应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

该方案有助于表征细菌分泌复合物的组装功能，可促进对病原体与宿主相互作用所必需的分子机制的基本理解。该技术整合了多种互补方法，能够在保持样品天然结构的同时，实现对完整细菌细胞内蛋白质复合物的可视化观察。这加深了我们对细菌分泌系统结构与功能关系的理解。

该方法可适用于研究多种细菌物种中的其他类型分泌系统或其他细胞复合物。首先制备用于活细胞成像的琼脂糖垫。取约30 mL去离子水配制1%低熔点琼脂糖溶液，放入玻璃烧瓶中，微波加热约90秒，期间偶尔摇动，直至琼脂糖完全溶解。

将两片尺寸为 22 × 22 × 0.15 mm 的玻片叠放在一片尺寸为 25 × 75 × 1.1 mm 玻片的一侧边缘，上下叠放。然后，在另一侧边缘同样叠放另外两片较小的玻片。用移液器吸取约 1 mL 熔化的琼脂糖，注入两片上层玻片之间的中心玻片区域，并在熔化的琼脂糖上再放置一片大玻片，注意避免产生气泡。

将载玻片置于 4 摄氏度下冷却 15 分钟，然后使用解剖刀或剃刀小心地将垫片切成小方块。在 25 × 75 × 1.1 mm 玻璃载玻片上固定一个双面粘性框架，并将多个垫片放置于载玻片上。将大量 Legionella pneumophila 溶解于 1 mL 双蒸水中。

然后涡旋混匀，并用移液器吸取2至3微升稀释液滴加到样品垫上。轻轻将一块58 × 24 × 0.15 mm的盖玻片覆盖在粘性支架上。使用明场照明选择待成像的细胞。

然后，在显微镜软件的采集窗口中，将ND值调整为180，合并像素（binning）设置为2×2。使用488纳米通道对样本曝光500至1000毫秒，并采用相同参数对未标记的嗜肺军团菌进行成像，以验证荧光的特异性。为量化极性，调整图像对比度，使细菌清晰可见。

然后放大目标区域，使用区域工具在细菌极点处开始绘制一个 0.25 × 1.3 微米的矩形，并延伸至细胞质内，确保该矩形始终位于细菌边界之内。标记至少 200 个细菌，并通过分析菜单中的“区域生成掩膜”按钮创建掩膜。点击“掩膜统计”，在掩膜范围中选择“对象”。

然后在“特征”和“强度”下标记平均强度和方差。将数据导出为文本文件，并使用电子表格应用程序计算每个细菌的极性评分，即方差与平均强度的比值。对于高通量应用，使用相差显微镜采集双通道图像。

务必选择细菌完全分离的视野。接下来，调整图像的相位通道对比度，使细菌清晰可见。打开双通道图像并启动创建分割掩膜窗口。

调整适当的阈值，然后单击“定义对象”按钮，并将最小尺寸调整为 100 像素，以去除小的物体。在“优化掩膜”中，选择去除边缘物体，并将彼此相邻的细菌的掩膜分离开。为了定量分析融合蛋白的动态变化，打开图像采集窗口并标记时间序列。

在时间点数量框中输入 2。获取两幅成功表达目标荧光蛋白的嗜肺军团菌图像。调整图像对比度，直至细胞清晰可见。

然后使用区域工具，在至少400个细胞的中央放置一个0.25 × 0.25 µm的正方形。接着，在分析菜单中使用“区域到掩膜”按钮，创建感兴趣正方形区域的掩膜。新建一个空白掩膜，并使用像素工具标记至少25个随机细胞的整个细胞区域。

创建另一个掩膜，并使用大号画笔工具标记细胞之间的区域。最后，选择掩膜统计，并确保在掩膜一的掩膜范围下选择了“对象”。在特征与强度中，选择平均强度。

导出数据并对掩膜2重复该过程。对于掩膜3，选择整个掩膜并导出平均强度。为制备电子低温断层扫描样品，将嗜肺军团菌在CYE Agrastreptomisum平板上于37摄氏度培养48小时，形成浓密菌斑。

将细胞重悬于水中，使 OD 600 约为 0.7。然后向 20 微升细胞悬液中加入 5 微升胶体金颗粒。对有孔碳膜载网进行辉光放电处理，并用移液器将 5 微升细胞混合液滴加到载网上。

静置一分钟。用滤纸吸去载网上的液体，然后使用重力驱动的压片装置在液态乙烷中快速冷冻。在将超折叠绿色荧光蛋白（superfolder GFP）插入嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）染色体后，进行活细胞荧光显微镜观察，以比较其荧光信号与亲本超折叠GFP阴性菌株的荧光信号。

此外，使用明场显微镜检测具有特定荧光信号的细胞比例。仅有部分表达 DotB superfolder GFP 的细胞显示出融合蛋白的极性定位。在表征 DotB 荧光信号分布时发现，极区 DotB superfolder GFP 的荧光强度约为细胞质中的两倍。

为了研究 DotB 超折叠 GFP 的极性定位是否依赖于完整组装的 IV 型分泌系统，我们测定了野生型菌株及 IV 型分泌系统突变株中单个细胞的 DotB 超折叠 GFP 极性评分。事实上，当 Dot/ICM 系统被删除后，DotB 超折叠 GFP 的极性定位消失。动态模式表明，DotB ATP 酶存在于动态的细胞质群体中，并在晚期组装反应阶段被招募至极性定位的 Dot/ICM IV 型分泌系统。

采用高通量冷冻电子断层扫描技术，对表达DotB超折叠GFP的嗜肺军团菌菌株中的完整IV型分泌系统装置进行了可视化观察。通过对细胞进行重构，揭示了多个Dot/ICM复合物嵌入于细胞包膜中。同时确定了DotB及超折叠GFP相对于完整IV型分泌系统复合物的整体定位。

三维表面渲染结果表明，超折叠GFP位于DotB六聚体下方，而DotB在细胞质ATP酶复合物基部组装成盘状结构。在尝试该技术时，务必在进行图像采集之前评估融合蛋白的稳定性以及标签分泌系统的功能。建模与拟合可有效用于分析动态模式和结构密度，也可用于评估构象变化或将亚基定位到结构中的位置。

该方法有助于理解不同IV型分泌系统组分的功能、它们在更大复合物中的相互作用方式，以及不同亚复合物所执行的功能。