Name: 微生物动力学的特征-基于流式细胞仪的工作流从纯文化到自然群落 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 了解基于流式细胞仪的微生物动力学分析方法，用于研究纯培养物和自然群落的微生物组动态。该技术可快速监测微生物生态学中的群落变化，为生态学和生物技术研究提供经济高效的解决方案。

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我们衷心感谢 Michael Jahn 和 Yuting Guo 分别提供了纯培养和活性污泥群落的研究方法与数据集。我们进一步感谢 Katrin Mörters 对沼气群落样品的分析工作。本研究由德国联邦食品和农业部（BMEL）委托的可再生原料代理机构（FNR，项目 Biogas-Fingerprint 编号 22008313）、德国联邦经济和能源部（BMWi）的中小企业中央创新计划（ZIM）（INAR-ABOS，编号 16KN043222）、德国联邦环境基金会（DBU，项目“按需从啤酒厂和污水处理厂残余物中生产磷酸盐肥料”编号 33960/01-32）、德国联邦教育与研究部（BMBF）（资助编号 FZK 03XP0041G）以及亥姆霍兹协会项目导向资助（POF III R31 主题 3 生物能源）提供资金支持。

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<li>Koch, C., Müller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+microbiome+dynamics+-+Cytometric+fingerprints+for+routine+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。 
&#160;

对微生物种群和群落的成功分析需要精确调校的流式细胞仪、合适的细胞参数选择，以及从采样、固定到测量和数据分析的可靠工作流程。所选的细胞参数必须与可用的激发波长相匹配。我们使用并推荐DAPI，它在低浓度下非常敏感，但需要紫外激光激发，而标准流式细胞仪配置通常不包含紫外激光器。其他染料（如SYBR Green I）也可对整个种群或群落进行染色，但通常分辨率较差。我们不建议在微生物群落分析中使用FISH（荧光原位杂交）程序或活性检测方法。这些方法难以量化、验证和控制，因为它们对群落中各个物种的作用尚不明确。只要典型的微生物群落中仍有相当一部分无法获得纯培养，这些方法就无法得到可靠验证。
实验方案中的关键步骤包括取样、固定以及细胞分选。由于某些纯培养物和微生物群落容易聚集成絮状物或附着在样品基质颗粒上，取样过程可能变得复杂。在将样品用于流式细胞分析之前，必须充分分散这些聚集体并分离样品中的细胞，以确保结果的可靠性。本文所展示的样品制备方案经过优化，可实现单细胞分析。在上机检测前需进行最终的50 µm过滤，以去除任何残留的聚集体，防止细胞分选仪的70 µm喷嘴和分析仪的流动池发生堵塞。来自污水处理厂的细胞絮状物尤其丰富、坚固，并对系统功能至关重要。我们研究了一座全规模污水处理厂不同反应池中的浮游态和污泥相关的微生物群落，以验证所建立的实验方案。结果表明，形成污泥的细胞聚集体被明显分散，且群落组成保持稳定。此外，在所采集的三个反应池中，浮游态与污泥相关的微生物群落均表现出显著的相似性（图8，补充文件1-S10）。这些结果通过对比新鲜样品、甲醛处理样品、甲醛与乙醇固定样品以及分选后样品的16S rDNA扩增子测序得到了验证10。然而，某些极端复杂的环境样品，例如致密的生物膜或以紧密链状生长的细菌，可能无法有效分散。土壤样品尤其具有挑战性，因为其中普遍存在的颗粒会在直方图中出现，并因其数量庞大而掩盖目标细胞信号。在此类情况下，需采用传统的测序方法进行分析。
在设计实验之前，应测试每组新样品的固定稳定性，以确保结果的有效性。良好的固定稳定性还允许在同一天对多个时间点的样品进行混合染色和检测。此外，在实验结束并完成最终评估后，仍可对关键时间点进行重复测量和回溯性细胞分选。纯培养物的固定稳定性已验证可持续28天（图9）。对于涉及样品运输的现场实验，应测试更长时间的固定稳定性（本研究中，活性污泥群落为60天，沼气群落为195天，见补充文件1-S9）。
染色通常不会出现问题，但需要使用生物学标准品进行对照，以便应用生物信息学分析工具。我们使用了模拟菌株E. coli BL21 (DE3)，该菌株按照ASC方案固定，并作为每批染色实验的储备标准品。
除了 DAPI 之外，SYBR Green I 近年来已成功应用于解析微生物群落长达数年14,23,24,25,26。SYBR Green I 可在在线模式下利用活细胞将群落划分为高核酸和低核酸亚群（HNA 和 LNA）。然而，DAPI 对 DNA 的结合更具特异性，能够在一份样本中区分出超过 50 个亚群，但染色前需要进行固定步骤。
细胞分选是该方法的一个显著优势，如果某些亚群具有进一步研究价值，可应用此技术。需要强调的是，戊二醛（仅处理30分钟）、乙醇处理或DAPI染色10均未对后续的16S扩增子测序产生负面影响。固定和染色步骤对亚群宏基因组分析可能产生的影响仍有待验证。
当使用能够以虚拟的单细胞水平解析群落特征，并将这些特征与非生物参数关联起来的生物信息学工具时，可以独立于分选方法获得大量关于群落功能和趋势动态的信息。
最近，已开发出多种新的生物信息学评估工具，这些工具对于 SYBR Green I 和 DAPI 方法均具有实用价值，可用于解析流式细胞术群落图谱。其中包括 FlowFP27、本研究所采用的软件包（flowCHIC20、flowCyBar28）、基于淡水群落建立的去卷积模型29，以及一种可根据生理特征区分菌株的工具30。此外，细胞计量法可测定群落多样性25，甚至可通过在线工具追踪微生物群落的稳定性特征10。
因此，在快速评估微生物群落及可能的非生物参数相关性方面，流式细胞术分析具有显著优势。然而，该方法仍存在局限性。由于依赖经验进行设门操作，流式细胞分析无法真正通过flowCyBar工具实现在线应用。此外，开发定制化且易于使用的流式细胞仪将极大推动流式细胞术在微生物组分析中的广泛应用。目前已有研究迈出了朝向这一方向的初步步伐28。
可以预见，微生物流式细胞术在微生物生态学中的未来应用前景广阔，因为它能够在细菌世代时间范围内实现高频监测，并且已有研究表明，生态学范式适用于流式细胞术数据5,10。该方法在自然环境的常规筛查中非常有用，例如瑞士强制性的饮用水检测31。它也可作为医学应用中的有力工具，用于人类15或动物32微生物组筛查。此外，生物信息学的最新进展可能使微生物流式细胞术成为受控微生物系统过程控制中的集成传感器。微生物群落流式细胞术还为细胞分选提供了筛选工具，从而能够对特定群落子集进行更高分辨率的基因组研究。

