Name: 研究蛋白质的质量控制体系Ð。菌使用温控活细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 了解利用温控活细胞成像技术研究Dictyostelium discoideum中热应激诱导的蛋白质聚集与质量控制机制的方法。该技术可实时观察蛋白质动态变化，为细胞应激反应研究提供重要工具。

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作者没有致谢。

1. 细胞准备
<ol>
	<li>培养细胞
	<ol>
		<li>培养 D. discoideum 在23 °C、光照条件下，于组织培养板中的AX培养基中培养细胞。避免将细胞维持在高于75%汇合度的高密度状态。 
		注意：为了获得对热应激的最佳反应，细胞应处于指数生长期，不应进入稳定期。</li>
		<li>成像前一天，将细胞接种至低荧光培养基（LFM）中，密度为 1 x 104 细胞/毫升 
		注意：此步骤旨在降低由AX培养基引起的背景荧光。孵育时间可缩短至最少2小时，但使用AX培养基孵育的囊泡在2小时后仍可能产生一定的背景信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为显微镜观察制备细胞
	<ol>
		<li>成像前，用 LFM 从组织培养板中收集细胞，并将适量细胞转移至玻璃底培养皿中。 
		注意：通常，1 x 105 细胞/ml 已足够；然而，如果实验需要长时间成像（超过 8 小时），则需仔细调整细胞数量，因为 D. discoideum 当细胞数量较多而营养物质较少时，细胞将进入发育周期并开始迁移和聚集。</li>
		<li>让细胞静置20分钟。通过小心地将用过的培养基更换为新鲜培养基，去除未贴壁的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 成像
注意：该方案既可用于宽场成像系统，也可用于共聚焦显微镜装置。使用覆盖物镜和显微镜载物台的温控培养箱有助于温度控制，但并非必需。培养箱的温度应设置为实验中所用的最高温度。 例如，若进行热激处理，则升温至40°C；否则将温度设定为25°C。温度调节应提前进行，以使系统充分适应，因为在成像过程中温度变化可能影响焦距。 
注意：成像过程中，使用冷却室控制温度。对非应激细胞成像的默认温度为 23 °C。在热应激条件下，温度将相应升高至所需水平。冷却室中的压电元件对温度变化响应迅速。然而，图像的焦平面会随之发生轻微变化（根据温度变化幅度，偏移量可达 20 µm）。因此，在开始采集图像的最初几分钟内需手动重新对焦，除非所用显微镜配备硬件自动对焦系统。
<ol>
	<li>非应激条件下的成像
	<ol>
		<li>在 23 °C 的非应激条件下对细胞进行成像，至少获取 6 个视野（FOVs）。 
		注意：非应激条件可通过记录一段短时间的时间序列（5–30 分钟）或获取代表性静态图像来观察。针对每种条件或细胞系，均应至少获取 6 个视野（FOVs）。 
		注意：若需关注单个细胞，应将目标细胞置于视野中央，并记录一个 3 × 3 拼接图像序列，使目标细胞所在的视野位于拼接区域中心。D. discoideum 细胞具有运动性，可能移出视野。然而，3 × 3 拼接图像序列可扩大潜在观察区域，使目标细胞在约 6 小时的时间序列记录中仍可被追踪。</li>
		<li>以 1–0.25 µm 的步长采集最大厚度为 7 µm 的 z 轴层扫图像，以覆盖细胞的完整体积。</li>
		<li>采集参考明场图像，用于评估细胞总数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>热应激条件下的成像
	<ol>
		<li>根据仪器制造商的说明，将温控腔室的温度调节至 30 °C。</li>
		<li>待温度显示达到设定值后，手动在明场通道中重新对焦，并在开始时间序列记录前检查所有已记录的视野（FOVs）。</li>
		<li>启动时间序列记录，进行持续 4 小时的热应激实验，各时间点之间的间隔为 5–10 分钟。在采集前两个时间点时，需检查对焦是否准确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>恢复阶段的成像
	<ol>
		<li>热应激结束后，将温度恢复至 23 °C，等待温度显示稳定后，手动重新对焦。</li>
		<li>在恢复阶段以 10–20 分钟的时间间隔记录 8–10 小时的时间序列视频。在采集第一个时间点时检查对焦是否准确。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像分析
注意：为了定量分析含有细胞质焦点的细胞数量，需评估每个时间点的细胞总数以及含有细胞质焦点的细胞数量。由于从明场图像中分割细胞较为困难，定量分析需手动完成。以下描述了免费图像处理软件（http://fiji.sc/Fiji）的数据分析方法，该软件需要安装“Cell Counter”插件（http://fiji.sc/Cell_Counter）。
<ol>
	<li>评估细胞总数
	<ol>
		<li>点击&#34;File&#34;和&#34;Open&#34;，加载明场图像堆栈（XYT）。</li>
		<li>打开&#34;Cell Counter&#34;插件（&#34;Plugins&#34; -&#34;Cell Counter&#34;），点击&#34;Initialize&#34;以加载图像堆栈。</li>
		<li>通过勾选相应的复选框选择合适的计数器类型。 
		注：使用类型1作为细胞总数的计数器，类型2作为具有胞质焦点的细胞的计数器。对所有细胞进行计数。</li>
		<li>点击&#34;Save Markers&#34;保存标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估具有胞质焦点的细胞数量
	<ol>
		<li>加载荧光图像超堆栈（XZYT）（&#34;File&#34; - &#34;Open&#34;），并使用&#34;Z-Projector&#34;（Image/Stacks）生成最大强度投影。</li>
		<li>打开&#34;Cell Counter&#34;插件，点击&#34;Initialize&#34;加载生成的图像堆栈（XYT）。</li>
		<li>点击&#34;Load Markers&#34;加载标记。 
		注意：参考图像和荧光堆栈的文件名必须完全相同。如有必要，在初始化图像堆栈前应相应重命名。</li>
		<li>选择合适的标记类型（见3.1.3），并对具有胞质焦点的细胞进行计数。已有的标记可作为各个细胞位置的参考。</li>
		<li>点击&#34;Results&#34;获取每帧的计数值，并将计数结果另存以用于后续计算。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li>
