Name: 在表面定植微生物种群监测空间分异 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习利用荧光显微镜观察枯草芽孢杆菌在群体运动、滑动和生物膜形成过程中的空间分布。该方法通过调控初始细胞密度，帮助研究人员分析微生物菌株的空间分异及其相互作用机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号为KO4741/3-1。此外，Á.T.K.的实验室还获得了玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里职业融合资助（PheHetBacBiofilm）以及德国研究基金会（DFG）项目编号KO4741/2-1的资助。T.H.、A.D.、R.G.-M.和E.M.分别获得了国际马克斯·普朗克研究学院、亚历山大·冯·洪堡基金会、墨西哥国家科学技术委员会-德国学术交流中心（CONACyT-DAAD）以及JSMC奖学金的资助。

1. 培养基、半固体琼脂和生物膜平板的制备，预培养
<ol>
	<li>群集与滑动运动培养基的制备
	<ol>
		<li>将 2 g 胰蛋白胨大豆肉汤（LB）和 0.7 g 琼脂粉溶解于 100 ml 去离子水中，于 120 °C 高压灭菌 20 分钟。使用较小体积（50–200 ml）以提高实验间的可重复性。</li>
		<li>灭菌后立即盖紧培养基瓶盖以减少蒸发，并将瓶子置于 55 °C 培养箱中至少 2 小时。</li>
		<li>待培养基温度降至 55 °C 后，在实验室无菌操作台中将 20 ml 琼脂 LB 培养基倒入直径为 90 mm 的聚苯乙烯培养皿中。对于延时成像实验，每个直径为 35 mm 的聚苯乙烯培养皿中倒入 5 ml 琼脂 LB 培养基。</li>
		<li>倾注后立即盖上培养皿盖，最多叠放 4 个培养皿，并让琼脂培养基静置凝固至少 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>菌落生物膜用 2xSG 培养基的制备
	<ol>
		<li>将 1.6 g 营养肉汤（Nutrient Broth）、0.2 g KCl、0.05 g MgSO4·7H2O 和 1.5 g 琼脂粉溶解于 100 ml 去离子水中，于 120 °C 高压灭菌 20 分钟。使用较小体积（50–200 ml）以提高实验间的可重复性。</li>
		<li>灭菌后立即盖紧培养基瓶盖以减少蒸发，并将瓶子置于 55 °C 培养箱中至少 2 小时。</li>
		<li>待培养基温度自然降至 55 °C 后，加入 0.1 ml 滤膜灭菌的 1 M Ca(NO3)2 溶液、0.1 ml 滤膜灭菌的 100 mM MnCl2 溶液、0.1 ml 滤膜灭菌的 1 mM FeSO4 溶液以及 0.5 ml 无菌的 20% 葡萄糖溶液。</li>
		<li>在实验室无菌操作台中，将 20 ml 琼脂 2xSG 培养基倒入每个直径为 90 mm 的聚苯乙烯培养皿中。对于延时成像实验，每个直径为 35 mm 的聚苯乙烯培养皿中倒入 5 ml 琼脂 LB 培养基。</li>
		<li>倾注后立即盖上培养皿盖，最多叠放 4 个培养皿，并让琼脂培养基静置凝固至少 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>起始培养物的制备 
	注：本方法中使用的 B. subtilis 168 和 NCIB 3610 衍生菌株可组成型表达绿色或红色荧光蛋白，此前已有描述8,27。菌株常规保存于 -80 °C 冰箱中。
	<ol>
		<li>从 -80 °C 保存的菌种中接种 3 ml LB 培养基作为起始培养物，在 37 °C 条件下以水平摇床（225 rpm）振荡培养过夜（16–18 小时）。培养时间不得超过 18 小时，因为野生型 B. subtilis 菌株大多容易发生聚集并在试管中形成生物膜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 荧光标记细菌菌株的共接种以实现表面扩散
<ol>
	<li>用于枯草芽孢杆菌（B. subtilis）群集与滑动的半固体琼脂平板的干燥。
	<ol>
		<li>接种前将用于群集和滑动的琼脂平板敞口干燥20分钟。在超净工作台中进行干燥（见图1）。 
		注意：细菌的群集和滑动行为依赖于半固体琼脂培养基的干燥程度。干燥不足会导致琼脂表面积水，从而引发鞭毛介导的游动行为；而过度干燥则会抑制群集现象的发生。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="培养皿培养过程：倒入培养基、干燥平板、点样培养、在显微镜下孵育。" src="/files/ftp_upload/54752/54752fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程。 图中展示了常见的实验步骤，包括培养基的制备、平板干燥、接种以及荧光显微镜检测（从左至右）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/54752fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>群集与滑行运动的细菌共接种
	<ol>
		<li>测定过夜培养物在 600 nm 处的光密度，并在 1.5 ml 反应管中混合经密度归一化的产绿色和红色荧光蛋白的 B. subtilis NCIB 3610 菌株或其 Δhag 突变株。例如，将 100 μl 菌株 1 与 (100×[菌株 1 过夜培养物的 OD600]/[菌株 2 过夜培养物的 OD600]) μl 的菌株 2 混合。轻微涡旋振荡（最大速度 3 秒）以实现均匀分布。 
		注意：B. subtilis NCIB 3610 菌株用于观察群集运动，而其 Δhag 突变株用于观察滑行运动。</li>
		<li>取 2 μl 混合菌液点种于预干燥的培养板中央（见图 1），接种后继续干燥 10 分钟。</li>
		<li>将培养板直立于 37 °C 培养，使多余水分凝结于盖子上，而非琼脂表面。 
		注意：B. subtilis 群集运动的培养时间通常为 8–16 小时。一般情况下，群集边缘在 8 小时内可达到 90 mm 培养皿的边缘。滑行运动较慢，需至少 16 至 42 小时的培养时间。36 小时后，滑行前沿可达到 90 mm 培养皿的边缘。</li>
