Name: 应用活细胞成像和低温电子断层扫描解决军团菌肺瘤点/Icm分泌系统的时空特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学习活细胞成像与低温电子断层扫描技术，用于解析军团菌Dot/Icm IV型分泌系统的时空组装特征。该方法整合互补技术保留样本天然结构，实现完整细菌细胞内蛋白质复合物的可视化。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.C. 和 C.R.R. 获得美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：R37AI041699 和 R21AI130671）的支持。D.P.、B.H. 和 J.L 获得美国国立卫生研究院（项目编号：R01AI087946 和 R01GM107629）的支持。

注意：所有涉及嗜肺军团菌（L. pneumophila）的培养、操作和成像步骤，均须在符合当地规范的生物安全二级实验室中进行。
1. 将sfGFP插入 L. pneumophila 利用等位基因交换和双重筛选策略进行染色体操作图2, 图3)
<ol>
	<li>克隆至基因替换载体 pSR47S 中11 以下序列：目标位点上游1,000 bp，随后为sfGFP序列，再随后为目标位点下游1,000 bp（图2）。sfGFP序列应通过含有4到8个氨基酸的连接子，与目标蛋白的N端或C端保持阅读框一致。将构建好的载体转化至 E. coli DH5αλpir。随后划线 L. pneumophila 在活性炭-酵母提取物（CYE）琼脂上挑选单菌落（受体）12 含有 100 µg/mL 链霉素并在37°C下培养5天 37 °C (图3).</li>
	<li>划线 L. pneumophila 在CYE琼脂-链霉素培养基上培养，于25°C下培养2天 37 °C （厚重封片）10划线接种 E. coli 携带 pRK600 辅助质粒的 DH5α（辅助菌）13 在含有LB琼脂的培养基上 25 µg/mL 氯霉素。划线接种 E. coli DH5αλpir（供体）于含LB琼脂 50 µg/mL 卡那霉素</li>
	<li>进行三亲交配：将一菌落辅助菌、一菌落供体菌和受体菌分别涂布于同一块无选择压力的CYE琼脂平板上，使三种菌株的菌斑相互重叠，于30 °C孵育4–8 h。 37 °C作为阴性对照，将含有辅助菌株和受体菌株的混合物以及含有供体菌株和受体菌株的混合物在相同时间内进行孵育。</li>
	<li>重悬交配反应混合物 500 µL 去离子水2O. 培养板 20 µL 和 50 µL CYE 琼脂平板上反应 100 µg/mL 链霉素和 10 µg/mL 卡那霉素，并在37°C下培养5天 37 °C. 将获得的四个克隆划线接种于含CYE琼脂培养基上 100 µg/mL 链霉素并在37°C下培养5天 37 °C.</li>
	<li>在含有5%蔗糖的CYE琼脂平板上划线接种16个克隆 100 µg/mL 链霉素并在37°C下培养5天 37 °C然后，将其中32个克隆划线接种于含CYE琼脂的培养基上 100 µg/mL 链霉素和含CYE琼脂 100 µg/mL 链霉素和 10 µg/mL 卡那霉素，于37°C培养5天 37 °C.</li>
</ol>
2. 将 sfGFP 整合到 L. pneumophila 染色体中的克隆的分离
<ol>
	<li>将对卡那霉素敏感的克隆在 CYE-琼脂-链霉素平板上划线培养，并通过菌落 PCR 确认 sfGFP 插入染色体。使用与 sfGFP 基因及目标染色体区域互补的引物，扩增插入位点的连接区域。
	<ol>
		<li>取 0.5 µL 的 10 µM 引物溶液各一种，并加入一个菌落，加水至终体积为 12.5 µL，于 95 °C 变性 10 分钟。冰上冷却 10 分钟后，加入 12.5 µL 的 2x PCR 预混液，进行 PCR 分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分离的菌落在 CYE-琼脂-链霉素平板上密集划线，于 37 °C 培养 2 天。使用抗 GFP 抗体通过免疫印迹检测 sfGFP 融合蛋白的表达水平和稳定性。</li>
</ol>
3. 活细胞成像 L. pneumophila 带有荧光标记的 Dot/Icm 组分
<ol>
	<li>琼脂糖垫的制备
	<ol>
		<li>制备约 30 mL 的 1% 低熔点琼脂糖水溶液。将溶液置于玻璃烧瓶中，微波加热约 90 秒，期间偶尔摇动，直至琼脂糖完全溶解。</li>
		<li>将两片 22 × 22 × 0.15 mm3 的玻璃盖片叠放在一片 25 × 75 × 1.1 mm3 玻璃载片的一侧边缘，另一侧边缘同样叠放另外两片 22 × 22 × 0.15 mm3 的玻璃盖片。</li>
		<li>用移液器吸取约 1 mL 熔融琼脂糖，注入上下两片玻璃盖片之间的中心载片区域，然后将另一片 25 × 75 × 1.1 mm3 的玻璃载片轻轻覆盖在熔融琼脂糖上。注意避免产生气泡。将载片置于 4 °C 冷却 15 分钟。</li>
		<li>使用解剖刀或剃须刀片，小心地将凝固的琼脂糖垫切割成约 5 × 5 mm2 的小方块。将一个双面粘性胶框（17 × 28 × 0.25 mm3）固定在一片 25 × 75 × 1.1 mm3 的玻璃载片上，并将多个琼脂糖垫放置于载片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集 
	注意：以下步骤适用于由 SlideBook 6.0 控制、配备固态照明器、CCD 单色相机和 100 倍物镜（数值孔径 1.4）的显微镜系统。如有需要，可使用其他具备适当硬件和软件配置的显微设备，并根据本实验方案的设置进行自定义调整。
	<ol>
		<li>将一簇浓密的 L. pneumophila 溶解于 1 mL 去离子水（ddH2O）中，涡旋混匀后取 2–3 µL 稀释液滴加至琼脂糖垫上。将一片 50 × 24 × 0.15 mm3 的盖玻片轻轻覆盖在粘性胶框上。</li>
