微生物动力学的特征-基于流式细胞仪的工作流从纯文化到自然群落
July 12th, 2018
流细胞分析已证明对研究纯文化和监测微生物群落动力学有价值。我们提供了三个全面的工作流程, 从抽样到数据分析, 到纯文化和复杂社区, 在清晰的介质中, 以及在挑战性的矩阵, 分别。
这种方法可以帮助回答微生物生态学和生物技术中的关键问题，例如，哪些生态概念驱动着任何给定的生态系统。该技术的主要优点是，它可用于通过短间隔采样机制关闭后续的快速微生物组动力学，同时保持高成本效益。该方法可用于获取有关生物技术和天然微生物群落的信息，也可用于获取有关动物和人类微生物组的营养和健康状况的信息。
演示该程序的是我们实验室的技术员兼 SediMeter作员 Florian Schattenberg。要干燥沼气群落样品，请使用改良的 1 毫升移液器吸头将 200 微升粘性沼渣转移到含有 1.7 毫升 PBS 的 2 毫升试管中。充分混合后，将试管置于超声波浴中 1 分钟，以去除任何大的细胞聚集体并将细胞粘附在植物细胞残留物上。
超声处理后，充分混合样品，并通过 50 微米的孔网过滤器将细胞过滤到 2 毫升塑料管中。将滤液分成四个 400 微升等分试样，将等分试样离心两次，两次完全弃去上清液，以尽可能彻底地机械脱水微生物样品。然后在加热的真空离心机中干燥样品，以产生稳定的沉淀，并将沉淀避光储存在 4 摄氏度下。
为了稳定和固定活性污泥样品，离心 4 毫升细胞，并将沉淀重悬于 4 毫升 2% 甲醛的 PBS 溶液中。在室温下放置 30 分钟后，离心稳定的细胞样品，并将沉淀物固定在 4 毫升 70% 乙醇中，在零下 20 摄氏度下储存。将 0.6 mL 固定细胞悬液混合并转移到含有 1.4 mL PBS 的玻璃管中，充分混合后，如图所示超声处理 10 分钟。
超声处理结束时，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 mL 新鲜 PBS 中。充分混合后，如刚才所示对细胞进行超声处理 5 分钟，然后用新鲜 PBS 将 OD 700 纳米调节至 035。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于含有 0.11 摩尔柠檬酸和 4.1 微米吐温 20 的一毫升渗透性缓冲液中，充分混合，在室温下孵育 20 分钟。
然后通过离心收集细胞，并将沉淀彻底重悬于含有 0.68 微摩尔 DAPI 的两毫升染色溶液中，在室温下避光孵育至少 60 分钟。对于微珠校准，将用于线性校准的微珠混合物加载到流式细胞仪中，并在纵喷嘴和激光光学元件位置的同时连续测量微珠，以在线性范围内预校准仪器。当微珠峰可以放入预设校准模板中时，切换到对数模式，并加载对数校准微珠样品。
将对数微珠峰拟合到其预设的校准模板中，以微调仪器的硬件，并使用光电倍增管增益设置对微珠位置进行任何必要的最终调整该程序最关键的方面是保持一致的测量结果，以实现实验之间的可比性。因此，每日细胞仪校准以及在生物柱盖中使用微珠对于缓慢细胞微生物组透析的成功至关重要。当细胞准备好后，混合并过滤样品，并将对数珠混合物添加到细胞中。
现在混合并将样品加载到细胞仪上，并创建一个门以包括染色的细胞并排除噪音和珠子。然后以每秒 3， 000 个事件的最大速度连续分析样品组，直到在细胞门内检测到 250， 000 个细胞。要分析流式细胞术数据，请开发一个用于所有样品的主门模板。
首先将流式细胞术标准文件加载到适当的流式细胞术分析程序中，然后依次处理样品。加载样品，双击测量值，然后从各自的下拉菜单中选择 X 轴和 Y 轴参数，以打开前向散射与 DAPI 荧光图。使用多边形绘制工具重现先前生成的测量单元门，以排除磁珠和噪声，并相应地命名门。
将细胞门条目拖动到 all samples 组列表中，然后双击细胞门以选择性地仅显示细胞事件。使用椭圆门工具定义样本中普遍存在的子群落，并将它们汇集在一起。然后添加其他子社区分配和后续样本，直到主门模板适合所有样本。
使用侧向散射扫描方法控制主门的模板，以解决彼此靠近的子社区聚类问题。然后，将所有子社区添加到表编辑器，并将输出统计信息设置为 frequency of parent.使用表格编辑器将相对子社区丰度导出到适当的电子表格软件中，并根据侧边栏手册中的准则调整数据格式。
然后，要可视化子社区动态和相关性，请安装并加载 R 包，并加载和规范化 txt 文件。前向散射与 DAPI 荧光图揭示了纯菌株培养物在分批培养中不同点的细胞周期状态。然后，使用主门模板可以量化具有一条、两条或多条染色体的细胞比例，例如，揭示这种代表性微生物复制其染色体的速度比其生成时间快的能力。
在研究随时间变化的复杂微生物群落时，可以通过点图序列轻松可视化群落变化的速度和重要性。使用细胞计数条形码工具可以清楚地识别实验不同阶段的主要亚群落。将这些数据与相对子群落丰度的频率分布相结合，可以选择在关键时间点显示显著丰度变化的门。
在非度量多维缩放图中可视化这些数据有助于更深入地了解社区动态。由于搅拌限制，沼气群落可能面临空间异质性。典型的沼气群落采样点表现出很少的空间异质性，但表现出明显的时间异质性。
与非生物参数（如产品紧固剂）的强正或负相关有助于理解和优化生态系统和生物技术过程。此外，它们还有助于识别特别感兴趣的门，以便进行后续的排序和分析。在建立此程序时，建议评估不同的固定和染色程序，以评估它们对每个新样品组的性能和稳定性。
排序后，可以应用进一步的方法，如扩增子围栏、宏基因组学和蛋白质组学来选择顶级群落，这些群落提供有关代谢途径活动状态的原始遗传隶属关系的信息。这种方法为微生物生态学家和生物过程工程师铺平了道路，他们可以通过合理的资源投资来跟踪微生物组动态、自然和受控的生态系统。
概述
本文介绍了一种流式细胞术分析方法，用于研究微生物群落动态和纯培养。它概述了简单和复杂微生物群落的采样、处理和数据分析工作流程。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物生态学
- 生物技术
- 流式细胞术
背景
- 流式细胞术是分析微生物群落的强大工具。
- 该方法允许快速监测微生物群落动态。
- 它可应用于各种生态系统，包括人类和动物微生物群。
- 理解微生物动态对生态学和健康相关研究至关重要。
研究目的
- 提供分析微生物群落的全面工作流程。
- 展示流式细胞术在研究微生物群落动态中的有效性。
- 促进微生物生态学和生物技术研究。
使用的方法
- 使用移液和离心技术进行样品制备。
- 超声波分散细胞聚集体。
- 流式细胞术分析染色细胞。
- 使用流式细胞术软件和R包进行数据分析。
主要结果
- 成功分离和分析复杂样品中的微生物细胞。
- 随时间推移观察微生物群落动态。
- 量化细胞周期状态和染色体复制速率。
- 开发用于一致数据分析的主门模板。
结论
- 流式细胞术是研究微生物群落的有效方法。
- 它允许快速且经济高效的微生物群落动态监测。
