使用流感抗原微阵列测量血清抗体对不同病毒亚型的广度

流感抗原微阵列技术能够利用仅一微升的少量血样，同时检测针对超过300种流感毒株的多种抗体同种型。该微阵列可高通量地测量流感抗体在不同流感毒株抗原谱系中的广度。通过比以往更为详细地表征流感抗体，该微阵列有助于阐明为何某些人会感染流感而另一些人则不会。

抗原微阵列技术已在我们的实验室中应用于35种不同的病原体，能够检测来自全球传染病病例和健康对照者的50,000份血清样本中针对60,000个抗原靶标的抗体。通过线下培训班讲授该技术的过程中，我们发现能够直观地演示该技术对于理解与操作至关重要。本次操作演示将由本实验室的项目科学家Al Jasinskas和Rafael De Assis完成。

使用微阵列打印机打印抗原时，应选择配备低体积微阵列点样针的打印机，该点样针可从384孔源板中吸取抗原进入样品通道，并通过直接接触和毛细作用将抗原点样至16-pad硝酸纤维素包被的玻片上。在打印软件中，在“板数量”文本框中输入将使用的样品板数量，并选择用于分析的板类型。选择针头配置，并将原点偏移量设置为玻片原点与点样针在玻片上开始打印位置之间的距离。

在阵列设计选项卡下，定义阵列的大小和形状，并设置打印针吸取和分配样品的参数。配置针头清洗和吸干程序，并定义样品块在载玻片上打印的顺序。阵列软件将生成一个带注释的网格索引文件，以描述每个微阵列中抗原的排列情况。

在打印软件中设置好所需的程序后，启动打印运行。完成后，将未探针的微阵列芯片置于室温下的干燥柜中避光保存。为了在微阵列上检测血清中的抗体，使用夹子将微阵列芯片正面朝上固定在探针反应室上，并将反应室放入框架中。

组装载玻片时需小心，因为它们容易破碎，并在重悬后检查是否有泄漏。如有必要，可拆开并重新组装载玻片以修复泄漏。每孔加入100 µL过滤后的封闭缓冲液对载玻片进行重悬，并在每份样品100 µL封闭缓冲液中按1:100的比例稀释血清。

然后，将重悬的微阵列芯片和稀释的血清在室温下置于旋转摇床中，以每分钟100至250转的速度孵育30分钟。孵育结束后，使用连接真空泵并带有二级收集瓶的移液器吸头，从每个反应室的角落小心吸除封闭缓冲液，避免接触芯片垫，随后立即向芯片垫上加入稀释的血清，注意防止芯片垫干燥。接着，将带有盖板的框架放入装有湿润纸巾并密封以保持湿度的托盘中，并在4摄氏度下于摇床中过夜孵育。

对于量子点偶联的二抗标记，小心吸出如上所述的血清，并在轨道摇床上用新鲜的TTBS缓冲液对切片进行洗涤，每孔每次100 µL，每次5分钟，共洗三次。然后将切片与量子点偶联的二抗混合物孵育，之后按照方案中所述方法用相同技术再洗三次。最后一次洗涤后，小心地将切片从孵育 chamber 中取出，用滤过的双蒸水轻轻冲洗，然后将每张切片放入一个50 mL离心管中。

然后，通过离心干燥载玻片。为了获取微阵列载玻片的图像，首先打开便携式成像仪，小心地将待成像的载玻片正面朝下放入成像室的载玻片架中。打开成像软件，在“配置成像仪”选项卡下选择合适的载玻片配置。

在图像控制选项卡下，根据血清的反应性选择合适的荧光通道，并调整曝光时间和采集时间。然后，点击“捕获”以开始图像采集。采集结束后，使用以定位标记为基准的网格来识别芯片上的阵列点。

为了测量点阵强度，在文件信息面板中上传 gal 文件，并在分析选项部分指定用于保存分析输出文件的文件夹。在图像控制选项卡下，打开一张已获取的待定量图像并选择自动模式。在阵列分析部分，根据软件的指示创建一个定位标记模板。

单击批量分析，选择包含待定量图像的文件夹，并选择刚刚创建的定位标记模板。软件将分析每张图像并量化斑点强度。然后，分析原始数据，以比较不同抗原间以及不同血清样本间的抗体结合情况。

在本项代表性研究中，所用的二抗分别为与发射波长为800纳米的量子点偶联的羊抗人IgG抗体，以及与发射波长为585纳米的量子点偶联的羊抗人IgA抗体，用于IgG和IgA抗体的多重检测。在生成的热图中，仅标注了具有较高代表性的临床相关亚型，以节省空间，其中加号表示其余数量较多的亚型。血清IgA和IgG根据其血凝素和神经氨酸酶的分子形式及亚型进行分组。

为了展示血凝素头部区域抗体对临床亚型的高特异性，以及包含茎区的全长血凝素和三聚化全长血凝素抗体所具有的高交叉反应性。微阵列上检测到的流感抗体反应可通过传统技术加以验证，包括血凝抑制试验和微量中和试验。该技术已加深了我们对流感病毒头部区域抗体亚型特异性的理解，并揭示了IgA和IgG抗体在流感易感性中的相对重要性。

尽管这些材料均无极高危险性，但所有人血清样本均应按照所在机构的生物安全规程进行操作。