<li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+a+model+organism%3A+progress+with+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li>
<li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+finds+new+roles+to+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li>
<li>Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+system+-+substantial+share%3A+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li>
<li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q%2FN-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li>
<li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+in+Dictyostelium%3A+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li>
<li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+spinning+disk+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Techniques%22%5BJournal%5D)">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li>
<li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li>
<li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li>
<li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+response+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案可用于研究特定目的蛋白在热诱导应激条件下的行为变化。已有报道指出，温度升高至 30 °C 可触发热应激反应，在此条件下，D. discoideum 的存活率显著降低。
修改方法 
本方案可进行修改，以在相同应激条件下比较不同蛋白质的行为。为此，可将表达带有相同荧光标签的不同蛋白质的细胞转移至多孔培养皿中，例如四孔培养皿（见第1.3.1节）。该方案也可应用于共表达带有不同标记物（如GFP或RFP）蛋白质的细胞。例如，可用于监测蛋白质质量控制（PQC）系统中不同组分的行为。可对表达GFP标记的聚集指示蛋白和不同RFP标记的PQC组分的细胞，在多孔培养皿中进行成像观察。这可确保施加相同的应激条件（温度升降速度、温度升降持续时间），从而实现比较性研究。
此外，该方案可用于研究蛋白质质量控制（PQC）系统对热应激反应的影响。可通过遗传工具（如基因敲除或过表达）改变组分的表达水平，或使用 commercially available 特异性抑制剂来调节各组分的活性6。通过向培养基中添加 MG132（100 µM）或乳胞素（lactacystin，10 µM）可抑制蛋白酶体活性。分子伴侣 Hsp90 可通过格尔德霉素（geldanamycin，6 µM）或雷迪帕霉素（radicicol，10 µM）进行抑制。分子伴侣 Hsp70 可使用 VER-155088 抑制，但在我们目前的实验条件下尚未能证实其抑制效果。抑制剂应在成像前一天加入，细胞需孵育 14 小时。
实验方案中的关键步骤 
评估热诱导扰动的关键步骤在于成像实验前细胞的状态。酵母研究显示，细胞在静止期会获得对多种环境胁迫的抗性13。我们也观察到，如果 D. discoideum 细胞在成像前已进入静止期，则对施加的热胁迫反应极微弱。因此，保持细胞浓度恒定且&#60;5 × 105 个细胞/ml 至关重要。
此外，高细胞密度可能诱导 D. discoideum 从营养生长周期转变为发育周期，从而激活饥饿相关通路，这可能导致细胞对热应激产生不同的响应。若在热应激后的恢复阶段达到高细胞密度，细胞可能发生流动和聚集，导致细胞移出焦平面，干扰数据分析（见图4）。
技术的局限性 
失焦是该方案的瓶颈。在温度变化过程中，焦平面可能会发生显著偏移，因此在改变温度后的短时间内需要手动重新对焦。这种焦距的跳跃有时过于剧烈，难以通过软件自动对焦克服，尤其是在时间点间隔较长的情况下。然而，如果所使用的显微镜配备了硬件自动对焦系统，则可以避免这一瓶颈。
该技术相对于现有方法的意义 
与现有的方法（如使用空调房间、覆盖物镜和显微镜载物台的温控培养箱，或温控载物台与物镜套管）相比，使用冷却室能够更精确地控制环境温度。冷却室中的珀尔帖元件可在整个实验装置中维持恒定且均匀的温度。在传统装置中，局部温度差异可能导致不同的观察结果。此外，冷却室能够快速响应人为设定的温度变化，而传统装置对温度变化的适应非常缓慢，尤其是降温过程。冷却室中的珀尔帖元件还可覆盖更宽的温度范围（15–40 °C），而使用传统装置很难达到15 °C或40 °C这样的温度。
Dictyostelium discoideum 对光毒性特别敏感。以往的研究使用抗坏血酸作为清除剂以减轻光毒性。然而，长时间成像需要额外补充。此外，抗坏血酸的使用仅限于其抗氧化补充剂不会影响所关注机制的研究。我们建议，温度控制成像可作为减少光毒性的替代方法，并可与添加抗坏血酸相结合，以进一步降低毒性。
通过使用冷却室将温度维持在恒定且均匀的23 °C，可以将光毒性效应降至最低。在温度控制条件下成像的细胞在更长时间内表现出更少的光毒性迹象，例如细胞变圆。这还允许使用更高强度、更短时间间隔或更多视野（FOVs）进行成像。
一般应用 
已有研究表明，在较高温度下，热应激会引发不同的热应激反应14。因此，将温度升高至 34 °C 或 37 °C 可能会诱导出不同的反应。除了施加的温度胁迫外，还可以调整特定胁迫状态的持续时间，以研究热应激的即时反应或长期适应机制。
总体而言，所述方案可拓展至多种应用。由于精确的温度控制显著降低了光毒性效应，该方案可用于需要较长曝光时间 和/或较高激发光强度的实验条件。 例如用于可视化低表达水平的蛋白质，或在成像时间间隔较短的情况下结合使用， 例如在延时成像过程中，该方法也适用于对跨越整个细胞的结构进行成像。 例如微管，因为这些设置需要大量的光学z轴层扫描。

