双色抗原微阵列产生的IgG和IgM自身抗体的同时检测
2016年9月15日
我们在这里描述了一种生成可定制抗原微阵列的方法，该方法可用于同时检测人类和小鼠的血清 IgG 和 IgM 自身抗体。这些芯片可对针对任何抗原或目标表位的抗体进行高通量和定量检测。
该技术的总体目标是以多重方式快速筛选自身抗体。这种方法可以帮助确定自身免疫领域的关键问题，例如哪些自身抗体与不同的疾病状态相关。该技术的主要优点是可以平行方式筛选自身抗体，只需要微升血清，只需要微克抗原。
要生成抗原微阵列，首先在 PBS 中将抗原稀释至终浓度为 2 毫克/毫升。设置具有 9 个针脚的微型阵列仪配置，以一式两份打印多达 162 种独特抗原。将 IgG 和 IgM 抗原作为阳性对照包含在抗原文库中。
仅包括 PBS 作为阴性对照。将 20 微升每种抗原添加到 384 孔源板中，分组反映打印头的设置。使用铝箔覆盖源板，并在零下 80 摄氏度下冷冻板，直到准备好打印阵列。
通过将固体微阵列针在含有去离子水的超声处理浴中孵育 3 次，每次 1 分钟来清洁它们。将销钉放在架子上晾干。然后排列微阵列打印头中的针脚。
对于 9 个引脚，请使用 3 x 3 配置。接下来，通过设置打印头上的针数、要打印的载玻片数、每张载玻片上的焊盘数以及每种抗原的复制点数，对微阵列仪进行编程以进行打印运行。此外，对微阵列仪进行编程，以在水中对不同抗原组之间的针进行超声处理。
接下来，解冻源板后，以 100 次离心 1 分钟 G.将源板放在显微阵列仪的指定位置，然后去除覆盖第一组待打印抗原的箔片。将未打印的玻片排列在阵列仪表面并运行打印程序。在室温下打印载玻片，将阵列仪上的湿度设置为 55% 至 60%在所有载玻片上打印每组抗原后，暂停显微阵列仪。
用箔纸覆盖刚刚打印的抗原以防止蒸发，并揭开下一组要打印的抗原。然后，继续打印程序。打印完所有抗原后，用一块新箔纸覆盖源板，并在零下 80 摄氏度下冷冻。
将打印的玻片放入载玻片盒中，并真空密封。玻片可以在第二天使用，也可以在一个月后使用。要使用孵育室用稀释的血清探测微阵列，请将载玻片放入框架中。
然后向每个阵列表面添加 700 微升封闭缓冲液。将胶膜放在框架上，然后用一张湿纸巾将其转移到密封的容器中。然后，将载玻片在 4 摄氏度下在摇床上孵育过夜。
第二天，在封闭缓冲液中将血清样品稀释 1 至 100。然后从阵列中吸出封闭溶液，并向每个阵列表面添加 500 μL 稀释的样品。接下来，用胶膜覆盖阵列，并在 4 摄氏度下孵育，同时摇动 1 小时。
然后，从阵列中吸出血清样品，使用冲洗缓冲液冲洗阵列表面四次，方法是将缓冲液倒在载玻片上并快速弹开。使用 700 μL 封闭缓冲液清洗每个阵列表面，并在室温下摇动孵育 10 分钟。然后，向每个玻片表面添加 500 μL 稀释的二抗，并用胶膜覆盖。
将玻片在 4 摄氏度下摇动孵育 45 分钟。孵育后，从载玻片中吸出二抗混合物并冲洗四次，如刚才所示。然后，用 700 μL 封闭稀释缓冲液洗涤玻片，3 次，每次 10 分钟。
从框架中取出载玻片，然后将它们放入金属载玻片架中，并将它们浸入 PBS 中。在室温下孵育，并进行轨道振荡 20 分钟。将玻片架放入装有去离子水的容器中 15 秒钟。
然后将架子放入新的盛有水的容器中，再孵育 15 秒。要干燥玻片，请将玻片架放在离心机中的 ELISA 板适配器上，并在 220 倍 G 和室温下旋转 5 分钟。将载玻片放入密闭的盒子中，直到准备好进行扫描。
要扫描载玻片，请使用可以检测 SI 3 和 SI 5 荧光信号的微阵列扫描仪。通过预扫描仅用二抗探测的完整抗原文库玻片，确定最佳倍增管或 PMT 设置。通过按下硬件按钮设置使用的 PMT 值，以便 SI 3 通道上的人 IgG 特征和 SI 5 通道上的人 IGM 特征具有相似的中位荧光强度减去背景或 MFIB，通常为 40， 000。
接下来，按下扫描按钮扫描两个通道上的实验载玻片。每次扫描后，将载玻片图像保存在两个通道中。使用文件按钮，将要分析的载玻片加载到微阵列软件中。
然后，使用文件按钮加载基因阵列列表或 GAL 文件，其中包含阵列的布局以及阵列特征的身份。将阵列模板放在扫描的图像上，以便阵列特征尽可能与模板匹配。按下对齐按钮，将所有块中的特征与模板对齐。
然后，该软件计算每种抗原的 MFI 减去背景。最后，使用 file 按钮将结果导出为文本文件，并根据文本协议分析数据。在该图中，显示了阳性和阴性对照玻片，阴性玻片仅用二抗探测，阳性对照玻片用系统性红斑狼疮患者的血清探测。
如此处所示，已知对 riboP 具有反应性的阳性对照血清显示具有针对单链 DNA 的 IgM 抗体和针对 riboP 的 IgG 抗体。在所有血清稀释液中观察到 IgM 的线性反应，IgG 的 MFI 负背景约为 30， 000。在本实验中，用冷球蛋白血症性血管炎患者的人血清探测芯片，该芯片具有记录的类风湿因子，这是一种抗 IgG 的 IgM 抗体。
由于患者血清中的 IgM 与芯片上固定的 IgG 结合，IgG 特征呈黄绿色。单独使用二抗，对阵列上发现的 IgG 没有 IgM 反应性。如图所示，在阵列上点样的小鼠 IgM 和 IgG 仅分别用抗小鼠 IgM 和 IgG 的二抗检测。
该图显示了使用微阵列分析软件在扫描阵列图像上模板网格的对齐情况。对齐后，可以分析阵列特征以获得每个特征的中位荧光强度减去背景。一旦掌握，如果作得当，抗原微阵列的探测可以在 4 小时内完成。
在此程序之后，可以执行其他技术，例如 ELISA，以验证从抗原微阵列获得的结果。看完这个视频，您应该对如何打印抗原微阵列、如何用血清探测抗原微阵列以及如何用扫描仪扫描抗原微阵列有了很好的了解。不要忘记，使用人血清可能是危险的，因此在执行此程序时应采取普遍的预防措施。
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概览
本文描述了一种生成可定制抗原微阵列的方法，该方法能够同时检测人类和小鼠的血清IgG和IgM自身抗体。该技术能够对多种抗原或表位进行高通量和定量抗体检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 自身免疫
- 免疫学
- 高通量筛选
背景
- 自身抗体在自身免疫疾病中起着至关重要的作用。
- 识别特定的自身抗体可以与不同的疾病状态相关联。
- 传统方法在通量和敏感性方面可能受到限制。
- 该方法允许同时分析多种自身抗体。
研究目的
- 开发一种快速筛选自身抗体的技术。
- 识别自身抗体与疾病状态之间的相关性。
- 提高微阵列使用的抗体检测效率。
使用的方法
- 将抗原在PBS中稀释至2 mg/mL的浓度。
- 设置带有九个针头的微阵列仪，用于印刷抗原。
- 包含IgG和IgM抗原作为阳性对照。
- 仅使用微升级的血清进行自身抗体筛选。
主要结果
- 成功生成用于自身抗体检测的抗原微阵列。
- 展示了筛选的高通量能力。
- 对各种抗原的抗体进行定量评估。
- 有潜力识别与自身免疫疾病相关的关键自身抗体。
结论
- 开发的方法增强了筛选自身抗体的能力。
- 它为自身免疫的进一步研究提供了平台。
- 该技术可能导致自身免疫疾病诊断工具的改进。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables multiplexed detection of IgG and IgM autoantibodies using minimal sample volumes, supporting early-stage target validation in autoimmune disease research. By providing quantitative, parallel readouts of autoantibody reactivity, it enhances predictive confidence in biomarker discovery and reduces reliance on low-throughput ELISA workflows. The two-color detection system improves assay efficiency and data consistency for immunoprofiling applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by profiling autoantibody reactivity against multiple antigens in parallel.