		<li>在图像采集窗口中，将中性密度滤光片（ND）设置为 180，像素合并（binning）设为 2×2，使用 488 nm 激光通道对样品曝光 500–1,000 毫秒。采用相同参数对未标记的 L. pneumophila 进行成像，以验证荧光信号的特异性（图 4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dot/Icm 组分极性定位及其动态的定量分析
注意：以下步骤适用于以 2 x 2 binning 模式采集、每个像素对应 0.129 µm 的图像。
<ol>
	<li>sfGFP 融合蛋白极性的定量分析（图 5）
	<ol>
		<li>调整图像对比度，使细菌清晰可见。使用区域工具在极性位置放置一个 0.25 × 1.3 µm2 的矩形，并延伸至细胞质内。该矩形必须精确地位于细菌边界之内。</li>
		<li>标记至少 200 个细菌，并使用区域转为掩膜按钮创建感兴趣区域的掩膜。在掩膜统计和掩膜范围下选择对象。然后在特征和强度下勾选平均强度和方差。</li>
		<li>导出数据，并将每个细菌的极性评分计算为方差与平均强度的比值。</li>
		<li>对于高通量应用，使用相差物镜和适当的聚光镜设置，同时采集相差和 488 nm 通道的图像。确保选择细菌完全分离的视野。</li>
		<li>调整图像相差通道的对比度，使其达到细菌清晰可见的水平。打开双通道图像，启动创建分割掩膜窗口，并将通道切换至相差通道。</li>
		<li>设置适当的阈值，并使用定义对象按钮去除小的物体。在优化掩膜中选择去除边缘对象，随后将彼此相邻的细菌掩膜分离开。</li>
		<li>按照步骤 4.1.2–4.1.3 中所述方法，计算每个细胞在 488 通道信号中的极性评分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sfGFP 融合蛋白动态变化的定量分析（图 6） 
	注意：请按照第 3 节中的说明准备用于图像采集的样品。动态变化定义为随时间变化的强度变化，以下步骤适用于短时间成像（即数分钟）。若需更长时间的成像，请在载片上添加适当的补充成分。
	<ol>
		<li>在图像采集窗口中，勾选时间序列，在间隔框中输入时间间隔，并在时间点数量框中输入2。连续采集表达目标荧光蛋白的L. pneumophila的两幅图像。</li>
		<li>调整图像对比度，直至细胞清晰可见。参照图 6A及以下说明，放置三种不同的掩膜。使用区域工具在至少 400 个细胞的中央放置一个 0.25 × 0.25 µm 的正方形。</li>
		<li>使用区域转为掩膜按钮创建正方形区域的掩膜（掩膜 1）。新建一个空掩膜（掩膜 2），使用像素工具或多边形工具标记至少 25 个随机细胞的整个细胞区域，用于计算荧光漂白。再新建一个空掩膜（掩膜 3），使用大号画笔工具标记细胞之间的区域，用于背景扣除。</li>
		<li>在掩膜统计和掩膜范围下，为掩膜 1 和掩膜 2 选择对象。然后在特征和强度下选择平均强度，并导出这两个掩膜的数据。对于掩膜 3，导出整个掩膜的平均强度。</li>
		<li>使用以下公式计算掩膜 1 中每个对象的荧光强度变化：</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="漂白因子方程、静态平衡、数学分析、科学研究公式。" src="/files/ftp_upload/60693/60693eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1">
<img alt="显示在遮蔽和漂白因素下随时间变化的强度动态方程。" src="/files/ftp_upload/60693/60693eq2b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">
其中，掩膜1是位于细胞中心的0.25 µm × 0.25 µm的正方形，掩膜2覆盖整个细胞，掩膜3为细胞间的背景区域，t1为第一个时间点的平均强度，t2为第二个时间点的平均强度。
5. 利用冷冻电子断层扫描技术检测 sfGFP 质量密度
<ol>
	<li>样品制备、数据采集与重构
	<ol>
		<li>在 CYE-琼脂-链霉素平板上于 37 °C 培养表达荧光标记 Dot/Icm 蛋白的 L. pneumophila，培养 48 小时以获得浓密菌落。用 ddH2O 重悬菌体至 OD600 ~0.7。向 20 µL 菌悬液中加入 5 µL 胶体金颗粒（BSA Tracer，10 nm）。</li>
		<li>取 5 μL 菌液混合物滴加至新鲜辉光放电处理的带孔碳膜载网（R 2/1，铜网 200 目）上，静置 1 分钟。用滤纸吸去多余液体，使用重力驱动的压入装置在液态乙烷中快速冷冻，操作方法如前所述14,15。</li>
		<li>使用配备场发射枪、能量过滤器、Volta 相位板和直接电子探测器的 300 kV 透射电子显微镜对冷冻水合样品进行成像。在 26,000× 和 42,000× 放大倍数下采集单轴倾斜系列图像，对应的样品层面像素尺寸分别为 5.4 Å/像素和 3.4 Å/像素。</li>
		<li>使用电子断层成像软件包 SerialEM，在约 0 μm 离焦条件下采集图像堆栈，倾斜角度范围为 -60° 至 +60°，步长为 3°，累积电子剂量约为 ~60 e-/Å2,16。使用 MotionCor2 对每组图像堆栈中的剂量分帧电影图像进行运动校正17。使用 TOMOAUTO 组装经漂移校正的图像堆栈14。</li>
		<li>通过 IMOD 的标记依赖性比对方法对漂移校正后的图像堆栈进行比对18。采用 SIRT 方法19 重构断层图像，用于分割和直接图像分析，同时采用 WBP 方法20 进行重构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sfGFP 融合样品的子断层平均分析