Dictyostelium discoideum 是一种独居生活的土壤变形虫，以细菌和其他微生物为食，通过吞噬作用摄取食物。自发现以来，其独特而显著的生活史一直是研究的重要领域1。早期对多细胞发育2和趋化性分子机制3的研究兴趣很快扩展到细胞运动性、细胞极性和先天免疫等方面。此外，D. discoideum 还被引入作为生物医学研究的模式系统4,5。
近期，我们建立了D. discoideum作为研究蛋白质质量控制（PQC）系统的新模型6,7。其蛋白质组富含易于聚集的类朊病毒蛋白，这对蛋白质质量控制构成了挑战8。为了探究D. discoideum是否进化出特殊的分子机制以应对高度易聚集的蛋白质组，我们研究了在正常生长条件和应激条件下聚集倾向性标记蛋白的行为。诸如热应激等应激条件可提高蛋白质错误折叠的发生率9。因此，我们寻求一种能够诱导温度变化并同时实时监测标记蛋白行为的系统。为此，我们将活细胞成像技术与基于帕尔帖元件控温的加热装置（冷却室）相结合。该方法使我们能够维持恒定且均匀的温度，并实现快速而精确的温度变化。
活细胞成像被用于研究 D. discoideum 中多种生物学过程。然而，该方法面临两个主要局限性。首先，细胞具有较高的运动性，容易迁出视野范围，因此对单个细胞的追踪通常需要对较大区域进行成像。可通过琼脂覆盖来降低细胞运动性10，但这些条件因细胞活力下降而不适用于长期成像。其次，D. discoideum 细胞对光毒性具有特别高的敏感性，会导致细胞变圆及有丝分裂阻滞11。先前的实验方案通过添加抗坏血酸作为自由基清除剂并缩短曝光时间来缓解这一问题12。然而，若目标蛋白表达水平较低且荧光信号较弱，则缩短曝光时间可能至关重要。作者还建议通过在空调房间内成像，或使用覆盖物镜和显微镜载物台的温控培养盒，维持恒定的 21 °C 温度12。
本文介绍一种通过使用设定在23 °C的冷却室来改善温度控制的方法。在成像过程中，该装置显著增强了对光毒性的抵抗能力，允许使用更长的曝光时间以及更高的激发光强度。这一点在延时成像中尤为重要，因为需要在成像时间间隔、成像位置数量与曝光时间之间进行仔细权衡。增加成像位置数量的可能性也使得成像区域更广，并有助于对单个细胞进行更长时间的追踪观察。