		<li>对于延时实验，将直径为 35 mm 的培养皿置于预热至 37 °C 的显微镜载台培养室中。实验期间需始终保持培养皿盖打开。将载台培养室的盖子温度设为 40 °C，以防止培养室顶部形成冷凝水。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 不同初始细胞密度的荧光标记细菌菌株共接种
<ol>
	<li>用于 B. subtilis 菌落生物膜形成的琼脂平板干燥。
	<ol>
		<li>接种前，在超净工作台中将平板不加盖干燥 15 分钟。 
		注意：干燥不足会导致湿度升高，可能引发游动或群集运动29；干燥时间过长则会导致生物膜菌落变小。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>菌落生物膜用 10 倍稀释起始培养物的制备
	<ol>
		<li>在 1.5 ml 离心管中混合 100 μl 产生绿色和红色荧光蛋白的 B. subtilis 168 过夜起始培养物，并轻微涡旋以实现均匀分布。在 LB 培养基中制备 10 倍系列稀释液。</li>
		<li>将未稀释或 101、102、103、104 稀释的混合培养物各 2 μl 点样于含有诱导生物膜形成培养基的平板上。 
		注意：单个 90 mm 培养皿上可接种 6 至 9 个生物膜菌落，需确保各菌落之间等距分离。</li>
		<li>将平板直立置于 30 °C 培养箱中孵育，使多余水分凝结在皿盖上而非琼脂表面。 
		注意：B. subtilis 生物膜的孵育时间为 1 至 3 天。通常情况下，B. subtilis 菌落生物膜在 2 天内达到其平均大小和复杂结构。</li>
		<li>对于延时成像实验，将单个接种物置于直径 35 mm 培养皿中央，并将培养皿放入预热至 30 °C 的显微镜载物台培养室中。实验全程保持培养皿盖打开状态。将载物台培养室的盖子温度设为 35 °C，以防止培养室顶部产生冷凝水。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 标记菌株的荧光显微镜检测
<ol>
	<li>成像设备说明。
	<ol>
		<li>为检测表面定植和荧光信号，使用配备0.5X PlanApo物镜、两个LED冷光源（一个用于荧光检测，一个用于可见光）、GFP滤光片组（激发光470/40 nm，发射光525/50 nm）和mRFP滤光片组（激发光572/25 nm，发射光629/62 nm）以及高分辨率黑白相机的电动荧光体视变倍显微镜（详见材料表中的详细列表）。</li>
		<li>使用适用于该体视变倍显微镜的配套软件进行图像采集与处理，软件需包含多通道和延时成像模块。进行延时实验时，将标准加热载台孵育器通过适配器安装至体视变倍显微镜上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>群集运动与滑行扩展的成像
	<ol>
		<li>使用最低放大倍数以捕获90 mm培养皿中尽可能大的区域。将接种原点（90 mm培养皿中心）置于视野角落，以便监测细菌的径向扩展及荧光信号。</li>
		<li>根据荧光信号强度调整最佳曝光时间。 
		注：对于B. subtilis中组成型表达的荧光基因，绿色和红色荧光可分别采用1.5秒和3秒的曝光时间；此外，可见光成像适宜的曝光时间为10毫秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用能够完整捕获整个生物膜菌落的放大倍数，并将菌落调整至视野中央。 
	注：与群集运动和滑行扩展类似，检测生物膜菌落中荧光信号的最佳曝光时间取决于荧光蛋白编码基因的表达水平。在下文展示的代表性结果中，绿色和红色荧光分别采用1秒和3秒的曝光时间进行检测。</li>
	<li>进行延时成像时，以固定曝光时间在特定时间间隔获取图像。</li>
	<li>将荧光体视显微镜记录的图像保存为ImageJ软件可识别的文件格式，以便进行定量数据分析。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用扩展了 BioVoxxel 插件的 ImageJ 软件打开相关文件，以分析每种不同荧光标记菌株所占据的区域。
	<ol>
		<li>当名为“Bio-Formats Import Options”的窗口出现，且仅选中“Open all series”和“Autoscale”选项时，点击“OK”打开文件。 
		注意：文件以三幅图像叠加的形式显示，每幅图像对应显微镜成像时使用的三个通道之一（绿色荧光、红色荧光和明场图像）。</li>
		<li>在 ImageJ 控制面板中选择“图像”-“堆栈”-“堆栈转图像”，将堆栈分离为单个通道图像。 
		注：图像显示并编号为1/3（绿色通道）、2/3（红色通道）和3/3（明场）。此处，明场图像未纳入分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为分析图像，选择“图像”-“类型”-“8位”，将每幅图像转换为8位图像。</li>
	<li>确定像素中的占据面积2，使用“分析” - “设置比例”重置图像的比例。当弹出包含不同比例选项的窗口时，选择“单击以移除比例”来重置比例。勾选“全局”选项，以移除所有已打开图像的比例。</li>
	<li>为去除背景，在ImageJ控制面板中使用“椭圆”工具在荧光区域外绘制一个椭圆形区域（感兴趣区域，ROI）。
	<ol>
		<li>为确保所有分析图像的背景椭圆尺寸一致，通过键盘上的 [t] 键将其添加至 ROI 管理器。此时将弹出 ROI 管理器窗口，可通过“更多”-“保存”选项保存背景椭圆 ROI。</li>
		<li>如果图像上可见背景椭圆感兴趣区域（ROI），选择“分析”-“测量”以测定该区域的强度。 
		注意：结果窗口中会显示平均荧光强度，位于标有“Mean”的列中。</li>
		<li>取消选中背景椭圆 ROI，点击“Process” - “Math” - “Subtract”，输入测得的数值，从图像中减去平均背景荧光强度值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过“图像”-“调整”-“阈值”选项对图像应用阈值。选择Otsu方法并设为黑色 &amp; 白色（B&amp;W）。勾选“暗背景”选项，并通过点击“应用”来使用阈值。 
	注意：图像将变为二值图像，阈值以上的区域显示为白色，阈值以下的区域显示为黑色。</li>
	<li>通过“分析”-“分析颗粒”选项，选择高于阈值的所有区域。在设置窗口中，保留默认选项，并确保勾选“显示结果”和“汇总”选项。单击“确定”，在结果窗口中显示汇总信息，并在标记为“总面积”的列中显示所占面积。</li>
</ol>