- 提供的工作流程可以增强微生物生态学和生物技术研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Flow cytometry enables rapid, cost-effective monitoring of microbiome dynamics, supporting hypothesis testing in microbial ecology and biotechnology. It provides quantitative subcommunity abundances and absolute cell numbers, enhancing predictive confidence in target validation and translational biomarker discovery. The method bridges discovery and preclinical workflows by delivering reproducible, scalable data for risk-adjusted decision-making in microbiome-targeted interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying microbial subcommunity shifts in response to environmental or compound perturbations.
- Operational Value: Enables functional target validation through reproducible staining and gating protocols across pure cultures and complex communities.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying mechanistically relevant microbial shifts linked to host health or bioprocess outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by delivering standardized, bead-calibrated flow cytometry outputs.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via daily cytometer calibration and master gate template application.
- Scalability: Facilitates high-throughput screening readiness with capacity to process 250,000 events per sample at 3,000 events/second.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase microbiome dynamics to preclinical validation through longitudinal tracking of subcommunity abundance shifts.
- Biomarker Alignment: Enables identification of gates of special interest for subsequent sorting and multi-omics integration (amplicon sequencing, metagenomics, proteomics).
- Mechanistic De-risking: Quantifies cell cycle states and chromosome replication rates to assess microbial fitness and metabolic activity under test conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling continuous microbiome monitoring across workflow stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by resolving microbial community dynamics and identifying drivers of ecosystem shifts.
- Screening: Delivers assay readiness through optimized fixation, permeabilization, and staining protocols for diverse sample matrices.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (relative subcommunity frequencies, absolute cell counts) enabling cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via correlation of microbial shifts with abiotic parameters and health/nutrition outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability through master gate templates and bead-based calibration ensuring cross-experiment comparability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial community responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability enabled by bead calibration and master gate templates.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in microbiome-targeted programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable microbiome dynamics and correlation with process or health outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation, staining optimization, and multivariate data analysis.
- Dependent on instrumentation capable of fluorescence detection (DAPI) and bead-based linear/logarithmic calibration.
- Necessitates cross-team standardization of sampling, fixation, and gating protocols for reproducible results.
- Requires adaptation of permeabilization and staining buffers across model systems (pure cultures, sludge, digestate).
- Limited by inability to deliver direct phylogenetic information, necessitating complementary sequencing for taxonomic resolution.