	<ol>
		<li>使用电子断层成像软件包 I3 (0.9.9.3) 进行子断层分析14,21,22。 
		注：比对过程为迭代进行，每次迭代包含三个步骤：生成参考图像和分类掩模、对子断层图像进行比对与分类，以及对各类平均图像进行相互比对。</li>
		<li>使用 4 × 4 × 4 降采样后的子断层图像进行初始比对。合并属于类平均图像且显示对应于 sfGFP 的电子密度的颗粒。在筛选出含有 sfGFP 融合蛋白的颗粒后，使用 2 × 2 × 2 降采样后的子断层图像对感兴趣区域（如 Dot/Icm 胞质 ATP 酶复合物）进行聚焦比对，以获得高分辨率结构。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perplexing+functions+and+surprising+origins+of+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors.</a> Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).</li>
<li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLOS Pathogens. 5, 1000508(2009).</li>
<li>Ninio, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+translocated+by+Legionella+pneumophila%3A+strength+in+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers.</a> Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li>
<li>Isberg, R. R., O'Connor, T. J., Heidtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Legionella+pneumophila+replication+vacuole%3A+making+a+cosy+niche+inside+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).</li>
<li>Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+DotA+protein+is+required+for+early+phagosome+trafficking+decisions+that+occur+within+min+of+bacterial+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake.</a> Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).</li>
<li>Archer, K. A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-Dependent+Responses+Involving+Toll-Like+Receptor+2+Are+Important+for+Protection+and+Clearance+of+Legionella+pneumophila+in+a+Mouse+Model+of+Legionnaires%27+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires' Disease.</a> Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).</li>
<li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 136(2011).</li>
<li>Kubori, T., Nagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Type+IVB+secretion+system%3A+an+enigmatic+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera.</a> Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).</li>
<li>Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+cytoplasmic+ATPase+complex+defines+the+Legionella+pneumophila+type+IV+secretion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel.</a> Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).</li>
<li>Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Legionella+pneumophila+fliI+gene%3A+intracellular+growth+of+a+defined+mutant+defective+for+flagellum+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis.</a> Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).</li>