<ol><li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
<li>West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+evolution+theory+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Social evolution theory for microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).</li>
<li>Kovács, ÁT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+spatial+distribution+on+the+development+of+mutualism+in+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes.</a> Front Microbiol. 5, 649(2014).</li>
<li>Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evolution+of+microbial+interactions+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms.</a> J Bacteriol. , (2016).</li>
<li>Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutions+to+the+public+goods+dilemma+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms.</a> Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).</li>
<li>Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+self-organization+favors+heterotypic+cooperation+over+cheating%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating.</a> Elife. 2, e00960(2013).</li>
<li>van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+population+expansion+promotes+the+evolution+of+cooperation+in+an+experimental+Prisoner%27s+Dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma.</a> Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).</li>
<li>van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+of+founder+cells+affects+spatial+pattern+formation+and+cooperation+in+Bacillus+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms.</a> ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).</li>
<li>Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+inter-population+cooperation+leads+to+partner+intermixing+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities.</a> Elife. 2, e00230(2013).</li>
<li>Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+drift+opposes+mutualism+during+spatial+population+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).</li>
<li>Pande, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Privatization+of+cooperative+benefits+stabilizes+mutualistic+cross-feeding+interactions+in+spatially+structured+environments%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments.</a> ISME J. 10, 1413-1423 (2016).</li>
<li>Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+drift+at+expanding+frontiers+promotes+gene+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticking+together%3A+building+a+biofilm+the+Bacillus+subtilis+way%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).</li>
<li>Lopez, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signals+that+define+distinct+and+coexisting+cell+fates+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).</li>
<li>Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+environmental+signals+to+regulators%3A+Modulation+of+biofilm+development+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Basic+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria.</a> J Basic Microbiol. , (2014).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+depletion+in+Bacillus+subtilis+bio%EF%AC%81lms+triggers+matrix+production%5BTitle%5D)+AND+%22New+J+Physics%22%5BJournal%5D)">Nutrient depletion in Bacillus subtilis bioﬁlms triggers matrix production.</a> New J Physics. 16, 015028(2014).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+imaging%2C+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+spreads+by+surfing+on+waves+of+surfactant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).</li>
<li>Grau, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Duo+of+Potassium-Responsive+Histidine+Kinases+Govern+the+Multicellular+Destiny+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis.</a> MBio. 6 (4), e00581(2015).</li>
<li>Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagella-independent+surface+motility+in+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).</li>
<li>van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cell+differentiation+to+cell+collectives%3A+Bacillus+subtilis+uses+division+of+labor+to+migrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate.</a> PLoS Biol. 13 (4), e1002141(2015).</li>
<li>Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+dispersal+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).</li>
<li>Kovács, ÁT. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+differentiation+via+gradual+activation+of+global+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators.</a> Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).</li>
<li>Hölscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+chemotaxis+and+aerotaxis+contribute+to+competitiveness+during+bacterial+pellicle+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development.</a> J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).</li>
<li>Seminara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+spreading+of+Bacillus+subtilis+biofilms+driven+by+an+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).</li>
<li>Patrick, J. E., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+strains+of+Bacillus+subtilis+do+not+exhibit+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility.</a> J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+Time-lapse+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy.</a> J Vis Exp. (53), e3145(2011).</li>
<li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Turnbull, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+the+cytokinetic+Z+ring+in+live+bacteria+using+fast+3D-structured+illumination+microscopy+%28f3D-SIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM).</a> J Vis Exp. (91), e51469(2014).</li>
<li>Barken, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+type+IV+pili%2C+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).</li>
<li>Oliveira, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+a+response+to+ecological+competition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as a response to ecological competition.</a> PLoS Biol. 13 (7), e1002191(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+phenotypic+growth+in+expanding+Bacillus+subtilis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).</li>
<li>Detert Oude Weme, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+FRET+analysis+for+the+identification+of+optimal+FRET-pairs+in+Bacillus+subtilis+using+a+prototype+MEM-FLIM+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system.</a> PLoS One. 10 (4), e0123239(2015).</li>
<li>Overkamp, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+various+green+fluorescent+protein+variants+in+Bacillus+subtilis%2C+Streptococcus+pneumoniae%2C+and+Lactococcus+lactis+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).</li>
<li>Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+intraspecies+competition+in+a+bacterial+cell+population+by+cocultivation+of+fluorescently+labelled+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains.</a> J Vis Exp. (83), e51196(2014).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+quantification+of+cellular+and+extracellular+components+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms.</a> J Vis Exp. (82), e50639(2013).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
</ol>

