Name: 双色抗原微阵列产生的IgG和IgM自身抗体的同时检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学习使用双色抗原微阵列技术同时检测血清中的IgG和IgM自身抗体。该方法仅需微升级血清即可实现高通量筛选，适用于人类和小鼠样本的自身免疫疾病研究。

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A.C. 获得了加拿大心脏与中风基金会和再生医学培训项目（加拿大卫生研究院）提供的博士后奖学金支持。F.Y.Y.H. 得到了再生医学培训项目的支持。本研究由安斯泰来制药加拿大公司提供的资助支持。我们还要感谢多伦多大学的 Mark Menenghini 博士提供 Axon 微阵列扫描仪。

1. 抗原稀释与抗原微阵列的制备
<ol>
	<li>将抗原用 PBS 稀释至终浓度为 0.2 mg/ml。使用含 9 根针头的微阵列点样仪，以双份形式点样最多 162 种不同的抗原。在抗原文库中包含 IgG 和 IgM 抗原作为阳性对照，同时设置仅含 PBS 的阴性对照。</li>
	<li>向384孔源板中每孔加入20 µl的每种抗原。将抗原按与打印头设置相对应的分组方式加入源板中。例如，当使用9个点样针打印时，将抗原按每组9个进行排列。</li>
	<li>用铝箔覆盖源板，并在 -80 °C 冷冻，直至准备打印芯片阵列。</li>
	<li>将固体微阵列点样针置于去离子水中，于超声波清洗仪中孵育，每次1分钟，重复3次。将点样针放入支架中晾干，随后将其排列至微阵列打印头中。对于9根点样针，采用3×3排列方式。</li>
	<li>设置点样仪的打印程序，包括点样针数量、打印载玻片数量、每张载玻片上的点样区域数以及每种抗原的重复点样次数。通常使用9根针、70张载玻片、每张载玻片2个点样区域，每种抗原设置2个重复点样。编程控制点样仪在不同抗原组之间用水对点样针进行超声清洗。</li>
	<li>解冻源板，然后以 100 × g 离心 1 分钟。将源板放置于微阵列仪指定位置。移除即将点样第一组抗原上方的箔膜部分。</li>
	<li>将未打印的载玻片排列在点样仪表面，运行打印程序。在室温下进行打印，设置点样仪的湿度为55%–60%，并启用点样仪内置的加湿器。</li>
	<li>每次在所有载玻片上打印完一组抗原后，暂停微阵列仪。用铝箔覆盖已打印的抗原（防止蒸发），并揭开下一组待打印的抗原。继续运行打印程序。</li>
	<li>所有抗原点样完成后，用新的铝箔覆盖源板，并于 -80 °C 冻存。将点样后的芯片放入芯片盒中，真空密封。芯片可在次日使用，或于一个月内使用。</li>
</ol>
2. 使用稀释血清探测抗原微阵列
<ol>
	<li>使用孵育室将载玻片放入框架中。向每个芯片表面加入 700 µl 封闭缓冲液（含 2.5% [体积/体积] 胎牛血清（FCS）和 0.1% [体积/体积] Tween 20 的 PBS 溶液）。</li>
	<li>用粘性薄膜覆盖框架，并将其放入含有湿纸巾的密封容器中。在 4 °C 条件下于摇床上孵育过夜（O/N）。</li>
	<li>用封闭缓冲液将血清样本稀释 1:100。吸除芯片上的封闭液，向每个芯片表面加入 500 µl 稀释后的样本。</li>
	<li>用粘性薄膜覆盖，于 4 °C 在摇床上孵育 1 小时。</li>
	<li>用封闭缓冲液稀释二抗。对于人类研究，将 Cy3 标记的山羊抗人 IgG 抗体稀释至 0.33 µg/ml，将 Cy5 标记的山羊抗人 IgM 抗体稀释至 0.25 µg/ml。对于小鼠研究，将 Cy3 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体稀释至 0.38 µg/ml，将 Cy5 标记的山羊抗小鼠 IgM 抗体稀释至 0.7 µg/ml。</li>