微生物在人类生活的许多方面发挥着至关重要的作用。它们是地球碳、氮、磷和硫循环的主要生物驱动因素1，并在各种工业中充当降解2，3和合成4的生物催化剂，例如在废水处理5或生物技术6领域。它们甚至构成了人类微生物组，直接影响人类健康与代谢7，8。因此，若要全面理解并调控这些系统，就必须获取微生物在响应其局部环境时的结构、功能及动态行为信息。新一代测序（NGS）是解析微生物组结构与功能的成熟技术9。然而，NGS数据的分析与评估无法提供定量信息，且仍然成本高昂、耗时较长，远未达到在性能限制范围内实现现场检测的水平。某些细菌的世代时间短于1小时，导致特定环境中的群落结构持续变化10。若采用测序方法追踪此类动态变化，将超出大多数科研实验室的财力与人力承受能力。
相比之下，流式细胞术能够提供类似于高通量测序（NGS）数据的群落指纹图谱，同时具有更高的时间、人力和成本效率。本文介绍了可在单细胞水平上在线追踪微生物群落动态变化的流式细胞术技术。与高通量测序不同，流式细胞术无法提供系统发育归属或功能基因信息，但可提供定量的细胞数量。利用流式细胞术，可将微生物群落分解为具有不同光散射和荧光特性的亚群落（前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）分别反映细胞大小和颗粒度）。本方法主要利用与特定细胞类型及生理（生长）状态相关的细胞大小和DNA含量信息。DNA含量通过可被紫外光激发的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料进行定量，该染料结合DNA中富含A-T的区域，甚至可分辨不同的染色体水平。结合DAPI荧光信号与FSC参数，可区分并监测50多个亚群落随时间变化的丰度11。亚群落丰度的变化可与微环境因素（如pH值和产物滴度）12、宏观参数（如天气）13,14，或在肠道及唾液微生物组中与特定医学治疗方案相关联15。这些相关性分析可揭示在整个群落代谢网络中承担特定功能的关键亚群落。随后可通过调控周围微环境来特异性促进或抑制这些关键亚群落，或对其进行分选以用于后续测序15或蛋白质组学研究16。
然而，由于能够有效分辨微生物种群或群落的流式细胞仪设备数量相对较少，微生物群落流式细胞术尚未得到广泛应用。此外，研究人员在面对微生物组分析挑战时，可能缺乏相关经验、群落分析流程以及有效的数据评估方法，这些都构成了技术入门的障碍。我们已建立了一套全面的工作流程以解决这些问题。为说明其普遍适用性，我们将通过三个典型样本集（补充文件1-S1）进行展示：i）用于生物技术应用的纯培养物（在明确成分的透明培养基中培养的葡萄糖上的恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida KT 2440）；ii）在透明培养基中的复杂实验室群落（合成废水中活性污泥群落（ASC））；以及 iii）存在于致密基质中的自然环境复杂群落（玉米青贮料中的沼气群落（BC））。
影响每种样本集方案选择的因素有多种。深度冷冻避免了有毒化学物质的使用，但由于需要液氮进行速冻，主要局限于实验室环境。甲醛稳定化及随后的乙醇固定可实现大量样本的采集，无需分装制备，且已被证明在长期储存中具有良好的稳定性。然而，富含蛋白质的样本（如人唾液15）可能存在困难，因为甲醛导致蛋白质变性形成絮状沉淀，可能引起不利的信噪比。在本比较的各方法中，样本干燥所需时间最长（总计约1小时），但可在现场操作，无需使用有毒化学物质。该方法可在离心管中形成稳定的沉淀物，便于运输，无需冷藏或额外的危险品防护措施。此外，已有大量替代性固定方法被提出11。在引入新的样本集时，我们强烈建议对不同方案的分辨率和固定稳定性进行测试。
我们使用了两种不同的流式细胞仪来分析这些样本：i）一种高度复杂且昂贵的、以研究为中心的细胞分选仪；ii）一种以应用为导向的台式分析仪，更适合现场应用5。使用台式分析仪测量了BC，而PC和ASC则使用细胞分选仪进行测量。对这三个典型样本集的分析需要采用不同的操作流程，以实现最佳的可重复性、样本稳定性和操作流程的便利性。以下方案将分别针对这三种不同系统进行具体说明。