本视频文章开放获取&#160;由……支付&#160;卡尔·蔡司显微镜有限公司 &#160;

用于细菌的荧光工具箱不仅有助于研究基因表达的异质性30,31和蛋白质定位32，还可用于分析菌株在群体内的空间分布8。具有足够不同激发和发射波长的荧光标记物可实现两种菌株的清晰区分，即使它们在混合时原本无法彼此识别。本方案可用于观察混合培养物中的群体动态，e.g. 菌株或物种之间的竞争实验或协同作用。确定荧光标记菌株在混合群体中相对丰度的能力不仅适用于表面附着的群游、滑行或生物膜菌落，还可应用于其他多细胞生物膜系统，包括浸没式、流动池或气-液界面生物膜27,33-35。
尽管该技术是检测菌株空间分布和设计竞争实验的有力工具，但它也可用于追踪扩展菌落中的基因表达异质性。B. subtilis 可采用此处描述的培养条件，而其他物种或菌株在琼脂培养基上扩展时，其具体参数可能需要优化20。成像过程中将样品置于培养室中，可使实验者随时间追踪群体动态，但需注意培养期间培养室内的湿度水平。
此处描述的技术还需要对受检细菌菌株进行遗传改造，使其表达可相互区分的荧光标记物。此外，除了具有不同的激发和发射光谱外，建议所选的两种荧光标记物具有相似的量子产率（i.e. 吸收光子后重新发射光子的比例），并且表达水平相近。另外，还可以测量实验过程中随时间变化的相对强度，并将其归一化至实验早期的时间点。随后可在不同量子效率的荧光团之间比较其相对增强或减弱的程度。对于本研究所采用的实验系统，先前已测试过多种绿色和红色荧光蛋白36,37，以筛选出最适合在 B. subtilis 中检测的荧光蛋白组合。每种荧光蛋白和样品均应确定最佳曝光时间。在群体中有效检测信号可能需要特定的细胞密度或细胞多层结构。某些荧光蛋白在细菌细胞中可能因表达和/或翻译效率低下而导致信号强度较低，从而造成量子产率偏低。此类低效的荧光标记物可能会降低系统的灵敏度，并延长检测细菌菌株所需的时间，进而可能引起激发光导致的细胞毒性。可通过更换用于表达荧光报告基因的启动子来相应调节荧光强度。表达水平过高可能导致荧光蛋白的不必要过量产生，从而对细菌造成不利的适合度代价。在进行竞争实验时，应考虑细胞内特定荧光蛋白生产所带来的适合度代价。必须进行对照实验，例如将荧光标记物在相互竞争的菌株之间互换，或让仅在荧光标记上不同的两个同源菌株相互竞争，以确定是否存在对某一标记物的偏向性。荧光蛋白在细胞内的寿命也可能影响测得的荧光强度。此外，某些细菌物种的自发荧光可能需要使用与本文所述不同的荧光标记物。
为精确定位不同细菌菌株的空间分布并测定其丰度，应使用单一荧光标记的单菌落样本（仅表达一种标记物的细菌）分别检测在采用第二种荧光标记的滤光片时第一种荧光蛋白产生的背景信号，反之亦然。这有助于扣除重叠的荧光信号强度。值得注意的是，由于体视显微镜是从正在扩展的菌落上方采集荧光信号，本方案适用于测定菌群在二维平面上的空间排列。细菌群体的扩展结构可能导致荧光强度出现差异即 皱纹状结构可能含有更多表现出较高局部荧光强度的细胞）。因此，上述图像分析可确定菌株在特定位置的空间分布，但无法反映其丰度。先前的实验方案已描述了群集运动样品的制备方法20 或对细菌菌落群体动态的荧光成像38，但我们的方案结合了这些技术。其他显微镜技术可实现对群体结构三维分辨率的观察（例如 共聚焦激光扫描显微镜39,40 或结构照明显微镜技术41) 可用于结构复杂性较高的样品。这些附加技术还支持基于单细胞的菌株检测31 这是使用体视显微镜无法获得的。

