在表面定植微生物种群监测空间分异

该程序的总体目标是使用荧光显微镜观察微生物菌株在蜂群、滑动或生物膜形成过程中的空间分布。这种方法可以帮助回答社会微生物学领域的关键问题，例如空间分离如何影响微生物相互作用。该技术的主要优点是可以使用显微技术和子段图像分析轻松评估微生物菌株的适应性和空间分布。

演示该程序的是我实验室的博士研究员 Theresa Holscher。在实验前一天，将 3 毫升 LB 培养基加入培养管中，并从枯草芽孢杆菌的冷冻库存中接种。对每个感兴趣的菌株用单独的试管重复接种。

将试管放入 37 摄氏度的水平振荡培养箱中过夜。为了准备用于聚集和滑动实验的板，将 20 毫升回火的 LB 培养基倒入 90 毫米的聚苯乙烯培养皿中。立即关闭培养皿，将其放在无菌罩的一侧冷却至少一小时。

接下来，通过将 25 毫升琼脂倒入 90 毫米培养皿中，将 2 倍 SG 培养基倒入菌落生物膜实验板中。立即关闭板子，将它们设置为以 4 个或更少的一组形式冷却至少 1 小时。首先，将 LB 琼脂群和滑板放入层流罩中，然后取下盖子。

让板子干燥 20 分钟。在这些实验中，板的湿度至关重要。虽然过多的水分会让细菌游动，但长时间的干燥可以防止蜂群和滑动。

同样，菌落生物膜结构取决于培养基的干燥度。使用分光光度计，确定 600 纳米过夜发酵剂培养物的光密度。在 1.5 mL 微量离心管中，混合密度归一化量的绿色和红色荧光蛋白产生菌株，总共 200 μL。

涡旋试管 3 秒钟。使用微量移液器，将两微升混合培养物点到层流罩中预干燥的 90 毫米 LB 琼脂板的中心。将板子晾干 10 分钟。

最后，将板在 37 摄氏度下直立孵育，以防止冷凝水聚集在琼脂表面。首先，将两次 SG 琼脂平板置于层流罩中 15 分钟干燥。接下来，将产生绿色和红色荧光蛋白的生物膜菌株、枯草芽孢杆菌 168 起始培养物各 100 微升添加到 1.5 毫升微量离心管中。

涡旋试管 3 秒钟。用 100 微升 LB 培养基制备试管，并使用混合培养物，制备 10 倍稀释的接种物系列。使用微量移液器，将两微升未稀释的混合培养物点到两次 SG 琼脂平板上。

重复此作，接种 10 到 1、10 到 2、10 到 3 和 10 到 4 个稀释液，以相等的距离间隔点，以允许 6 到 9 个菌落在一个培养皿上生长。将板在 30 摄氏度下直立孵育 1 到 3 天。首先，将板放在荧光检测显微镜的成像平台上。

对于滑动和蜂群实验，将接种起点（培养皿的中间）设置为可见视野的一角，以便测量放射状集落扩增。将放大倍率调整到最高分辨率，以便对 90 毫米板的最大可能区域进行成像。根据荧光信号的强度适当调整曝光时间。

对于生物膜分析，将感兴趣的菌落放置在视野的中心。将放大倍数设置为允许查看整个菌落的最高分辨率。菌落现在已准备好进行测量和分析。

最后，按照文本协议中的说明分析数据。该图显示了典型的双菌株共接种的枯草芽孢杆菌菌落的生长。蜂群是一种依赖于鞭毛的集体表面运动，导致种群高度混合。

在这个延时视频中，初始孕育剂被放置在板铺展的中心。可以清楚地观察到薄层蜂群，随着菌落的发育，两种红色和绿色荧光菌株出现混合和重叠。相反，滑动行为的图像显示了与不同标记的荧光菌株相对应的确定的生长区域。

该视频显示了滑动共接种菌落的生长，其中菌株缺乏功能性鞭毛。这些菌落仍然能够使用分泌的外多糖、疏水素和表面活性素的组合进行传播。与蜂群菌株相比，所得菌落显示出不同的空间生长分类。

生物膜产生菌落的起始细胞密度严重影响了所得菌落的空间分类。以混合群体的高细胞密度开始的菌落显示出少量或没有空间分类。相比之下，当开始时的细胞密度较低时，可以检测到清晰的绿色和红色荧光扇区。

观看此视频后，您应该对如何确定微生物菌落中荧光标记菌株的相对丰度、检查空间分离以及研究创始细胞密度的影响有一个很好的了解。