水平整体封片：一种用于皮肤厚三维组织切片的新型制备与成像方案

本组织学与成像方案的总体目标是建立一个能够有效保持皮肤上皮抗原性及结构完整性的可靠系统，从而充分挖掘共聚焦成像技术的潜力。该方法有助于解答一些关键科学问题，特别是在需要分析复杂三维组织结构中各类细胞特性的情况下。与传统组织学技术相比，该技术的主要优势在于其可靠性高且操作简便。

此外，该方案可完美配合共聚焦显微镜中的三维分析。首先将从小鼠背部中线区域获取的皮肤修剪成矩形小块，每块的大小应能恰好放入冷冻模具底部。

此处展示的是适合放入一个22毫米×30毫米×20毫米冷冻模具中的1平方厘米背侧皮肤区域。固定后，将清洗过的皮肤推至OCT包埋模具底部，使其与底部平齐。在冷冻模具上标记毛囊的方向，因为这将决定冷冻切片机切片时的方位。

将冷冻块转移至置于-80摄氏度冰箱中的金属板上，以防止组织漂浮和移位。在冷冻过程中需密切观察，确保皮肤始终保持在冷冻模具的底部，因为不可见的气泡可能导致皮肤升至冷冻模具表面。首先，将已冻结的冷冻块固定在冷冻切片机的载物台上，其毛囊方向应与冷冻模具上所示的切面方向一致。

正确调整冰冻切片机上毛囊的精确方向至关重要，因为此步骤决定了切片平面，从而获得完整保留毛囊全长的皮肤切片。使用冰冻切片机切取100微米厚的切片。用镊子夹住包埋皮肤组织周围的OCT包埋剂，将切片从冰冻切片机中取出，转移至盛有PBS的100毫米培养皿中。

在室温下，PBS 会溶解 OCT 包埋剂，从而留下易于用镊子操作的皮肤切片。切片完成后，使用镊子将漂浮的皮肤切片转移至含有 2.5 毫升 PBS 的 12 孔板的孔中。首先向已标记的 1.5 毫升微量离心管中加入 500 微升 PB 缓冲液，以开始免疫荧光标记。

使用镊子小心地将皮肤切片从12孔板转移至用于封闭的离心管中。确保所有皮肤切片完全浸没。将微量离心管置于摇床上，以每分钟10次或更低的振荡频率，在室温下孵育1小时。

为每一片皮肤样本标记单独的1.5毫升微量离心管，并加入含有适量一抗的500微升PB缓冲液。封闭一小时后，将皮肤切片转移至新配制的、含有抗体的离心管中。将切片置于4摄氏度、低速摇床上过夜孵育。

第二天，将切片转移至含有 500 微升 PBS 的 1.5 毫升微量离心管中，在摇床上室温孵育一小时进行洗涤。随后，将切片分别转移至含有 500 微升 PB 缓冲液的 1.5 毫升微量离心管中，缓冲液中需加入适当浓度的二抗和 DAPI。室温下在摇床上孵育一小时；如有需要，样品可在 4 摄氏度保存最多四天，待后续处理。

成像前，将皮肤切片转移至含有 500 微升 PBS 的独立微量离心管中，以洗涤二抗和 DAPI。然后，在解剖显微镜下，将一块 22 毫米 × 50 毫米的盖玻片放置于深色背景上。接着，使用剪去末端的 1,000 微升移液枪，向盖玻片上加入一滴 100% 甘油。

将皮肤切片从微量离心管转移至甘油液滴中。然后，在体视显微镜下观察，用尖头镊子轻轻操作，使卷曲的皮肤切片在甘油中逐渐恢复至自然形态。切勿强行将切片拉直至非自然状态，以免对组织造成损伤。

当切片的整个长度在盖玻片上被正确放置并展平后，将其转移到普通显微镜载玻片上，此步骤将进一步拉直皮肤切片。在接下来的两天内，对甘油封片的皮肤切片进行成像。

该图像显示了一张经典的10微米厚皮肤冷冻切片，经整合素α6和整合素α8标记，分别用于显示表皮区室和立毛肌。这张100微米厚的三维组织横切面以相同方式进行了标记。所示图像为大型z轴堆叠图像的最大投影。

此处并排比较两张图像的细节，在经典的冷冻切片中，大多数通过整合素α6可视化出的毛囊并未沿其全长进行切片，导致每张切片中主要出现不完整的毛囊，而与之相比，水平全装片则能更好地保留完整性。在经典的切片和水平全装片中均对完整的毛囊及完整的立毛肌进行了定量分析。每个生物学重复取一张切片进行定量，如图所示，全装片切片中完整毛囊和立毛肌的比例更高。

一旦掌握，该冷冻切片技术可实现每分钟超过15个切片的制备速度，且若包埋操作正确，可获得完全正确定向的样品。观看本视频后，您应能够充分理解如何在三维环境中处理和分析厚组织横截面。