近几十年来，微生物已被认为是与地球上各种生态系统相关的社会性群落1,2。与常规实验室实践中使用的浮游培养物不同，环境中的微生物会根据生态条件呈现出多种多样的空间群落结构。利用简单的微生物系统可用来理解空间结构对微生物社会性相互作用演化的影响3,4。过去两到三年中，使用真核和原核模型系统的研究成果突显了空间结构对微生物种群内合作稳定性的重要影响5-8。此外，微生物之间的专性相互作用，例如代谢互养，也可能改变相互作用伙伴的空间分布9-11。在这些研究中，空间结构的影响主要通过附着在表面的固着细胞（即所谓的生物膜）或在琼脂培养基表面生长的菌落来考察。在微生物菌落中，由于细胞分裂驱动的扩展前沿出现营养耗竭，会引发一系列遗传瓶颈，导致某些克隆谱系具有较高的局部固定概率，从而观察到可引起高度空间分选的遗传漂变12。因此，可利用遗传漂变来研究空间隔离在微生物菌落中的作用。
在自然环境中，生物膜是由多种微生物组成的群落，其周围被自身产生的聚合物基质所包围13。生物膜的结构、功能和稳定性依赖于复杂的社会性相互作用网络，细菌之间通过该网络交换信号分子、基质组分和资源，或利用毒素和抗生素竞争空间与营养。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种生活在土壤中并能定殖植物根部的细菌，可形成高度有序的生物膜群落14。类似于社会性昆虫，B. subtilis 细胞采用劳动分工策略，分化出产生胞外基质的亚群和食同类细胞、运动细胞、休眠芽孢及其他类型的细胞15,16。这种分化过程具有动态性，并可受环境条件的影响而发生改变17,18。
通过调整培养基中的琼脂浓度，可在实验室条件下轻松操控细菌的表面定植策略。在低琼脂浓度（0.2–0.3%）下，具有活性鞭毛的细菌能够进行游动；而在半固体琼脂（0.7–1% 琼脂）条件下，则促进由鞭毛驱动的群体扩散，称为群集运动。19-21在缺乏鞭毛的情况下，某些细菌菌株能够通过滑行在半固体培养基上移动。 即 依赖生长的种群扩增，由胞外多糖基质及其他分泌的疏水蛋白化合物介导22-24最后，能够形成生物膜的细菌会在硬度较高的琼脂培养基（1.2–2%）上形成结构复杂的菌落。14,17,25尽管这些性状可在实验室中通过精确调控条件进行研究，但在自然生境中，这些表面扩散策略可能会随着环境条件的变化而逐渐从一种模式过渡到另一种模式。26尽管单细胞运动性在革兰氏阳性菌和阴性菌于气-液界面启动生物膜发育过程中至关重要27，复杂的菌落生物膜 B. subtilis 不受鞭毛运动性缺失的影响28然而，发育过程中空间结构的形成 B. subtilis 菌落生物膜的形成依赖于用于启动生物膜的细菌接种物的密度8.
此处，我们使用 枯草芽孢杆菌 表明表面定植过程中的空间分离依赖于群体水平运动性的机制（即 群集或滑动）的形成以及菌落生物膜的发育依赖于起始细胞密度。我们介绍一种荧光显微镜工具，可用于连续监测微生物生物膜在宏观尺度上的生长、表面定植及分选过程。此外，还提供了一种定量方法，用于测定群体中不同菌株的相对丰度。

<table><tbody><tr><td>LB 培养基</td><td>卡尔·罗斯特有限责任公司</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>琼脂，神户 I</td><td>卡尔·罗斯有限责任公司</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（90 mm 直径）</td><td>任何</td><td>NA</td><td>使用无通风槽的培养皿</td></tr><tr><td>培养皿（35 mm 直径）</td><td>任何</td><td>NA</td><td>使用无通风槽的培养皿</td></tr><tr><td>Difco 营养肉汤</td><td>BD 欧洲</td><td>234000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>任何</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>任何</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>任何</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>任何</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>任何</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>任何</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;荧光AxioZoom V16延时显微镜&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;卡尔·蔡司显微镜有限公司&lt;/strong&gt;</td><td></td><td>&lt;强&gt;见下文详细描述&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>AxioZoom V16 显微镜机身</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435080 9030 000</td><td></td></tr><tr><td>Phototube Z 100:0 适用于 Axio Zoom V16</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435180 9020 000</td><td>无目镜</td></tr><tr><td>Fluar Illuminator Z 与用于 Axio Zoom.V16 的荧光中间管</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435180 9060 000</td><td></td></tr><tr><td>控制器 EMS 3</td><td>卡尔·蔡司显微镜有限公司</td><td>435610 9010 000</td><td></td></tr><tr><td>系统控制面板 SYCOP 3</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435611 9010 000</td><td></td></tr><tr><td>反射模块 Z</td><td>卡尔·蔡司显微镜有限公司</td><td>435180 9160 000</td><td>用于 Axio Zoom.V16 和 SYCOP 3 的 Fluar Illuminator Z mot</td></tr><tr><td>滤光片组 38 HE eGFP 无偏移（E）</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>489038 9901 000</td><td>EX BP 470/40，BS FT 495，EM BP 525/50</td></tr><tr><td>滤光片组 63 HE mRFP 无漂移（E）</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>489063 0000 000</td><td>EX BP 572/25，BS FT 590，EM BP 629/62</td></tr><tr><td>马萨诸塞大学</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435402 0000 000</td><td></td></tr><tr><td>PlanApo Z 0.5x/0.125 物镜，前工作距离 114 mm</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435280 9050 000</td><td>164 毫米齐焦距；前端螺纹为 M62×0.75</td></tr><tr><td>带轮廓柱的粗/精驱动</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435400 0000 000</td><td>490 毫米，10 千克负载能力，兼容 300/450 型底座支架</td></tr><tr><td>支架底座 450</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435430 9902 000</td><td></td></tr><tr><td>冷光源 Zeiss CL 9000 LED CAN</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>435700 9000 000</td><td></td></tr><tr><td>CAN总线电缆</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>457411 9011 000</td><td>2.5 米长度</td></tr><tr><td>狭缝环形照明器</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>417075 9010 000</td><td>d = 66 mm</td></tr><tr><td>柔性光导 1500</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>417063 9901 000</td><td>8/1,000 毫米&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>光导照明适配器</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>000000 1370 927</td><td></td></tr><tr><td>液态填充光导 HXP</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>000000 0482 760</td><td>&amp;oslash;3 mm × 2,000 mm</td></tr><tr><td>相机适配器 60N-C&amp;nbsp;</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>426113 0000 000</td><td>2/3&quot; 0.63X</td></tr><tr><td>高分辨率显微镜相机 AxioCam MRm Rev. 3 FireWire</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>426509 9901 000</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam FireWire 触发线缆套装</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>426506 0002 000</td><td>用于直接快门同步</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>410135 1002 120</td><td>蓝色版本，需至少 Windows 7 64 位系统</td></tr><tr><td>ZEN模块 时间推移</td><td>卡尔蔡司显微镜有限公司</td><td>410136 1031 110</td><td></td></tr><tr><td>标准加热台顶部培养箱</td><td>Tokai Hit</td><td>INUL-MS1-F1</td><td></td></tr><tr><td>蔡司体视显微镜底座适配器</td><td>东海日立</td><td>MS-V12</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国马里兰州贝塞斯达，美国国立卫生研究院</td><td>v 1.49m</td><td></td></tr><tr><td>BioVoxxel 插件</td><td>BioVoxxel</td><td></td><td>http://www.biovoxxel.de/development/</td></tr></tbody></table>