	<li>吸除芯片上的样本，用洗涤缓冲液（含 0.1% Tween 20 的 PBS）冲洗芯片表面 4 次。将缓冲液倒在载玻片上，迅速甩去。</li>
	<li>向每个芯片表面加入 700 µl 封闭缓冲液，在室温下于摇床上孵育 10 分钟。重复该洗涤步骤两次。</li>
	<li>向每张载玻片表面加入 500 µl 稀释后的二抗，并用粘性薄膜覆盖。在 4 °C 条件下于摇床上孵育 45 分钟。</li>
	<li>吸除载玻片上的二抗混合物，按上述方法冲洗 4 次。再按上述方法用 700 µl 封闭/稀释缓冲液洗涤载玻片 3 次。</li>
	<li>将载玻片从框架中取出，放入浸没于 PBS 中的金属载玻片架中。在室温下以轨道振荡方式孵育 20 分钟。随后转移至新的 PBS 容器中，继续振荡孵育 20 分钟。</li>
	<li>将载玻片架置于去离子水中 15 秒。再将架转移至新的水容器中，继续孵育 15 秒。</li>
	<li>为干燥载玻片，将载玻片架置于离心机中的 ELISA 板适配器上，在室温下以 220 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将载玻片放入避光盒中，待扫描时使用。</li>
</ol>
3. 扫描抗原微阵列并导出数据
<ol>
	<li>使用能够检测 Cy3 和 Cy5 荧光信号的微阵列扫描仪扫描载玻片。为调整扫描仪的光电倍增管（PMT）水平，预先扫描仅用二抗探针处理过的载玻片。 
	注意：该载玻片应包含完整的抗原文库，包括阳性对照（IgG 和 IgM）以及阴性对照（PBS）。预扫描是一种低分辨率扫描，可帮助用户快速找到最佳的 PMT 设置。</li>
	<li>设置 PMT 值，使人类 IgG 特征（在 Cy3 通道）和人类 IgM 特征（在 Cy5 通道）具有相似的中位荧光强度减去背景值（MFI-B）（通常为 40,000）。通过点击 &#34;hardware&#34; 按钮来设置 PMT 值。一旦设定，保持这些 PMT 设置不变。</li>
	<li>通过点击 &#34;scan&#34; 按钮，在两个通道上扫描实验载玻片。每次扫描后保存载玻片图像（两个通道）。</li>
	<li>使用 &#34;file&#34; 按钮将待分析的载玻片载入微阵列软件中。</li>
	<li>使用 &#34;file&#34; 按钮加载基因阵列列表（GAL）文件。GAL 文件包含阵列布局及各阵列特征的身份信息。</li>
	<li>将阵列模板覆盖在扫描图像上，使阵列特征尽可能与模板对齐。</li>
	<li>点击 &#34;align&#34; 按钮，使所有区块中的特征与模板对齐。程序通常能识别圆形特征的轮廓，但可能需要进行一些手动调整。这些调整可通过进入特征模式完成。软件随后将计算每种抗原的 MFI-B 值。</li>
	<li>使用 &#34;file&#34; 按钮将这些结果导出为文本文件。</li>
</ol>
4. 使用微阵列显著性分析（SAM）分析阵列数据
<ol>
	<li>将各个文本文件导入 Excel，并确定包含 Cy3 和 Cy5 通道的 MFI-B 的列。</li>
	<li>计算重复特征值的平均值。</li>
	<li>对于任何负的 MFI-B 值，将其替换为 10；通过将原始 MFI-B 值除以 100，再计算以 2 为底的对数，对数据进行转换。</li>
	<li>使用微阵列显著性分析（Significance Analysis of Microarrays, SAM）对对数转换后的数据进行分析，方法如前所述7。</li>
	<li>对于包含两组的研究（例如，健康对照组与患者组），将其中一组标记为 &#34;1&#34;，另一组标记为 &#34;2&#34;。在 SAM 中使用两组非配对分析，以鉴定两组间抗原反应性存在显著差异的指标（q 值 &#60; 0.05）。</li>
	<li>使用聚类和热图生成软件制作用于展示的图像8。</li>
</ol>