<li>Feeley, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charcoal-yeast+extract+agar%3A+primary+isolation+medium+for+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila.</a> Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).</li>
<li>Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+linked+Legionella+pneumophila+genes+essential+for+intracellular+growth+and+evasion+of+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway.</a> Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).</li>
<li>Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Tomoauto%3A+A+Protocol+for+High-throughput+Automated+Cryo-electron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53608(2016).</li>
<li>Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Molecular+Architecture+of+the+Salmonella+Type+III+Secretion+Machine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine.</a> Cell. 168, 1065-1074 (2017).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14, 331-332 (2017).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Gilbert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+methods+for+the+three-dimensional+reconstruction+of+an+object+from+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections.</a> Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weighted+Back-projection+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Tomography%22%5BJournal%5D)">Weighted Back-projection Methods.</a> Electron Tomography. , 245-273 (2007).</li>
<li>Winkler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+subvolume+alignment+and+subvolume+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).</li>
<li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt+series+in+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).</li>
<li>Prevost, M. S., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystal+structures+of+the+type+IVb+secretion+system+DotB+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases.</a> Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).</li>
<li>Miklos, G. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+genome+project+in+determining+gene+function%3A+insights+from+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms.</a> Cell. 86, 521-529 (1996).</li>
<li>Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterselectable+markers%3A+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Studies+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Studies in Live Cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).</li>
<li>Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