监测表面定植微生物群体中的空间分离现象

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

微生物为研究种群内个体间的社会相互作用提供了一个引人入胜的体系。由于微生物世代时间短，且遗传改造操作相对简便，这促进了社会微生物学领域的发展。为了评估某一特定微生物物种、所选菌株或其基因改造衍生物在同一种群中的适合度，可使用适配了相应荧光滤光片的显微镜，对它们进行荧光标记并追踪。在琼脂培养基上扩展的多种微生物菌落可用于监测表达不同荧光蛋白的细胞在空间上的分布情况。
本文介绍了一种详细的实验方案，利用表达绿色和红色荧光蛋白的细菌菌株，研究细菌在表面定植过程中的空间分布，包括鞭毛驱动的群体运动（swarming）、依赖胞外多糖和疏水蛋白的生长介导扩散（sliding），以及复杂的菌落生物膜形成。可使用非驯化的革兰氏阳性细菌Bacillus subtilis分离株来深入分析某些表面扩散特性及其在琼脂固化培养基上二维分布的影响。通过调整起始菌落生物膜的细胞数量，可在连续范围内调节其分选水平。利用延时荧光显微镜，可观察在特定分选水平下不同表型与基因型之间的相互作用，并评估各自的相对成功程度。

细菌种群的实验室系统为探索生态学或进化生物学问题提供了一种有效的方法。在此，三种表面定殖模式 B. subtilis 用于检测群体分选现象的出现， 即 遗传上相同但荧光标记不同的菌株的分离。群集运动是一种依赖鞭毛的集体表面运动 B. subtilis，导致高度混合的群体。在这些成群的菌落中，绿色和红色荧光细菌的定植区域相互重叠（见 图 2A）。快速的表面定植过程可进行时间上的追踪（视频图1）。在群集运动过程中 B subtilis，数小时培养后，细胞从接种中心向外扩展形成一层薄层（参见 图2B).
<img alt="显示微生物培养物中GFP和RFP表达的荧光显微镜延时图像。" src="/files/ftp_upload/54752/54752fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：B. subtilis 的群集扩张。 群集菌落包含在接种前以1:1混合的绿色和红色荧光菌株。（A）15小时后，使用适当的荧光滤光片检测到绿色和红色荧光（分别为GFP和RFP）。（B）显示了从视频图1中提取的选定时间点的B. subtilis群集薄层图像。比例尺 = 5 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/54752fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
然而，当将缺乏功能性鞭毛但能够依靠产生的胞外多糖、疏水蛋白和表面活性素在半固体琼脂培养基上扩散的 B. subtilis 菌株点样于培养基上时，不同标记的菌株会分离成特定的、明确的区域（见图3A）。滑动菌落的发育过程可进行时间记录（见图3B 或视频图2）。
<img alt="荧光显微镜，GFP，RFP表达，明场，复合图像，延时分析。" src="/files/ftp_upload/54752/54752fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：B. subtilis 的滑动菌落。 菌落中含有绿色和红色荧光菌株，接种前以1:1比例混合。（A）24小时后，使用适当的荧光滤光片检测到绿色和红色荧光（分别为GFP和RFP）。（B）图中显示了从视频图2中提取的若干时间点的B. subtilis滑动菌落图像。比例尺 = 5 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/54752fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
尽管群集运动和滑动扩展菌落的分离程度无法被改变，但菌落生物膜中不同荧光标记菌株的空间分隔可受到起始细胞密度的影响。当以混合菌群的高细胞密度启动 B. subtilis 的菌落生物膜时，绿色和红色荧光菌株表现出轻微或无明显空间分离（见图4）。相反，当用于启动生物膜的细胞密度较低时，可通过荧光显微镜观察到清晰的绿色和红色荧光扇形区域。这种分离程度明显依赖于启动生物膜菌群的稀释程度。视频图3 和 4 展示了接种菌株在最低和最高稀释度下的菌落扩展过程。
<img alt="显微镜下的稀释系列：明场 vs. GFP、RFP 及荧光复合图像分析。" src="/files/ftp_upload/54752/54752fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：B. subtilis 群落生物膜在不同初始细胞密度下的分选水平。 接种不同初始细胞密度（从上至下分别为未稀释至稀释 105 倍的起始培养物）的绿色和红色荧光菌株群落生物膜在培养 2 天后的结果如图所示。比例尺 = 5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/54752fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
可使用 ImageJ 软件进一步量化绿色和红色荧光菌株的比例，从而对实验所用菌株的群体结构及竞争能力进行定量表征。
<img alt="细菌生长平板、荧光检测、培养皿实验、微生物学研究。" src="/files/ftp_upload/54752/54752video1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="视频图1"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/Video_Fig1.mov" target="_blank">视频图1：以绿色和红色荧光菌株1:1混合接种启动的 B. subtilis 群体运动的时间推移图像。（右键单击可下载。）</a> 该视频展示了为期10小时的时间序列。比例尺 = 7 mm。
<img alt="培养皿实验中的细菌生长模式；显示色素的径向扩散；微生物学。" src="/files/ftp_upload/54752/54752video2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="视频图2"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/Video_Fig2.mov" target="_blank">视频图2：由绿色和红色荧光菌株以1:1比例混合接种引发的B. subtilis滑动运动的时间推移图像。（右键单击可下载。）</a> 该视频展示了24小时的时间进程。比例尺 = 5 mm。