<ol><li>Naparstek, Y., Plotz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in autoimmune disease.</a> Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).</li>
<li>Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+2015%3A+From+diagnostic+biomarkers+toward+prediction%2C+prognosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention.</a> Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).</li>
<li>Robinson, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+microarrays+for+multiplex+characterization+of+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+medicine%22%5BJournal%5D)">Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses.</a> Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).</li>
<li>Quintana, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarrays+identify+unique+serum+autoantibody+signatures+in+clinical+and+pathologic+subtypes+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).</li>
<li>Hueber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarray+profiling+of+autoantibodies+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+analysis+reveals+BAFF-binding+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).</li>
<li>Chruscinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Antigen+Microarrays+to+Screen+for+Autoantibodies+in+Heart+Failure+and+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation.</a> PloS one. 11, e0151224(2016).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+influenza+vaccine+immunogenicity+using+influenza+antigen+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays.</a> PloS one. 8, e64555(2013).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+profiles+of+broadly+neutralizing+anti-HIV-1+antibodies+are+distinct+from+those+of+pathogenic+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies.</a> Aids. 25, 1247-1257 (2011).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+humoral+rejection+of+human+kidney+allografts+associates+with+broad+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses.</a> Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).</li>
<li>Haddon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+epitopes+of+U1-70K+autoantibodies+at+single-amino+acid+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution.</a> Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).</li>
<li>Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of immunoglobulins.</a> J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案利用抗原微阵列技术对抗体进行定量检测。与传统的ELISA方法相比，抗原微阵列在自身抗体筛查中具有多项优势。首先，多种类型的抗原（包括核酸、蛋白质、多肽和细胞裂解物）均可固定于硝酸纤维素包被的载玻片上，从而实现对多种自身抗体的高通量同步筛查。此外，由于每个载玻片上仅需点样纳升级体积的抗原，因此制备微阵列仅需微克量级的抗原。该方法对患者样本的需求量也极低，在1:100的样本稀释比例下，仅需5 μl血清即可完成一次阵列表面的孵育检测。最后，已有研究表明，固定于硝酸纤维素膜上的微阵列在自身抗体检测中的灵敏度高于传统ELISA9。
除了使用抗原微阵列筛选自身抗体外，该阵列还可用于检测对非自身蛋白（例如，病毒蛋白）的反应性，确定单克隆抗体的特异性，以及如先前所述测量移植中非HLA抗体的水平9-12。抗原微阵列还可用于进行详细的表位定位实验，其中将单一蛋白的重叠肽段点样于固相载体上。最近一项研究采用该方法鉴定了系统性红斑狼疮患者自身抗体所靶向的U1-70K蛋白的表位13。
<p class="...

许多疾病状态下均存在自身抗体，且这些自身抗体常具有直接的致病活性1。鉴定自身抗体对于某些疾病的诊断、疾病预后的判断以及可能从特定治疗中获益的患者分类具有重要意义2。通常使用ELISA技术在患者血清中检测自身抗体；然而，利用该技术对多种抗原进行筛查时工作量大，且需要消耗大量患者样本。因此，亟需新技术以实现更大规模的自身抗体谱分析。
抗原微阵列技术是一种蛋白质组学技术，可实现对自身抗体的多重分析3。该过程的第一步是使用机器人微阵列仪将抗原文库点样到载玻片表面。将稀释后的血清与芯片杂交，然后加入荧光标记的二抗。通过微阵列扫描仪扫描芯片，根据荧光强度对自身抗体反应性进行可视化和定量。与ELISA技术相比，抗原微阵列在自身抗体筛查中具有多项优势：1）仅需几微升血清即可同时分析针对多种抗原的自身抗体；2）抗原用量极少，因每点仅需纳升级别的抗原；3）与ELISA相比具有更高的灵敏度3；4）可同时但独立地检测多种抗体同种型。抗原微阵列已被用于类风湿关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中的自身抗体谱型分析4-6。在这三种疾病中，均通过大规模微阵列自身抗体谱型分析获得了关于疾病发病机制的新认识。
本文介绍了一种使用硝酸纤维素包被载玻片制备抗原微阵列的实验方案。利用该技术，可将包括蛋白质、多肽和细胞裂解物在内的多种抗原固定于载玻片表面。通过在存放抗原文库的源板中加入感兴趣的抗原，可轻松定制所需的微阵列。此外，我们还展示了如何利用一对二抗在同一张载玻片表面区分IgG和IgM的反应性。目前，该技术已优化用于检测人和小鼠体内的自身抗体。

