应用活细胞成像和低温电子断层扫描解决军团菌肺瘤点/Icm分泌系统的时空特征

该协议可用于描述细菌分泌复合物的组装功能，并可对宿主病原体相互作用所需的分子机制有一个基本的了解。此技术集成了保持样本原生结构的补充方法，并允许和看到完整细菌细胞中蛋白质复合物的可视化。它增加了我们对细菌分泌系统的结构功能关系的理解。

这种方法可以适应研究其他类型的分泌系统或其他细胞复合物在各种细菌物种。首先制作带活细胞成像的阿加罗斯垫。在水中准备约 30 mL 的 1% 低熔葡萄糖溶液，并在玻璃瓶中微波约 90 秒，偶尔旋转，直到红糖完全溶解。

将两个 22 x 22 x 0.15mm 玻璃幻灯片放在 25 x 75 x 1.1mm 玻璃幻灯片的边缘，另一个放在顶部。然后，将两个较小的幻灯片堆叠到另一边。将约1 mL的熔融气液移入两个上部玻璃滑梯之间的中心滑轨中，并在熔融的气糖顶部放置另一个大滑轨，确保避免形成气泡。

在4摄氏度下冷却滑梯15分钟，然后用手术刀或剃刀刀片轻轻地将垫子切成小方块。将双面胶架固定到 25 x 75 x 1.1mm 玻璃幻灯片上，并在幻灯片上放置多个垫片。在1 mL的双蒸馏水中溶解一块重的军团菌嗜血杆菌。

然后涡流和移液器2至3微升稀释到垫上。轻轻将 58 x 24 x 0.15 mm 盖板滑过粘合框架。使用亮场照明选择用于成像的单元格。

然后，在显微镜软件的捕获窗口中，将 ND 调整为 180，将装箱调整为 2 比 2。使用 488 纳米通道将样品暴露 500 到 1000 毫秒，并使用相同参数成像未标记的军团嗜血军团菌，验证荧光的特异性。要量化极性，请调整图像对比度，以便细菌清晰可见。

然后放大感兴趣的区域，并使用区域工具将 0.25 到 1.3 微米的矩形从极点开始并延伸到细胞质，确保矩形保留在细菌边界内。标记至少 200 种细菌，并使用分析菜单中的区域来遮盖按钮，创建掩码。单击掩码统计信息并选择蒙版范围下的对象。

然后在特征和强度下标记平均强度和方差。将数据导出为文本文件，并使用电子表格应用程序计算每个细菌的极性分数，作为方差和平均强度之间的比率。对于高吞吐量应用，请使用人脸对比度显微镜获取双通道图像。

确保选择细菌完全分离的视场。接下来，将图像的面部通道对比度调整为细菌清晰可见的水平。打开双通道映像并启动创建段蒙版窗口。

调整适当的阈值，然后通过单击定义对象按钮并调整最小大小到 100 像素来删除小对象。在"细化蒙版"下，选择移除边缘对象和彼此相邻的细菌分离掩膜。要量化融合蛋白的动态，请打开图像捕获窗口并标记时间推移。

在时间点数框中输入两个。获得两个成功的军团性嗜血杆菌图像，表达感兴趣的荧光蛋白。调整图像对比度，直到单元格清晰可见。

然后使用区域工具将 0.25 到 0.25 微米正方形放在至少 400 个单元格的中间。接下来，使用区域在分析菜单中蒙版按钮创建感兴趣的方块的蒙版。创建新的空蒙版，并使用像素工具标记至少 25 个随机单元格的整个单元格区域。

创建另一个蒙版并使用大画笔工具标记单元格之间的区域。最后，选择蒙版统计信息，并确保在蒙版范围 1 下选择对象。在特征和强度下，选择平均强度。

导出数据并重复掩码 2 的过程。对于蒙版 3，选择整个蒙版并导出平均强度。为了准备电子低温造影样本，在37摄氏度下在CYE猪链球菌板上种植一块重的军团性嗜血杆菌，48小时。

将水中的细胞重新消耗到约0.7的OD 600。然后向细胞悬浮液的20微升中加入5个胶体金粒子微升。发光释放孔碳栅格和移液器五微升的细胞混合物。

让它站立一分钟。用滤纸将网格混合，并使用重力驱动的柱塞装置将网格冻结在液体乙烷中。将超级折叠器GP插入军团性嗜血杆菌染色体后，进行活细胞荧光显微镜，将荧光信号与亲亲超级折叠器GP阴性应变的荧光信号进行比较。

此外，还利用亮场显微镜检查具有特定荧光信号的细胞的比例。只有一小部分产生DotB超级折叠器GP的细胞显示融合蛋白的极性定位。在描述DotB荧光信号的分布时，发现双极点B超折叠器GP的强度比细胞糖高两倍。

为了调查DotB超级折叠器GP极性突变是否依赖于完全组装的四型分泌系统，为野生型和四型分泌系统突变的单个细胞确定了DotB超级折叠器GP的极性分数。事实上，当Dot/ICM系统被删除时，DotB超级文件夹GP的极性定位消失了。动态模式表明，DotB ATPase存在于动态细胞体群体中，在后期组装反应时被招募到极性局部点/ICM四型分泌系统。

高通量低温 ET 用于在表达 DotB 超级折叠器 GFP 的军团性嗜血菌株中可视化完整的四型分泌系统装置。细胞的重建揭示了细胞包络中嵌入的多个点/ICM机器。确定了DotB和超级折叠器GP相对于完整型四型分泌系统机器的整体定位。

三维表面渲染表明，超级折叠器 GFP 位于 DotB 十六进制的下方，该六角形在细胞质 ATPase 复合物的基座上组装为圆盘。尝试此技术时，在进行图像采集之前，请务必评估融合蛋白的稳定性和标签分泌系统的功能。建模和拟合是分析动态模式和结构密度以及评估亚单元在结构中的构象变化或本地化的有效方法。

此方法有助于了解不同类型的四个秘密系统组件如何发挥作用，它们如何在更大的复杂中交互，以及不同的子组件执行哪些功能。