<table><tbody><tr><td>AX 培养基</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo 培养基</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>乳胞素（Lactacystin）</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>格尔达那霉素（Geldanamycin）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>雷迪西尔（Radicicol）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek 35 mm 培养皿</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>玻璃底成像培养皿</td></tr><tr><td>CellViell 细胞培养皿</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>四区玻璃底成像培养皿</td></tr><tr><td>双极温控加热/冷却台插入件</td><td>Warner Instruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>双极温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>液体冷却系统</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

使用温度控制的活细胞成像研究 d. discoideum 的蛋白质质量控制系统

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

社会性变形虫Dictyostelium discoideum复杂的生命周期使其成为研究多种生物学过程的宝贵模型。最近，我们发现D. discoideum对蛋白质聚集具有极强的耐受性，可用于深入理解细胞内的蛋白质质量控制系统。然而，将D. discoideum作为模型系统应用于基于显微镜的实验方法时面临若干挑战，例如细胞的高度运动性及其对光毒性的敏感性。后者在研究蛋白质稳态时尤为棘手，因为光毒性效应可诱导细胞应激反应，从而改变蛋白质质量控制系统的行为。
升温是诱导细胞应激的常用方法。本文介绍一种可调控温度的成像方案，可用于观察温度升高对D. discoideum造成的扰动。此外，在正常培养温度下应用该成像方案时，亦可显著降低光毒性，从而允许使用更高强度的光照进行成像。这对于表达水平极低的蛋白质成像尤为有利。此外，由于细胞具有较高的运动性，通常需要采集多个视野以追踪单个细胞，而视野数量需与期望的时间间隔和曝光时间之间进行权衡。

