冲液，开始免疫荧光标记。
小心地使用镊子将皮肤切片从 12 孔板转移到试管中以进行封闭。确保所有皮肤切片都完全浸没在水中。将微量离心管以每分钟 10 次或更低的振荡速度放在锯状摇杆上，在室温下放置 1 小时。
为每个皮肤切片标记单独的 1.5 mL 微量离心管，并加入 500 μL 含有适量一抗的 PB 缓冲液。封闭 1 小时后，将皮肤切片转移到新鲜制备的含有抗体的试管中。将切片在 4 摄氏度下在摇杆上以低速孵育过夜。
第二天，将切片转移到含有 500 μL PBS 的 1.5 ml 微量离心管中，并在室温下在摇杆上洗涤 1 小时。然后，将切片转移到单独的 1.5 mL微量离心管中，其中含有 500 μL PB 缓冲液和适当浓度的二抗和 DAPI。在室温下摇动孵育 1 小时，如果需要，样品可以在 4 摄氏度下储存长达 4 天，直到进一步处理。
成像前，将皮肤切片转移到含有 500 μL PBS 的单独微量离心管中，以洗涤二抗和 DAPI。然后将 22 毫升 x 50 毫升的盖玻片放在解剖显微镜下的深色背景上。接下来，使用切掉吸头末端的 1， 000 微升移液器，将一滴 100% 甘油添加到盖玻片上。
将皮肤切片从微量离心管转移到甘油液滴上。然后，在通过解剖显微镜观察时，使用尖头镊子小心地解开卷曲的皮肤切片，将其哄骗回漂浮在甘油中的自然形状。不要强行不自然地拉直切片，因为这可能会对组织造成损害。
一旦截面的整个长度正确定向并在盖玻片上压平。将组织安装在普通的显微镜载玻片上，此步骤将进一步拉直皮肤切片。在接下来的两天内对甘油安装的皮肤切片进行成像。
该图像显示了一个 10 微米厚的经典皮肤冷冻切片，用整合素 alpha 6 和整合素 α 8 标记，以分别可视化表皮隔室和导向菌毛肌。这个 100 微米厚的 3D 组织横截面以相同的方式标记。显示的图像是大型 z 堆栈的最大投影。
这里并排比较了两张图像的细节，在经典的冷冻切片中，用整合素 alpha 6 可视化的大多数毛囊没有沿整个长度切片，与水平整个安装相比，每个切片主要产生不完整的毛囊。完整的毛囊和完整的竖毛肌在经典和水平家庭安装部分都进行了量化。对生物复制的一个部分进行了量化，如图所示，整个坐骑部分具有较高比例的完整卵泡和竖毛肌。
一旦掌握，这种冷冻切片技术可以以每分钟超过 15 个切片的速度进行，同时如果安装正确，则可以获得完美定向的样品。观看此视频后，您应该对如何在 3D 环境中处理和分析厚组织横截面有很好的了解。
概述
本工作提出了一种新颖的处理和成像协议，用于厚厚的三维组织横断面分析，能够充分利用共聚焦成像模式。该协议保留抗原性，并代表了一个分析皮肤组织结构和潜在其他组织类型的稳健系统。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织学
- 成像技术
- 共聚焦显微镜
背景
- 标准的组织学技术可能无法保留组织的结构完整性。
- 共聚焦成像允许进行详细的三维分析。
- 需要稳健的协议来有效地分析组织。
- 本研究以皮肤组织为模型进行研究。
研究目的
- 开发一个维护皮肤抗原性和结构完整性的协议。
- 促进复杂的三维组织结构分析。
- 改进现有的组织学技术。
使用的方法
- 修剪和固定来自小鼠的皮肤样本。
- 使用冷冻切片机将组织切成100微米的切片。
- 用一抗和二抗进行免疫荧光标记。
- 使用共聚焦显微镜对组织切片进行成像。
主要结果
- 新的协议允许完整可视化毛囊和起毛肌。
- 整体安装切片显示完整结构的比例高于经典切片。
- 该技术可以快速进行，每分钟达到超过15个切片。
- 展示了组织学中三维分析的有效性。
结论
- 该协议是共聚焦成像组织处理的重大进步。
- 它增强了研究复杂组织结构的能力。
- 未来的应用可能会扩展到皮肤之外的其他组织类型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust three-dimensional tissue imaging is critical for accurate target validation and mechanistic de-risking in early-stage dermatological and tissue biology research. The horizontal whole mount protocol enables high-fidelity visualization of intact skin microarchitecture, supporting predictive confidence in phenotypic and cellular analyses. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical model development in skin and potentially other tissue systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular and structural targets within preserved three-dimensional tissue architecture.
- Supports biological de-risking by maintaining antigenicity and structural integrity for functional target validation.
- Improves predictive confidence in the assessment of mesenchymal and epithelial cell populations.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated thick tissue sections for downstream immunofluorescence and confocal imaging workflows.
- Enhances assay reproducibility and standardization by preserving intact tissue structures across samples.
- Provides quantitative outputs for intact hair follicles and arrector pili muscles, enabling reliable comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant tissue models by preserving complex skin microenvironments for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery imaging to preclinical validation of tissue-based endpoints.
- Reduces risk of artifactual findings by maintaining native tissue context in thick sections.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling high-content imaging and quantitative analysis of tissue architecture for target validation and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of intact cellular structures.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative studies and assay development.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as intact follicle and muscle counts for statistical analysis.
- Translational Research: Maintains disease-relevant tissue context for biomarker alignment and preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable to various tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based studies.
- Operational Value: Streamlines sample preparation, enhances reproducibility, and supports high-throughput sectioning.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative imaging data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on high-quality tissue analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and immunofluorescent labeling for optimal results.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical infrastructure.
- Benefits from cross-team standardization of sectioning and imaging protocols.
- Adaptable to other tissues with similar structural and antigenic preservation needs.
- Section thickness and orientation must be carefully controlled to ensure data consistency.