<table><tbody><tr><td>核糖体P0</td><td>Diarect</td><td>14100</td><td>用PBS稀释至0.2 mg/ml</td></tr><tr><td>人IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-003</td><td>用PBS稀释至0.2 mg/ml</td></tr><tr><td>人IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-012</td><td>用PBS稀释至0.2 mg/ml</td></tr><tr><td>小鼠IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5381</td><td>用PBS稀释至0.2 mg/ml</td></tr><tr><td>小鼠IgM</td><td>Biolegend</td><td>401601</td><td>用PBS稀释至0.2 mg/ml</td></tr><tr><td>双链DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>用PBS稀释至0.2 mg/ml</td></tr><tr><td>单链DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8899</td><td>用PBS稀释至0.2 mg/ml</td></tr><tr><td>微阵列点样仪</td><td>Virtek</td><td>VersArray Chipwriter Pro</td><td>多种类型的点样仪均适用</td></tr><tr><td>实心打印针</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SSP015</td><td></td></tr><tr><td>机器人微阵列点样仪软件</td><td>Virtek</td><td>Chipwriter Pro&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FAST载玻片（2孔垫）</td><td>GVS Northa America</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>FAST框架</td><td>GVS Northa America</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>FAST孵育室（2孔垫）</td><td>GVS Northa America</td><td>10486242</td><td></td></tr><tr><td>384孔板</td><td>Whatman</td><td>7701-5101</td><td></td></tr><tr><td>板封膜机</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>铝箔板盖</td><td>VWR</td><td>60941-124</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Cy3标记的山羊抗人IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-165-096</td><td>使用50%甘油中的工作液</td></tr><tr><td>Cy5标记的山羊抗人IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-175-129</td><td>使用50%甘油中的工作液</td></tr><tr><td>Cy3标记的山羊抗小鼠IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-165-071</td><td>使用50%甘油中的工作液</td></tr><tr><td>Cy5标记的山羊抗小鼠IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-175-075</td><td>使用50%甘油中的工作液</td></tr><tr><td>微阵列扫描仪</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon 4200A</td><td></td></tr><tr><td>微阵列软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Genepix 6.1</td><td></td></tr><tr><td>聚类分析软件</td><td>eisenlab.org</td><td>Cluster 3.0</td><td></td></tr><tr><td>热图软件</td><td>eisenlab.org</td><td>Treeview 1.60</td><td></td></tr><tr><td>微阵列统计分析软件</td><td>Stanford University</td><td>SAM 4.0（微阵列显著性分析）</td><td></td></tr></tbody></table>

同时检测igg和igm自身抗体的双色抗原微阵列的制备

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

自身抗体是针对自身抗原的抗体，在多种疾病状态下存在，并可作为疾病活动性的标志物。针对特定抗原的自身抗体水平通常采用酶联免疫吸附试验（ELISA）技术进行检测。然而，使用ELISA对多种自身抗体进行筛查可能耗时较长，并需要大量患者样本。抗原微阵列技术是一种可替代的方法，能够以多重方式对自身抗体进行筛查。在该技术中，利用机器人微阵列点样仪将抗原点样于特殊涂层的显微镜载玻片上。将载玻片与患者血清样本孵育后，加入荧光标记的二抗，以检测血清中自身抗体与抗原的结合情况。通过荧光信号扫描仪对载玻片进行扫描，从而揭示并定量自身抗体的反应性。本文描述了定制抗原微阵列的构建方法。我们目前的阵列使用9个固相针打印，最多可包含162种抗原，每种抗原均重复点样两次。通过更换微阵列点样仪所用源头板中的抗原，可轻松实现阵列的定制化。我们开发了一种双色二抗检测方案，可在同一载玻片表面区分IgG和IgM的反应性。该检测系统已优化用于研究人和小鼠自身抗体的结合特性。