- Operational Value: Reduces sample consumption to microliters of serum, preserving limited clinical specimens for downstream analysis.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through simultaneous detection of IgG and IgM isotypes, clarifying immune complex formation mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible microarray slides with duplicate antigen spots for reliable signal quantification.
- Operational Value: Facilitates assay scalability through robotic printing of up to 162 antigens per slide, enabling high-content screening campaigns.
- Scientific Value: Produces quantitative MFI minus background readouts that allow comparison of autoantibody titers across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables cross-species applicability with validated detection of both human and murine autoantibodies, supporting translational model consistency.
- Operational Value: Allows long-term storage of printed slides (up to one month), facilitating batch-to-batch assay reproducibility in preclinical studies.
- Scientific Value: Provides a platform for identifying autoantibody signatures linked to disease states, informing patient stratification strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, offering a reusable platform for immunoprofiling prior to functional assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling rapid screening of autoantibody reactivity patterns associated with disease phenotypes.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation and dual-isotype detection, ensuring consistent reagent performance.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts (MFI minus background) that enable statistical comparison of antigen-specific responses.
- Translational Research: Connects discovery-phase autoantibody profiling to preclinical validation through cross-reactive detection in human and mouse systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a customizable microarray platform where antigen libraries can be rapidly reconfigured for new target panels without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through multiplexed, parallel detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility via standardized printing, blocking, and washing steps that minimize technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early immunological risk assessment in autoimmune target programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on autoantibody prevalence and isotype distribution across sample cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray printing, serum handling, and fluorescence scanning instrumentation.
- Dependent on access to a robotic microarrayer with sonication capability and a dual-channel fluorescent scanner.
- Necessitates standardization of serum dilution, blocking buffer composition, and incubation conditions across users.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different antigen sources or species-specific secondary antibodies.
- Limited by the need for optimized PMT settings to balance IgG (SI three) and IgM (SI five) channel signals for accurate quantification.
