在表面定植微生物种群监测空间分异
October 29th, 2016
在进化的场景分类（空间隔离）的作用，可以在允许控制的空间分布调整实验室使用简单微生物系统进行检查。通过修改创始人细胞密度时，各品种水平可在枯草芽孢杆菌的菌落生物膜使用荧光标记的细菌菌株进行可视化。
该程序的总体目标是使用荧光显微镜观察微生物菌株在蜂群、滑动或生物膜形成过程中的空间分布。这种方法可以帮助回答社会微生物学领域的关键问题，例如空间分离如何影响微生物相互作用。该技术的主要优点是可以使用显微技术和子段图像分析轻松评估微生物菌株的适应性和空间分布。
演示该程序的是我实验室的博士研究员 Theresa Holscher。在实验前一天，将 3 毫升 LB 培养基加入培养管中，并从枯草芽孢杆菌的冷冻库存中接种。对每个感兴趣的菌株用单独的试管重复接种。
将试管放入 37 摄氏度的水平振荡培养箱中过夜。为了准备用于聚集和滑动实验的板，将 20 毫升回火的 LB 培养基倒入 90 毫米的聚苯乙烯培养皿中。立即关闭培养皿，将其放在无菌罩的一侧冷却至少一小时。
接下来，通过将 25 毫升琼脂倒入 90 毫米培养皿中，将 2 倍 SG 培养基倒入菌落生物膜实验板中。立即关闭板子，将它们设置为以 4 个或更少的一组形式冷却至少 1 小时。首先，将 LB 琼脂群和滑板放入层流罩中，然后取下盖子。
让板子干燥 20 分钟。在这些实验中，板的湿度至关重要。虽然过多的水分会让细菌游动，但长时间的干燥可以防止蜂群和滑动。
同样，菌落生物膜结构取决于培养基的干燥度。使用分光光度计，确定 600 纳米过夜发酵剂培养物的光密度。在 1.5 mL 微量离心管中，混合密度归一化量的绿色和红色荧光蛋白产生菌株，总共 200 μL。
涡旋试管 3 秒钟。使用微量移液器，将两微升混合培养物点到层流罩中预干燥的 90 毫米 LB 琼脂板的中心。将板子晾干 10 分钟。
最后，将板在 37 摄氏度下直立孵育，以防止冷凝水聚集在琼脂表面。首先，将两次 SG 琼脂平板置于层流罩中 15 分钟干燥。接下来，将产生绿色和红色荧光蛋白的生物膜菌株、枯草芽孢杆菌 168 起始培养物各 100 微升添加到 1.5 毫升微量离心管中。
涡旋试管 3 秒钟。用 100 微升 LB 培养基制备试管，并使用混合培养物，制备 10 倍稀释的接种物系列。使用微量移液器，将两微升未稀释的混合培养物点到两次 SG 琼脂平板上。
重复此作，接种 10 到 1、10 到 2、10 到 3 和 10 到 4 个稀释液，以相等的距离间隔点，以允许 6 到 9 个菌落在一个培养皿上生长。将板在 30 摄氏度下直立孵育 1 到 3 天。首先，将板放在荧光检测显微镜的成像平台上。
对于滑动和蜂群实验，将接种起点（培养皿的中间）设置为可见视野的一角，以便测量放射状集落扩增。将放大倍率调整到最高分辨率，以便对 90 毫米板的最大可能区域进行成像。根据荧光信号的强度适当调整曝光时间。
对于生物膜分析，将感兴趣的菌落放置在视野的中心。将放大倍数设置为允许查看整个菌落的最高分辨率。菌落现在已准备好进行测量和分析。
最后，按照文本协议中的说明分析数据。该图显示了典型的双菌株共接种的枯草芽孢杆菌菌落的生长。蜂群是一种依赖于鞭毛的集体表面运动，导致种群高度混合。
在这个延时视频中，初始孕育剂被放置在板铺展的中心。可以清楚地观察到薄层蜂群，随着菌落的发育，两种红色和绿色荧光菌株出现混合和重叠。相反，滑动行为的图像显示了与不同标记的荧光菌株相对应的确定的生长区域。
该视频显示了滑动共接种菌落的生长，其中菌株缺乏功能性鞭毛。这些菌落仍然能够使用分泌的外多糖、疏水素和表面活性素的组合进行传播。与蜂群菌株相比，所得菌落显示出不同的空间生长分类。
生物膜产生菌落的起始细胞密度严重影响了所得菌落的空间分类。以混合群体的高细胞密度开始的菌落显示出少量或没有空间分类。相比之下，当开始时的细胞密度较低时，可以检测到清晰的绿色和红色荧光扇区。
观看此视频后，您应该对如何确定微生物菌落中荧光标记菌株的相对丰度、检查空间分离以及研究创始细胞密度的影响有一个很好的了解。
概述
本研究利用荧光显微镜调查了在成群、滑动和生物膜形成过程中微生物菌株的空间分布。通过操控始祖细胞密度，可以观察空间隔离对微生物相互作用的影响，以观察枯草芽孢杆菌菌落中的现象。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物生态学
- 社会微生物学
- 荧光显微镜
背景
- 空间隔离在微生物相互作用中起着关键作用。
- 荧光标记的菌株允许可视化不同种群。
- 了解这些动态可以为进化场景提供信息。
- 评估微生物适应性和分布的技术是必不可少的。
研究目的
- 观察空间隔离如何影响微生物相互作用。
- 评估始祖细胞密度对菌落结构的影响。
- 利用荧光显微镜对微生物行为进行详细分析。
所用方法
- 准备LB和SG琼脂板用于实验。
- 接种细菌菌株并评估光密度。
- 使用荧光显微镜可视化菌落生长和行为。
- 分析菌株之间的空间分布和相互作用模式。
主要结果
- 成群行为导致了菌株的混合种群。
- 滑动行为展现了不同的生长区域。
- 高初始细胞密度导致空间分布减少。
- 低初始细胞密度允许菌株的清晰隔离。
结论
- 空间隔离显著影响微生物相互作用。
- 始祖细胞密度是菌落结构的关键因素。
- 荧光显微镜有效用于研究微生物动态。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative monitoring of spatial segregation in surface-colonizing microbial populations enables precise interrogation of microbial social interactions and fitness dynamics. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses and optimizing model system selection in anti-infective and microbiome-targeted R&D. The approach supports predictive confidence in phenotypic screening and informs translational continuity from discovery through preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microbial population dynamics and spatial assortment during surface colonization.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing between swarming, sliding, and biofilm phenotypes.
