研究蛋白质的质量控制体系Ð。菌使用温控活细胞成像
2016年12月2日
社会变形虫 Dictyostelium disccoideum 最近被建立为研究蛋白质错误折叠和蛋白质稳态的系统。在这里，我们描述了一种新的基于成像的方法，用于研究温度诱导的蛋白质聚集和盘状芽孢杆菌中的细胞应激反应。
这种成像技术的总体目标是观察盘基网柄菌细胞中热应激诱导的细胞扰动。该方法有助于了解盘状网柄网阿米巴中热应激反应和蛋白质质量控制的机制。该技术的主要优点是可以严格精确地控制应用于细胞文件成像的温度。
要开始该过程，请按照文本协议中的详细说明准备 Dictyostelium 细胞。成像前一天，将细胞分液至每毫升 10， 000 个细胞的低荧光培养基中。成像前，从 LFM 中的组织板中收获细胞，然后将足够数量的细胞转移到玻璃底培养皿中。
让细胞沉降 20 分钟，然后小心地用新鲜培养基替换用过的培养基，以去除未沉降的细胞。在 23 摄氏度的非应力条件下，成像单元至少获得六个视场。以 1 到 0.25 微米的步长采集最大 7 微米的 Z 轴堆栈，以捕获细胞的整个体积。
然后获取参考明场图像以评估细胞总数。接下来，将冷却室的温度调节到 30 摄氏度。温度显示达到所需值后，在明场通道中手动重新聚焦。
在开始延时摄影之前检查所有记录的 FOV，然后开始延时摄影 4 小时的热应激，时间点之间的时间间隔为 5 到 10 分钟。检查以确保在采集前两个时间点时对焦正确。热应激完成后，将温度降低回 23 摄氏度。
等待温度显示手动调整和重新对焦。然后以 10 到 20 分钟的时间间隔在恢复阶段录制延时短片 8 到 10 小时。检查以确保在采集第一个时间点时对焦正确。
首先打开配备 Cell Counter 插件的图像处理包。通过单击 File （文件），然后单击 Open （打开） 来加载明场图像堆栈。接下来，打开 Cell Counter 插件，单击 Initialize 加载图像堆栈。
通过单击相应的框来选择计数器的类型。在此之后，计算单元格的总数，通过单击保存标记 保存标记.保存标记后，加载荧光图像超堆栈的最大投影。
打开 Cell Counter 插件，然后单击 Load Marker 加载标记。接下来，选择胞质病灶的标记类型并对细胞进行计数。现有标记可用作单个单元格位置的指南。
单击 Results 检索每个切片的计数数，然后将计数保存在其他位置以供进一步计算。在本研究中，在 Dictyostelium 细胞中观察到 GFP 标记的聚谷氨酰胺蛋白 Q103 的分布。在正常生长条件下，Q103-GFP 弥漫分布在细胞质中。
在热应激期间，Q103-GFP 标志物聚结成点状结构。在正常生长条件下，当压力释放和生长时，这些结构会溶解。使用图像分析量化 Q103-GFP 的重新分布和热应激诱导的胞质病灶的形成。
热应激响应的代表性结果可以在这里看到。具有胞质 Q103-GFP 病灶的细胞数量随着持续的热应激而增加。在热应激期间，蛋白质质量控制系统不堪重负，因此易聚集的蛋白质无法维持在可溶状态。
热应激后，具有胞质病灶的细胞数量减少，表明聚集的蛋白质溶解。看完这个视频，你应该对如何监测热应激引起的盘状网柄变形虫的扰动有了很好的了解。在整个成像过程中，如果您的显微镜没有硬件自动对焦功能，请务必记住确保正确调整焦距。
该方案中显示的温度控制可用于热应激响应领域之外。在正常生长条件下使用温度控制进行成像可以显着降低光毒性作用。
概述
这项研究提出了一种新的成像方法来研究社会变形虫Dictyostelium discoideum中的温度诱导的蛋白质聚集和细胞应激反应。该技术允许精确的温度控制，使研究人员能够观察热应激对蛋白质质量控制的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 蛋白质聚集
背景
- Dictyostelium discoideum作为研究细胞对应激反应的模式生物。
- 理解蛋白质错误折叠对于洞察各种疾病至关重要。
- 热应激可能导致蛋白质聚集，影响细胞功能。
- 成像技术对于实时观察细胞过程至关重要。
研究目的
- 开发一种观察热应激诱导的细胞扰动的方法。
- 阐明D. discoideum的热应激反应机制。
- 评估应激条件下蛋白质质量控制的有效性。
使用的方法
- 在低荧光培养基中准备Dictyostelium细胞。
- 在受控温度下成像（23°C和30°C）。
- 时间跃进成像以监测几个小时内的细胞反应。
- 图像分析以量化蛋白质聚集和恢复。
主要结果
- Q103-GFP蛋白在正常条件下显示弥散分布。
- 在热应激下，Q103-GFP形成点状结构，表明聚集。
- 应激后，具有聚集物的细胞数量减少，表明恢复。
- 该方法成功展示了蛋白质聚集和溶解的动态过程。
结论
- 该成像技术提供了对细胞应激反应的洞察。
- 温度控制对于准确观察蛋白质动态至关重要。
- 这种方法可以应用于其他细胞应激研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein aggregation dynamics in a live, stress-responsive model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to heat-induced proteotoxic stress.
- Facilitates functional validation of protein quality control targets relevant to aggregation disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging protocol for quantifying protein aggregation and dissolution events.
- Reduces phototoxicity, allowing higher imaging intensities for low-expression proteins.
- Supports reproducible, quantitative readouts suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of protein misfolding and aggregation.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for aggregation-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.
- Discovery Biology: Quantifies heat stress-induced protein aggregation, clarifying proteostasis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation metrics for assay development.
- Analytics: Provides cell-level counts of aggregation events and recovery dynamics.
- Translational Research: Models disease-relevant stress responses for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse protein quality control studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation for protein aggregation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistic data on proteostasis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aggregation-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging and quantitative image analysis.
- Demands temperature-controlled microscopy and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptable to other aggregation-prone protein models with protocol optimization.
- High cell motility and phototoxicity sensitivity require careful experimental design.