<img alt="培养皿琼脂平板上的细菌培养物，呈现具有颜色的放射状生长模式。" src="/files/ftp_upload/54752/54752video3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="视频 3"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/Video_Fig3.mov" target="_blank">视频图3：以高细胞密度接种的绿色和红色荧光菌株1:1混合物启动的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）菌落生物膜的时间推移图像。（右键单击可下载。）</a> 该视频展示了48小时的时间过程。比例尺 = 5 mm。
<img alt="细菌生长模式、荧光标记、培养皿、微生物实验、生物膜研究。" src="/files/ftp_upload/54752/54752video4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="视频 4"> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/Video_Fig4.mov" target="_blank">视频图 4：以绿色和红色荧光菌株按 1:1 混合并在低细胞密度下启动的 B. subtilis 菌落生物膜的时间推移图像。</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54752/Video_Fig4.mov" target="_blank">（右键单击可下载。）</a> 该视频展示了 48 小时的时间过程。比例尺 = 5 mm。

利用简单的微生物系统可以在实验室中研究分选（空间隔离）在进化情景中的作用，这类系统能够对空间分布进行可控调节。通过改变起始细胞密度，可使用荧光标记的细菌菌株在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的菌落生物膜中直观观察到不同程度的分选现象。

微生物为研究种群内个体间的社会相互作用提供了一个引人入胜的系统。其世代时间短且相对简单的……

本实验的总体目标是利用荧光显微镜观察微生物在群集运动、滑动或生物膜形成过程中的空间分布情况。该方法有助于回答社会微生物学领域中的关键科学问题，例如空间分离如何影响微生物间的相互作用。该技术的主要优势在于，可通过显微镜技术和亚区图像分析，便捷地评估微生物菌株的适应性及其空间分布特征。本实验操作将由我实验室的博士研究员 Theresa Holscher 演示。在实验前一天，向一支培养管中加入 3 毫升 LB 培养基，并从 B.subtilis 的冻存菌种中接种。对每种感兴趣的菌株，均需使用单独的培养管重复此接种步骤。将试管放入37摄氏度的水平摇床培养箱中过夜。为准备群集和滑动实验用平板，将20毫升预温的LB培养基倒入90毫米的聚苯乙烯培养皿中。立即盖上皿盖，并将其置于超净台一侧，静置冷却至少一小时。接下来，通过将25毫升的双倍SG琼脂培养基倒入90毫米的培养皿中，制备用于菌落生物膜实验的平板。立即盖上皿盖，并将平板以每叠不超过四个的方式堆放，静置冷却至少一小时。实验开始时，将LB琼脂群游和滑行平板放入超净工作台中，打开并移去皿盖。将平板静置干燥 20 分钟。本实验中平板的湿度至关重要。过多的水分会使细菌游动，而过度干燥则会抑制群集运动和滑行运动。类似地，菌落生物膜的结构取决于培养基的干燥程度。使用分光光度计，在600纳米处测定过夜种子培养物的光密度。在1.5毫升微量离心管中，将表达绿色和红色荧光蛋白的菌株按密度归一化的量混合，总体积为200微升。将试管涡旋振荡三秒钟。使用微量移液器，取两微升混合菌液，滴加到超净工作台内预先干燥的90毫米LB琼脂平板中心。将平板放置干燥10分钟。最后，将平板直立放置于37摄氏度培养箱中孵育，以防止冷凝水积聚在琼脂表面。首先，将两块SG琼脂平板置于超净工作台中静置15分钟，使其干燥。接着，分别取100微升表达绿色和红色荧光蛋白的生物膜菌株——枯草芽孢杆菌168（B.subtilis 168）的种子培养物，加入一个1.5毫升微量离心管中。将离心管涡旋振荡三秒钟。准备含有100 µL LB培养基的离心管，并使用混合菌液制备一系列10倍梯度稀释的接种液。使用微量移液器，取2 µL未稀释的混合菌液，点样于2倍SG琼脂平板上。依次对10¹、10²、10³和10⁴稀释度的菌液进行相同操作，将接种点均匀分布，使单个培养皿上可生长6至9个菌落。将平板直立置于30°C培养箱中培养1至3天。开始时，将平板放置在荧光检测显微镜的成像平台上。进行滑动和群集运动实验时，将接种原点（即培养皿中心）移至视野可见区域的角落，以便测量菌落的径向扩展。根据90毫米培养皿中可成像区域的最大范围，调整放大倍数至允许成像的最大分辨率。根据荧光信号的强度，适当调整曝光时间。进行生物膜分析时，将目标菌落置于视野中心。调整放大倍数，使其达到能够完整观察整个菌落的最高分辨率。此时菌落已准备好进行测量与分析。最后，按照文本方案中所述方法分析数据。该图显示了一个典型的双菌株共接种的枯草芽孢杆菌菌落的生长情况。成群运动是一种依赖鞭毛的集体表面运动，会导致菌群高度混合。在此延时视频中，初始接种物被放置在平板涂布的中心位置。可以清楚地观察到薄层群集运动现象，随着菌落的发育，红色和绿色荧光标记的菌株呈现出混合且重叠的分布。相反，滑行行为的图像则显示出清晰的生长扇区，分别对应于不同荧光标记的菌株。本视频展示了两种缺失功能性鞭毛的菌株共接种后形成的滑动菌落的生长过程。这些菌落仍能通过分泌胞外多糖、疏水蛋白和表面活性素的协同作用实现扩散。与具有群游能力的菌株相比，所形成的菌落表现出明显不同的空间生长分布模式。生物膜形成菌落的起始细胞密度显著影响最终菌落的空间分布模式。由高细胞密度混合种群起始的菌落，其空间分异较弱或几乎不存在；而起始细胞密度较低时，则可观察到清晰的绿色和红色荧光区域。观看本视频后，您应能够充分理解如何测定微生物菌落中荧光标记菌株的相对丰度、分析空间分离现象，以及研究奠基细胞密度对菌落形成的影响。