抗原被排列在384孔板中，并由机器人微阵列点样仪打印到载玻片上，如图1所示。图2展示了放置在带有孵育腔室框架中的载玻片以及处理后的扫描载玻片。图3展示了阳性和阴性对照载玻片。阴性对照载玻片仅使用二抗进行探针检测，而阳性对照载玻片则使用系统性红斑狼疮患者的血清进行探针检测。通过使用两种分别标记的二抗，可在同一张载玻片表面区分IgG和IgM的反应性。图4展示了在广泛血清稀释度范围内，IgM抗体针对单链DNA（ssDNA）以及IgG抗体针对核糖体P蛋白（Ribo P）的荧光强度。本实验中使用了已知对Ribo P具有反应性的系统性红斑狼疮患者的阳性对照血清。在所有血清稀释度下，IgM通道均呈现线性响应；IgG通道在MFI-B值达到约30,000之前也呈现线性响应。超过该点后，信号开始饱和，抗Ribo P抗体浓度的增加不再引起MFI-B值的相应升高。图5展示了如何利用该阵列检测人血清中的类风湿因子。本研究中使用了来...

本文介绍一种可生成定制化抗原微阵列的方法，可用于同时检测人和小鼠血清中的IgG和IgM自身抗体。该阵列可实现针对任何目标抗原或表位的抗体高通量、定量检测。

同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备

自身抗体是针对自身抗原的抗体，存在于多种疾病状态中，可作为疾病活动的标志物。其水平……

该技术的总体目标是以多重方式快速筛选自身抗体。该方法有助于阐明自身免疫领域的关键问题，例如哪些自身抗体与不同的疾病状态相关。该技术的主要优势在于可同时平行筛选多种自身抗体，仅需微升级别的血清样本以及微克级别的抗原。为制备抗原微阵列，首先将抗原用 PBS 稀释至终浓度为 2 毫克/毫升。设置微阵列点样仪的配置，使用九针点样头，以每个抗原重复点样的方式打印最多 162 种不同的抗原。在抗原文库中包含 IgG 和 IgM 抗原作为阳性对照。仅以 PBS 作为阴性对照。将每种抗原各 20 微升，按照与打印头设置相对应的分组方式加入 384 孔源板中。用铝箔覆盖源板，并在 -80 °C 冻存，直至准备打印芯片阵列。将固体微阵列针头置于去离子水中，于超声波清洗仪中孵育，每次一分钟，重复三次。将针头放入支架中晾干。然后将针头排列至微阵列打印头中。对于九针，使用三乘三的排列方式。接下来，通过设置打印头上的针数、待打印的载玻片数量、每张载玻片上的点阵数以及每种抗原的重复点样次数，对微阵列点样仪进行程序设定。此外，还需编程使微阵列点样仪在不同抗原组之间用清水对针头进行超声清洗。接下来，将源板解冻后，在100 × g 条件下离心1分钟。将源板放置于微阵列仪指定位置，然后揭去将要打印的第一组抗原上方的箔膜。将未打印的载玻片排列在阵列仪表面，运行打印程序。在室温下进行打印，阵列仪内湿度设定为55%至60%。每完成所有载玻片上第一组抗原的打印后，暂停微阵列仪。用铝箔覆盖刚刚点样的抗原，防止蒸发，并揭开下一组待点样的抗原。然后继续运行打印程序。所有抗原点样完成后，用新的铝箔覆盖源板，并在负80摄氏度下冷冻保存。将打印好的载玻片放入载玻片盒中，并进行真空密封。载玻片可在次日使用，或在一个月内使用。若需使用孵育槽以稀释血清探针杂交微阵列，请将载玻片装入框架中。然后向每个芯片表面加入700微升封闭缓冲液。将粘性封膜覆盖在框架上，放入含有湿纸巾的密封容器中。随后将芯片置于4摄氏度摇床上孵育过夜。次日，用封闭缓冲液将血清样本稀释至1:100。然后吸去芯片上的封闭液，每张芯片表面加入500 µL稀释后的样本。接着用封口膜覆盖芯片，并在4°C条件下轻轻摇动孵育一小时。然后，从芯片上吸除血清样本，并通过将洗涤缓冲液倒入载玻片并迅速甩去的方式，重复冲洗芯片表面四次。