阐明细菌分泌系统的功能对于全面理解宿主与病原体之间的相互作用至关重要。分泌系统是一种复杂的分子机器，能够将效应蛋白注入宿主细胞内，某些情况下还能促进形成支持细菌复制的亚细胞微环境。上述方法为研究呼吸系统细菌病原体Legionella pneumophila的Dot/Icm分泌系统提供了重要的新工具，揭示了效应蛋白转运机制的关键线索，而该机制对其致病性至关重要。通过结合活体细菌细胞成像与结构研究，该方法可推广应用于其他分泌系统，以在分子水平上解析其功能。这可以通过利用延时视频显微镜研究荧光标记的分泌系统组分在时空上的动态行为来实现。
我们构建了洁净且无标记的突变体，其中基因被一个修饰后的等位基因标记或替换，这是从分子水平理解致病机制以及定义可能促进药物疗法开发的结构-功能关系的基本方法24,25。通过基因改造使L. pneumophila中单个Dot和Icm蛋白缺失的菌株，可用于通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）解析Dot/...

Legionella pneumophila（L. pneumophila）是军团菌病的致病因子，存在于淡水储库中，在自然环境中通过感染并复制于自由游动的水生原生动物体内进行增殖。L. pneumophila 可通过饮用水源产生含菌气溶胶，经人体吸入后引发疾病暴发。在感染细胞内，L. pneumophila 通过干扰宿主细胞通路，延缓其所处液泡的内吞体成熟过程，并促进形成一种支持细菌复制的特殊细胞区室。该过程由一种称为 Dot/Icm 的细菌特异性 IVB 型分泌系统（T4BSS）及其在感染期间转运至宿主细胞质的 300 多种&#34;效应子&#34;蛋白共同驱动，以调控宿主细胞功能1,2,3,4,5。缺乏功能性 Dot/Icm 装置的突变株无法将效应子递送至宿主细胞质，不能在细胞内有效复制，并在疾病动物模型中表现为无毒力6,7。
许多细菌物种已进化出极为复杂且动态的多组分机器，这些机器是感染过程所必需的。其他IV型细菌分泌系统（T4BSS），如Dot/Icm系统，对于诸如Coxiella burnetii和Rickettsiella grylli等细菌病原体的胞内复制也至关重要。尽管T4BSS在进化上与介导DNA转移并可递送有限种类效应蛋白的原型IV型A系统（type IVA systems）相关，但Dot/Icm系统的机器组分数量几乎是其两倍，并能够递送多种多样的效应蛋白。推测这种组分数量的增加使Dot/Icm装置能够更轻松地容纳和整合新的效应蛋白8,9。
我们最近利用冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）原位解析了 Dot/Icm 装置的结构，发现其形成一个跨越细胞包膜的通道，并与一个胞质复合物相连。进一步分析表明，胞质 ATP 酶 DotB 通过与胞质 ATP 酶 DotO 相互作用，定位于 L. pneumophila 细胞极性部位的 Dot/Icm 系统。我们发现，在大多数细菌细胞中，DotB 表现出胞质内的运动性，表明该 ATP 酶不仅存在于动态的胞质群体中，还能与极性部位的 Dot/Icm 复合物结合。此外，DotO 形成由 DotO 二聚体组成的六聚体结构，并与内膜复合物相关联，而一个 DotB 六聚体则连接到该胞质复合物的基部。DotB-DotO 能量复合物的组装形成了一个胞质通道，引导底物通过 IV 型分泌系统（T4SS）进行转运（图 1）10。
尽管近期取得了一些进展，但关于 Dot/Icm 系统如何发挥作用，以及各个蛋白质如何组装形成有活性的装置，目前仍知之甚少8。揭示 Dot/Icm IV 型分泌系统（T4SS）的调控回路，对于理解宿主-病原体相互作用的分子机制至关重要。因此，我们将讨论如何利用活细胞显微镜和冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET），检测并表征被超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）标记的嗜肺军团菌（L. pneumophila）Dot/Icm 系统中的关键组分。通过定量荧光显微镜，将在野生型背景或 IV 型分泌系统缺失的背景下，明确 DotB 的极性定位。此外，将利用延时显微镜定量分析 Dot/Icm 胞质 ATP 酶之间在定位和动态行为上的差异。
联合应用活体成像和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）这两种互补的方法，相较于其他体外系统具有优势。这两种方法均在完整细胞中进行，能够保持T4BSS的天然环境，从而在样品制备过程中最大限度地减少对天然结构的破坏。由于蛋白过表达可能破坏分泌装置的化学计量比，因此通过等位基因交换将sfGFP融合蛋白回插至Legionella染色体中，使每个融合蛋白以单拷贝形式存在，并由内源启动子驱动表达。对染色体编码融合蛋白的可视化，可实现对特定时间点蛋白表达水平的精确定量。冷冻电子断层扫描（cryo-ET）在解析分泌系统结构方面也具有诸多优势。其中最显著的优势在于，cryo-ET样品由冷冻的完整细胞组成，能够在细菌细胞结构背景下保存天然复合物。因此，与生化纯化方法相比，cryo-ET可能更具优势，因为后者会提取膜复合物，可能导致外周蛋白从核心装置上脱落或改变整体结构。此外，使用sfGFP等大分子蛋白对目标蛋白进行标记后，所增加的质量可被cryo-ET检测到，有助于将Dot/Icm装置的不同亚复合物定位到cryo-ET获得的结构上。
该方法是揭示在细菌细胞膜中组装的多分子复合物结构信息的有力工具。利用这些技术解析出的结构将有助于领域内研究人员理解T4BSS组分的功能机制、为何需要如此多的组分才能实现功能、各组分在更大复合物中的相互作用方式，以及这些亚复合物所执行的具体功能。