本研究所述的成像方案可用于分析在热应激条件下，黏菌 D. discoideum 中易聚集的朊病毒样蛋白的行为。图1展示了GFP标记的多聚谷氨酰胺蛋白Q103在正常培养条件下（图1A）、在30 °C下热应激2小时后（图1B）以及在恢复常温培养6小时后的细胞内分布情况（图1C）。当温度从23 °C升至30 °C时，Q103-GFP标记物由弥散分布转变为点状结构；而在解除应激并恢复常温培养后，这些点状结构逐渐消散。Q103-GFP的重新分布及热应激诱导的胞质焦点形成可通过图像分析进行定量。图2A展示了使用Fiji软件及其插件“Cell counter”对单个视野（FOV）进行分析的过程，图2B展示了热应激反应的定量结果。结果显示，随着热应激时间的延长，胞质中Q103-GFP焦点的数量逐渐增加。在热应激过程中，蛋白质质量控制（PQC）系统超负荷运转，导致如朊病毒样蛋白Q103等易聚集蛋白无法维持可溶状态，从而在胞质中不断形成聚集焦点。细胞还表现出特征性的变圆形态，如图1B所示。应激解除后胞质焦点的减少表明聚集的蛋白质被逐步溶解。
成像质量对初始细胞密度较为敏感。 图3 显示了细胞在应激恢复后的示例，比较了适当的初始细胞密度（图3A）以及高初始细胞密度（图3B）。如果初始细胞密度过高，细胞将开始形成如图所示的流状结构 图3b这会导致后续定量分析困难，因为细胞已移出焦平面。
上述方法可用于监测温度诱导的变化，也可在生理生长温度下成像时用于降低光毒性。图4展示了在冷却室中23 °C条件下成像的细胞（图4A）与在空调房间（设定为25 °C）中无温度控制条件下成像的细胞（图4B）的对比。在持续激发光照射下，若未在温度受控条件下成像，细胞会变圆，这种细胞形态的改变表明细胞处于应激状态。
<img alt="细胞应激反应；显微镜图像；应激前、应激中、应激后条件；10 μm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 具有聚集倾向的朊病毒样蛋白在热应激过程中发生细胞内分布改变。 在 AX2-214 D. discoideum 细胞中组成型表达 GFP 标记的富含多聚谷氨酰胺的亨廷顿蛋白外显子1（Q103）（GFP 信号以反相灰度查找表显示）。 （A）在23 °C正常培养条件下，Q103-GFP 在细胞质中呈弥散分布。 （B）在30 °C下热应激2小时后，Q103-GFP 聚集为细胞质内的焦点结构（红色箭头所示）。细胞呈现特征性形态改变并变圆。（C）解除应激并恢复23 °C培养后，细胞质内的焦点结构逐渐溶解。6小时后，无法观察到细胞质内的焦点结构。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用细胞质焦点数据分析进行细胞计数的过程；30°C 和 23°C 下的示意图与图表。" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 热诱导细胞质焦点形成的定量分析。 （A）使用免费图像处理软件 Fiji 及其插件“Cell Counter”对细胞进行分析。在明场图像中确定细胞总数（类型 1，蓝色标记）。将标记载入 GFP 通道，并确定含有细胞质焦点的细胞数量（类型 2，红色标记）。（B）在 30 °C 下热应激 3 小时，随后在 23 °C 恢复应激 3 小时后的焦点定量结果（n = 4 个视野，误差棒 = 标准差）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在23°C下培养6小时后比较细胞密度的显微镜图像，显示最佳密度与高密度条件下的差异。" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 细胞密度对长期延时成像的影响 (A初始细胞密度下的细胞成像 &lt;105 细胞/毫升。热应激3小时后 30 °C 以及在胁迫恢复6小时后 23 °C，细胞仍处于营养生长周期并进行分裂。仅有少数细胞移出焦平面。B初始细胞密度下成像的细胞 &gt;106 个细胞/毫升。经过9小时成像（成像设置同A图）后，细胞已进入发育周期，开始趋化运动并聚集。聚集物中的细胞已无法清晰分辨。大部分细胞已移出焦平面，无法进行分析。比例尺 = 10 µm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="温度控制与无温度控制下细胞行为的比较（10 分钟内）；显微镜图像，10 μm 比例尺。" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图 4： 温度控制对光毒性效应的影响。（A）在 23 °C 温度控制条件下成像 10 分钟的细胞：6 个视野，z 轴层扫（层间距 0.5 µm，样品厚度 8 µm），时间序列（总时长 10 分钟，间隔 1 分钟），GFP 通道（曝光时间 0.07 毫秒，激光强度 10%），RFP 通道（曝光时间 0.1 毫秒，激光强度 10%）。细胞未表现出与光毒性应激相关的典型形态学变化。（B）在无温度控制条件下成像 10 分钟的细胞（其他条件同 A）。细胞出现光毒性诱导的变圆现象，提示发生应激反应。比例尺 = 10 µm。图像采集使用基于倒置显微镜的系统，配备 100 倍/1.4 数值孔径（N.A.）物镜。图像由 CCD 相机采集，分辨率为 1,024 × 1,024 像素，采用 1 × 1 binning 模式。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

