使用流感抗原微阵列测量病毒亚型血清抗体的广度

我们提出了一种使用通过将流感抗原打印到硝基纤维素涂层幻灯片上构建的蛋白质微阵列的协议,以同时针对来自不同病毒株的 250 多种抗原检测血清的多种抗体等型,从而允许测量病毒亚型血清抗体的广度。

流感抗原微阵列允许同时测量多种抗体等型，从只有一微升的小血样量中对300多种流感菌株进行检测。微阵列有助于在流感菌株的抗原环境中对流感抗体的广度进行高通量测量。通过更详细地描述流感抗体，这种微阵列可以帮助确定为什么某些人会感染流感，而另一些人则不会感染。

抗原微阵列技术已应用于我们实验室的35种不同的病原体，能够对6万种抗原靶点和从全球传染病病例和健康控制收集的5万个血清样本中测量抗体。通过亲自研讨会教授此技术后，我们发现能够直观地演示该技术对于其理解和性能至关重要。演示这个程序的将是阿尔·贾辛斯卡斯和拉斐尔·德·阿西斯，我们实验室的项目科学家。

要使用微阵列打印机打印抗原，请选择具有低容量微阵列斑点引脚的打印机，该针脚可将 384 井源板中的抗原吸进样品通道，然后通过直接接触和毛细管作用将抗原沉积到 16 垫硝基纤维素涂层玻璃幻灯片上。在打印软件中，输入将在印版文本框数中使用的样品板数，然后选择将用于分析的印版类型。选择引脚配置，并将原点偏移设置为幻灯片原点与打印引脚将在幻灯片上开始打印的位置之间的距离。

在阵列设计选项卡下，定义阵列的大小和形状，并选择打印引脚如何拾取和分配样品的参数。配置引脚清洁和印迹协议，并定义将示例块打印到幻灯片上的顺序。阵列软件将构建一个带注释的网格索引文件，以描述每个微阵列中抗原的排列。

使用所需的协议对打印软件进行编程后，开始打印运行。完成后，在室温下将未编程微阵列幻灯片放在干燥器机柜中的防光盒中。要探测微阵列上的血清中抗体，请使用夹子将微阵列幻灯片板侧上连接到探测室，然后将腔室放在框架中。

组装幻灯片时要小心，因为它们很容易损坏，并在补液后检查是否有泄漏。如有必要，拆卸并重新组装幻灯片以修复泄漏。每井用 100 微升过滤阻塞缓冲液重新水合幻灯片，并在每个样品 100 微升的阻塞缓冲液中以 1 比 100 的比例稀释血清。

然后，在室温下孵育补水微阵列幻灯片和稀释的血清30分钟，在轨道摇床上每分钟旋转100至250次。在孵化结束时，使用与二次收集烧瓶连接的真空管尖端，从每个腔室的一角小心地吸出阻塞缓冲液，而不接触焊盘，并立即将稀释的血清添加到垫片中，而不允许焊盘干燥。然后，将覆盖的框架放在装有湿纸巾的托盘中，以保持湿度，并在摇床上孵育框架，在四摄氏度下过夜。

对于量子点结合的二次抗体标签，仔细吸气的血清，正如刚刚演示的，并用三洗在100微升新鲜TBS缓冲液每孔5分钟的轨道摇床。然后，用量子点结合的二级抗体的混合物孵育幻灯片，然后像协议中描述的那样洗涤三次，使用与刚才演示的相同技术。最后一次洗涤后，小心地将滑梯从腔室中取下，然后用过滤过的双蒸馏水轻轻冲洗幻灯片，然后将每个滑梯放在 50 毫升的管子中。

然后，通过离心干燥幻灯片。要获取微阵列幻灯片的图像，请先打开便携式成像器，然后小心地将幻灯片朝下放入成像室中的幻灯片支架中。打开映像软件，并在配置成像器选项卡下，选择适当的幻灯片配置。

在图像控制选项卡下，选择适当的荧光通道，并根据 Sera 的活性调整曝光和采集时间。然后，单击"捕获"开始图像采集。在采集结束时，使用面向基准标记的网格来检测阵列点。

要测量点强度，请在文件信息面板中上载 gal 文件，并指定要在分析选项部分中保存分析输出文件的文件夹。在图像控制选项卡下，打开要量化的已获取图像之一并选择自动图像。在数组分析部分中，按照软件的指示创建基准模板。

单击批处理分析以选择包含要量化的图像的文件夹，然后选择刚刚创建的基准模板。该软件将分析每个图像并量化点强度。然后，分析原始数据，比较抗原和血清样本之间的抗体结合。

在这项具有代表性的研究中，使用的二级抗体分别是山羊抗人类IgG与800纳米量子点结合，山羊抗人类IgA结合量子点，以585纳米发射，用于多路复用检测IgG和IgA抗体。在生成的热图中，只有具有高表示的临床相关子类型被标记以节省空间，加号表示所有剩余子类型较高的数字。血清IgA和IgG按其血凝素和神经氨酸酶分子形式和亚型进行分组。

证明临床亚型的红蛋白头组抗体的高特异性，以及全下亚糖蛋白和三元化全红蛋白抗体的高交叉反应性，并纳入库存区域。在微阵列上测量的流感抗体反应可以通过传统技术得到确认，包括凝水抑制和微中分检测。该技术对流感头组抗体的亚型特异性以及IgA和IgG抗体对流感易感性的相对重要性产生了深入的见解。

虽然这些材料都不是极其危险的，但所有人体血清样本都应按照机构生物安全协议进行处理。