每次使用700 µL封闭缓冲液洗涤每个芯片表面，并在室温下轻轻摇动孵育10分钟。随后，向每张载玻片表面加入500 µL稀释的二抗溶液，并用粘性封膜覆盖。将切片置于4°C，摇床上孵育45分钟。孵育结束后，吸去切片上的二抗混合液，并按前述方法清洗四次。随后，用700 µL封闭稀释缓冲液洗涤切片，每次10分钟，共洗三次。从载玻片架中取出载玻片，放入金属载玻片架中，并浸入 PBS 中。在室温下以旋转振荡孵育 20 分钟。将载玻片架置于去离子水容器中 15 秒。然后将架板放入新的盛水容器中，再孵育15秒。干燥载玻片时，将载玻片架置于离心机中的ELISA板适配器上，在220 × g、室温条件下离心5分钟。将载玻片放入避光盒中，直至准备扫描。扫描玻片时，使用能够检测SI三和SI五荧光信号的微阵列扫描仪。通过预扫描一张仅用二抗孵育的完整抗原文库玻片，确定最佳的光电倍增管（PMT）设置。按下硬件按钮设定PMT值，使SI三通道上的人IgG特征信号与SI五通道上的人IgM特征信号具有相似的中位荧光强度减去背景值（MFIB），该值通常为40,000。接下来，按下扫描按钮，在两个通道中扫描实验载玻片。每次扫描后，保存两个通道的载玻片图像。使用文件按钮，将待分析的载玻片加载到微阵列软件中。然后，使用文件按钮加载基因芯片列表（GAL 文件），该文件包含芯片的布局以及芯片上各特征点的标识信息。将芯片模板覆盖在扫描图像上，使芯片上的特征点与模板尽可能对齐。按下对齐按钮，使所有区块中的特征点与模板对齐。软件将随后计算每种抗原的平均荧光强度减去背景值。最后，使用文件按钮将结果导出为文本文件，并根据文本协议分析数据。在本图中，显示了阳性和阴性对照切片，阴性对照切片仅用二抗进行孵育，阳性对照切片则用系统性红斑狼疮患者血清进行孵育。如图所示，已知对核糖体P蛋白（riboP）具有反应性的阳性对照血清显示出抗单链DNA的IgM抗体以及抗riboP的IgG抗体。IgM在所有血清稀释度下均呈现线性反应，而IgG的反应则呈线性，直至MFI减去背景值达到约30,000。在本实验中，芯片使用一名患有冷球蛋白血症性血管炎且已知存在类风湿因子（一种针对IgG的IgM抗体）的患者的血清进行探查。由于患者血清中的IgM结合到芯片上固定的IgG，IgG特征呈现黄绿色。单独使用二抗时，未见IgM对芯片上点样的IgG产生反应性。图中显示，点样在芯片上的小鼠IgM和IgG仅分别通过抗小鼠IgM和IgG的二抗检测到。该图显示了使用微阵列分析软件将模板网格与扫描的阵列图像进行对齐。对齐后，可对阵列的各个特征进行分析，以获得每个特征的中位荧光强度减去背景值。一旦掌握，若操作得当，抗原微阵列的检测可在四小时内完成。完成此操作后，可进一步采用其他技术（如酶联免疫吸附试验）来验证抗原微阵列所获得的结果。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备抗原微阵列、如何使用血清对抗原微阵列进行探查，以及如何使用扫描仪对抗原微阵列进行扫描。请务必注意，操作人血清可能存在生物危害，因此在执行本操作时应采取普遍性防护措施。

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科研

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免疫学与感染

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同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备

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