社会性变形虫Dictyostelium discoideum最近已被确立为研究蛋白质错误折叠和蛋白质稳态的模型系统。本文中，我们描述了一种基于成像的新方法，用于研究温度诱导的蛋白质聚集以及D. discoideum中的细胞应激反应。

使用温度控制的活细胞成像研究 D. discoideum 的蛋白质质量控制系统

社会性变形虫盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）复杂的生活方式使其成为研究多种生物学过程的宝贵模型。最近，我们……

该成像技术的总体目标是观察热应激诱导的盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）细胞内的细胞扰动。该方法有助于理解盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）中热应激反应及蛋白质质量控制的机制。该技术的主要优势在于能够对施加于细胞的温度进行严密且精确的控制，以实现活细胞成像。开始实验前，按照文本方案中的说明准备盘基网柄菌细胞。成像前一天，将细胞分至低荧光培养基中，浓度为每毫升10,000个细胞。成像前，从组织培养板中用LFM收集细胞，然后将适量细胞转移至玻璃底培养皿中。静置细胞20分钟，然后小心地将用过的培养基替换为新鲜培养基，以去除未贴壁的细胞。在23摄氏度的非应激条件下对细胞进行成像，至少采集六个视野。以1至0.25微米的步长采集最大七微米的Z轴层扫图像，以完整捕捉细胞的整个体积。然后获取明场参考图像，以评估细胞总数。接着，将冷却室的温度调节至30摄氏度。当温度显示达到目标值后，在明场通道中手动重新对焦。在开始延时成像前检查所有已记录的视野，然后设置四小时热激处理的延时成像程序，时间点之间的间隔为5至10分钟。在采集前两个时间点的过程中，确认对焦正确。热激处理结束后，将温度降至23摄氏度。等待温度显示调整完毕后，手动重新对焦。随后在恢复阶段以10至20分钟的时间间隔连续记录8至10小时的延时成像视频。在采集第一个时间点时，需检查并确保对焦正确。首先打开配备有 Cell Counter 插件的图像处理软件。通过点击“文件”，然后选择“打开”，加载明场图像序列。接着打开 Cell Counter 插件，点击“初始化”以加载图像序列。通过单击相应的方框选择计数器类型。然后，对细胞总数进行计数，并通过单击“保存标记”来保存标记。标记保存后，加载荧光图像超堆栈的最大投影。打开细胞计数插件，通过点击“加载标记”（Load Markers）来载入标记。接着，选择用于细胞质焦点的标记类型，并对细胞进行计数。现有标记可作为单个细胞位置的参考。单击“结果”以获取每片的计数数量，然后将计数数据另存以进行后续计算。在本研究中，观察了绿色荧光蛋白（GFP）标记的多聚谷氨酰胺蛋白Q103在盘基网柄菌细胞中的分布情况。在正常培养条件下，Q103-GFP在细胞质中呈弥散分布。在热应激过程中，Q103-GFP 标记物会聚集形成点状结构。当应激解除并在正常生长条件下恢复生长时，这些结构逐渐消散。通过图像分析对 Q103-GFP 的重新分布及热应激诱导的细胞质焦点的形成进行定量。此处展示了热应激反应的代表性结果。随着持续的热应激，细胞质中出现Q103-GFP焦点的细胞数量逐渐增加。在热应激过程中，蛋白质质量控制系统超负荷运转，因此易聚集的蛋白质无法维持在可溶状态。热激后，细胞质中出现焦点的细胞数量减少，表明聚集的蛋白质发生溶解。观看本视频后，您应能够充分了解如何监测热激对盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）引起的扰动。在整个成像过程中，如果您的显微镜不具备硬件自动对焦功能，则务必注意确保焦距调整恰当。本方案中所示的温度控制方法可应用于热应激反应以外的领域。在正常生长条件下利用温度控制进行成像，可显著降低光毒性效应。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

研究蛋白质的质量控制体系<em&gt;Ð。菌</em&gt;使用温控活细胞成像

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