monitoring-spatial-segregation-surface-colonizing-microbial

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在表面定植微生物种群监测空间分异

来源：Guo, S., et al. 在诱导剂梯度平板上定量细菌表面群集运动能力。 J. Vis. Exp.

使用梯度抑制平板评估细菌群集运动

细菌会产生分泌性化合物，这些化合物可能影响其邻近微生物的生理活动。本文介绍了一种共培养筛选方法，通过在固体培养基上将土壤微生物与荧光转录报告菌株 Bacillus subtilis...

利用共培养检测化学介导的种间相互作用

细菌在其生命周期中可能积累有害或有益的突变。在细胞群体中，携带有益突变的个体可能迅速战胜其他个体。本文介绍一种简单的方法，通过使用荧光标记的个体，随时间推移可视化细菌群体内的种内竞争。...

通过共培养荧光标记菌株监测细菌种群内的种内竞争

生物膜与其周围环境之间存在复杂的相互作用。为了全面研究生物膜与环境之间的相互作用，本文介绍了一系列方法，用于构建有利于生物膜生长的异质化学环境，量化局部流速，以及分析生物膜菌落内部及周围的物质传输过程。...

生物膜与生境异质性协同发育的表征方法

微生物群落的发展依赖于多种因素的共同作用，包括环境结构、成员丰度、特性及其相互作用。本方案描述了一种合成的微加工环境，可用于同时追踪容纳在飞升级微孔中的数千个群落，其中生态位大小和空间限制等关键因素可被近似模拟。...

微孔阵列平台中微生物群落构建与追踪

流式细胞术分析已被证明在研究纯培养物和监测微生物群落动态方面具有重要价值。我们分别提供了从取样到数据分析的三个完整工作流程，适用于透明培养基中的纯培养物和复杂群落，以及具有挑战性的基质环境。...

表征微生物组动态——从纯培养到自然群落的基于流式细胞术的工作流程

本文介绍的方法结合微图形化技术与定量成像，以揭示哺乳动物细胞培养物中的空间组织结构。该技术易于在标准的细胞生物学实验室中建立，为体外研究模式形成提供了一个可操作的实验系统。...

利用微图形技术和定量成像技术绘制哺乳动物细胞的自组织空间结构

通过高通量延时成像技术，对固定化的酵母细胞在微菌落生长过程中的生长表型进行精确测量。同时，可监测其胁迫耐受性、蛋白质表达及蛋白质定位，从而生成整合型数据集，用于研究环境差异、遗传差异以及同基因型细胞间基因表达异质性如何调控细胞生长。...

高通量活体成像微菌落以测量生长与基因表达的异质性

本文介绍了利用诱导剂梯度平板评估细菌群集运动能力，同时获得多个浓度响应的方法。...

在诱导剂梯度平板上定量细菌表面群集运动能力

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis...

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。...

切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

学习利用荧光显微镜观察枯草芽孢杆菌在群体运动、滑动和生物膜形成过程中的空间分布。该方法通过调控初始细胞密度，帮助研究人员分析微生物菌株的空间分异及其相互作用机制。

监测表面定植微生物群体中的空间分离现象

探索更多视频