<table><tbody><tr><td>10 nm 胶体金颗粒</td><td>Aurion</td><td>25486</td><td></td></tr><tr><td>100x Plan Apo 物镜（1.4 NA）</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758</td><td></td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5510</td><td></td></tr><tr><td>Agaroze GPG/LMP，低熔点</td><td>American bioanalytical</td><td>AB00981</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 脱水琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP EZ 20 MHz 数字黑白相机</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Frame，1.7×2.8 cm，125 &amp;micro;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0578</td><td></td></tr><tr><td>带孔碳支持膜 R 2/1 Cu 200 目</td><td>Quantifoil</td><td>Q225-CR1</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铁九水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216828</td><td></td></tr><tr><td>用于冷冻电镜的 K2 Summit 相机</td><td>GATAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 22×22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 24×50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545K</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片 25×75×1 mm</td><td>Globe Scientific</td><td>1380</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 6.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra X 光源系统</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0270</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 dot/icm 分泌系统

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Legionella pneumophila 的 Dot/Icm 分泌系统是一种复杂的 IV 型分泌系统（T4SS）纳米机器，定位于细菌极区，介导蛋白质和 DNA 底物向靶细胞的递送，该过程通常需要直接的细胞间接触。我们最近通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）解析了 Dot/Icm 装置的结构，发现其形成一个跨越细胞包膜的通道，并与一个细胞质复合物相连。结合两种能够保持样品天然结构的互补方法——活细胞荧光显微镜和 cryo-ET，可在原位可视化观察蛋白质，并整合各机器组分相对于其他 Dot/Icm 亚基的化学计量比及其表达时序。为了研究极区定位的需求以及表征与 T4SS 机器生物发生相关的动态特征，我们将编码超折叠绿色荧光蛋白的基因在其染色体上的天然位置与 Dot/Icm ATP 酶基因进行融合。以下方法整合了对活细胞的定量荧光显微镜分析和 cryo-ET 技术，用于在完整细菌细胞中定量分析这些蛋白质的极区定位、动态行为及结构特征。将这些方法应用于研究 Legionella pneumophila 的 T4SS，有助于表征 Dot/Icm 系统的功能，并可推广用于研究多种利用 T4SS 或其他类型细菌分泌复合物的细菌病原体。

通过双筛选两步法同源重组构建了sfGFP的定点插入。第一步采用三亲接合，其中pRK600接合质粒（一种IncP质粒）来自 E. coli 辅助菌株MT616被转移到供体菌中 E. coli 含有sfGFP基因的自杀型载体pSR47S，该基因两侧为两个同源区域、转移起始位点oriT 枯草芽孢杆菌 反向筛选基因 sacB接下来，利用pRK600的接合系统将pSR47S衍生物 mobilize 到目标菌株中 L. pneumophila (Lp01, 图2A). 通过单次交叉事件成功整合pSR47S的克隆因含有卡那霉素抗性基因Kan而被筛选出来R 并进行传代以允许发生第二次交换。丢失了该片段的克隆 sacB 在第二次交换过程中，通过将细胞铺板于反向筛选剂蔗糖上筛选含有该基因的细胞（图2, 图3</stro...