- Facilitates functional validation of genetic modifications and their impact on microbial fitness.
- Provides quantitative outputs for hypothesis-driven target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, fluorescence-based assays for tracking strain-specific behaviors in mixed populations.
- Delivers standardized, quantitative readouts for spatial distribution and relative abundance of labeled strains.
- Enables scalable preparation of validated microbial systems for downstream screening workflows.
- Supports robust assay development for compound evaluation targeting microbial community interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns model system outputs with disease-relevant microbial behaviors such as biofilm formation and spatial segregation.
- Ensures continuity of mechanistic insights from discovery through preclinical model validation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying founder cell density effects on population structure.
- Provides predictive value for translational biomarker development in microbiome and anti-infective programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative, fluorescence-based monitoring of microbial population dynamics and spatial segregation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microbial social interaction and spatial assortment mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Delivers image-based measurements of strain abundance and spatial distribution for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro microbial behaviors to preclinical model outcomes relevant to infection and microbiome modulation.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse microbial systems and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial model systems.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of microbial targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective and microbiome-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial genetics, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to fluorescence-capable microscopy platforms and image processing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of strain labeling, inoculation density, and imaging protocols.
- Adaptable to various microbial species and genetic constructs with appropriate validation.
- Dependent on precise control of experimental variables such as founder cell density and agar medium conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Preparation of Media and Starter Cultures
1:54
Co-inoculation of Fluorescently Labeled Strains for Surface Spreading
3:16
Co-inoculation of Fluorescently Labeled Strains for Biofilm Growth
4:32
Colony Imaging Using Fluorescent Microscopy
5:36
Results: Swarming, Sliding, and Biofilm Producing Colonies Display Different Patternsof Spatial Growth
7:12
Conclusion