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila IV型分泌系统的结构与功能。

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

嗜肺军团菌的 Dot/Icm 分泌系统是一种复杂的 IV 型分泌系统（T4SS）纳米机器，定位于细菌极性部位，并……

该方案有助于表征细菌分泌复合物的组装功能，可促进对病原体与宿主相互作用所必需的分子机制的基本理解。该技术整合了多种互补方法，能够在保持样品天然结构的同时，实现对完整细菌细胞内蛋白质复合物的可视化观察。这加深了我们对细菌分泌系统结构与功能关系的理解。该方法可适用于研究多种细菌物种中的其他类型分泌系统或其他细胞复合物。首先制备用于活细胞成像的琼脂糖垫。取约30 mL去离子水配制1%低熔点琼脂糖溶液，放入玻璃烧瓶中，微波加热约90秒，期间偶尔摇动，直至琼脂糖完全溶解。将两片尺寸为 22 × 22 × 0.15 mm 的玻片叠放在一片尺寸为 25 × 75 × 1.1 mm 玻片的一侧边缘，上下叠放。然后，在另一侧边缘同样叠放另外两片较小的玻片。用移液器吸取约 1 mL 熔化的琼脂糖，注入两片上层玻片之间的中心玻片区域，并在熔化的琼脂糖上再放置一片大玻片，注意避免产生气泡。将载玻片置于 4 摄氏度下冷却 15 分钟，然后使用解剖刀或剃刀小心地将垫片切成小方块。在 25 × 75 × 1.1 mm 玻璃载玻片上固定一个双面粘性框架，并将多个垫片放置于载玻片上。将大量 Legionella pneumophila 溶解于 1 mL 双蒸水中。然后涡旋混匀，并用移液器吸取2至3微升稀释液滴加到样品垫上。轻轻将一块58 × 24 × 0.15 mm的盖玻片覆盖在粘性支架上。使用明场照明选择待成像的细胞。然后，在显微镜软件的采集窗口中，将ND值调整为180，合并像素（binning）设置为2×2。使用488纳米通道对样本曝光500至1000毫秒，并采用相同参数对未标记的嗜肺军团菌进行成像，以验证荧光的特异性。为量化极性，调整图像对比度，使细菌清晰可见。然后放大目标区域，使用区域工具在细菌极点处开始绘制一个 0.25 × 1.3 微米的矩形，并延伸至细胞质内，确保该矩形始终位于细菌边界之内。标记至少 200 个细菌，并通过分析菜单中的“区域生成掩膜”按钮创建掩膜。点击“掩膜统计”，在掩膜范围中选择“对象”。然后在“特征”和“强度”下标记平均强度和方差。将数据导出为文本文件，并使用电子表格应用程序计算每个细菌的极性评分，即方差与平均强度的比值。对于高通量应用，使用相差显微镜采集双通道图像。务必选择细菌完全分离的视野。接下来，调整图像的相位通道对比度，使细菌清晰可见。打开双通道图像并启动创建分割掩膜窗口。调整适当的阈值，然后单击“定义对象”按钮，并将最小尺寸调整为 100 像素，以去除小的物体。在“优化掩膜”中，选择去除边缘物体，并将彼此相邻的细菌的掩膜分离开。为了定量分析融合蛋白的动态变化，打开图像采集窗口并标记时间序列。在时间点数量框中输入 2。获取两幅成功表达目标荧光蛋白的嗜肺军团菌图像。调整图像对比度，直至细胞清晰可见。然后使用区域工具，在至少400个细胞的中央放置一个0.25 × 0.25 µm的正方形。接着，在分析菜单中使用“区域到掩膜”按钮，创建感兴趣正方形区域的掩膜。新建一个空白掩膜，并使用像素工具标记至少25个随机细胞的整个细胞区域。创建另一个掩膜，并使用大号画笔工具标记细胞之间的区域。最后，选择掩膜统计，并确保在掩膜一的掩膜范围下选择了“对象”。在特征与强度中，选择平均强度。导出数据并对掩膜2重复该过程。对于掩膜3，选择整个掩膜并导出平均强度。为制备电子低温断层扫描样品，将嗜肺军团菌在CYE Agrastreptomisum平板上于37摄氏度培养48小时，形成浓密菌斑。将细胞重悬于水中，使 OD 600 约为 0.7。然后向 20 微升细胞悬液中加入 5 微升胶体金颗粒。对有孔碳膜载网进行辉光放电处理，并用移液器将 5 微升细胞混合液滴加到载网上。静置一分钟。用滤纸吸去载网上的液体，然后使用重力驱动的压片装置在液态乙烷中快速冷冻。在将超折叠绿色荧光蛋白（superfolder GFP）插入嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）染色体后，进行活细胞荧光显微镜观察，以比较其荧光信号与亲本超折叠GFP阴性菌株的荧光信号。此外，使用明场显微镜检测具有特定荧光信号的细胞比例。仅有部分表达 DotB superfolder GFP 的细胞显示出融合蛋白的极性定位。在表征 DotB 荧光信号分布时发现，极区 DotB superfolder GFP 的荧光强度约为细胞质中的两倍。为了研究 DotB 超折叠 GFP 的极性定位是否依赖于完整组装的 IV 型分泌系统，我们测定了野生型菌株及 IV 型分泌系统突变株中单个细胞的 DotB 超折叠 GFP 极性评分。事实上，当 Dot/ICM 系统被删除后，DotB 超折叠 GFP 的极性定位消失。动态模式表明，DotB ATP 酶存在于动态的细胞质群体中，并在晚期组装反应阶段被招募至极性定位的 Dot/ICM IV 型分泌系统。采用高通量冷冻电子断层扫描技术，对表达DotB超折叠GFP的嗜肺军团菌菌株中的完整IV型分泌系统装置进行了可视化观察。通过对细胞进行重构，揭示了多个Dot/ICM复合物嵌入于细胞包膜中。同时确定了DotB及超折叠GFP相对于完整IV型分泌系统复合物的整体定位。三维表面渲染结果表明，超折叠GFP位于DotB六聚体下方，而DotB在细胞质ATP酶复合物基部组装成盘状结构。在尝试该技术时，务必在进行图像采集之前评估融合蛋白的稳定性以及标签分泌系统的功能。建模与拟合可有效用于分析动态模式和结构密度，也可用于评估构象变化或将亚基定位到结构中的位置。该方法有助于理解不同IV型分泌系统组分的功能、它们在更大复合物中的相互作用方式，以及不同亚复合物所执行的功能。

applying-live-cell-imaging-cryo-electron-tomography-to-resolve

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

应用活细胞成像和低温电子断层扫描解决军团菌肺瘤点/Icm分泌系统的时空特征

本文展示了如何利用电子冷冻断层扫描技术（ECT）在接近天然的状态下研究细菌细胞的超微结构，分辨率可达“大分子”级别（约4...

细菌细胞的电子冷冻断层扫描技术

相关联的光学与电子显微镜技术（CLEM）作为可视化显微注射分子及其真核细胞亚细胞靶标的工具

来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析细胞时空动态特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视频实验杂志 (2020)本视频展示了利用活细胞荧光成像技术定量分析嗜肺军团菌（Legionella...

量化 Legionella pneumophila 分泌系统组分的极性与动态性

来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析细胞时空特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视觉实验杂志. (2020)该视频介绍了通过结合细菌培养、金纳米颗粒标记和玻璃化冷冻技术，制备嗜肺军团菌（Legionella...

制备 嗜肺军团菌 用于冷冻电子断层扫描

来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视频实验杂志.

荧光标记细菌的样品制备与成像

我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。...

动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

了解细菌中必需过程的功能具有挑战性。利用靶向特异性染料进行荧光显微镜观察，可为微生物细胞生长和细胞周期进程提供关键见解。本文以Agrobacterium...

活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

本文介绍了一种用于制备纳升级样品体积以进行透射电子显微镜观察的仪器及方法。该方法无需滤纸吸 blotting...

用于透射电子显微镜的微型化样品制备

采用相关联的光镜与电镜显微技术（CLEM），通过电子显微镜（EM）对先前经光镜（LM）筛选出的细胞中病毒诱导产生的细胞内结构进行成像。将光镜与电镜结合为一种混合成像方法，以实现对病毒与宿主相互作用的整合性观察。...

用于追踪和成像冷冻固定细胞中病毒蛋白相关结构的关联光镜与电镜技术

本文描述了制备适用于在纳米尺度下通过透射电子显微镜进行液相电镜和冷冻电镜分析的病毒组装体的实验方案。...

在液体和冰中推进病毒组装的高分辨率成像

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1...

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

学习活细胞成像与低温电子断层扫描技术，用于解析军团菌Dot/Icm IV型分泌系统的时空组装特征。该方法整合互补技术保留样本天然结构，实现完整细菌细胞内蛋白质复合物的可视化。

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

探索更多视频

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

探索更多视频

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统