<table><tbody><tr><td>Milli-Q系统Synthesis A10</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPak超滤柱</td><td>Merck, Darmstadt, (GER)</td><td>CDUF BI0 01</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Legacy细胞分选仪</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 90C</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>334 nm - 364 nm, 100 mW</td></tr><tr><td>Innova 70C&amp;nbsp;</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Genesis MX488-500 STM OPS</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>488 nm, 400 mW</td></tr><tr><td>Xcyte CY-355-150</td><td>Lumentum, Milpitas, California, USA</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>光电倍增管R928和R3896</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Summit 4.3软件</td><td>Beckman-Coulter, Brea, California (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;m&amp;nbsp; FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F8815</td><td>350/440 蓝色荧光</td></tr><tr><td>2 &amp;mu;m YG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-8827</td><td>505/515 黄绿色荧光微球&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.5 &amp;mu;m Fluoresbrite BB 羧基微球</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>18339</td><td>360/407</td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m Fluoresbrite BB 羧基微球</td><td>PolyScience, Niles, Illinois (USA)</td><td>17458</td><td>360/407 蓝色荧光</td></tr><tr><td>1 &amp;micro;mYG FluoSpheres</td><td>Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)</td><td>F-13081</td><td>505/515 黄绿色荧光微球&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Cyflow Space&amp;nbsp;</td><td>Sysmex Corporation, Kobe (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV激光器Genesis CX</td><td>Coherent, Inc , Santa Clara (USA)</td><td></td><td>355 nm, 150 mW</td></tr><tr><td>H6779-32系列光电倍增管</td><td>Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FloMax软件</td><td>Sysmex Partec GmbH, G&amp;ouml;rlitz, (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>所有光学滤光片</td><td>Carl Zeiss, Jena (GER)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)</td><td>CAS no. 7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.0.8r1</td><td>FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)</td><td></td><td>构建编号：42398</td></tr><tr><td>R软件v.3.4.3</td><td>R Core Team</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCHIC</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flowCyBar</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html">http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

表征微生物组动态——从纯培养到自然群落的基于流式细胞术的工作流程

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

研究纯培养物并监测微生物群落动态对于理解和控制由微生物驱动的自然生态系统及技术应用至关重要。新一代测序方法被广泛用于解析微生物组，但通常耗时耗力，且主要提供定性信息。流式细胞术微生物组分析则无上述缺点，可在线获取亚群落的相对丰度及细胞的绝对数量。尽管该方法不能直接提供系统发育信息，但可增强测序方法的分析深度与分辨率。与医学领域在科研和常规应用中广泛使用流式细胞术形成鲜明对比的是，该技术在微生物组分析中仍未得到普遍应用。样本制备和数据分析流程相关信息的缺乏，可能为面临微生物组分析挑战的研究人员设置了入门障碍，而这些挑战往往正是流式细胞术的经典应用场景。本文中，我们分别提供了三种全面的工作流程，适用于纯培养物、透明培养基中的复杂群落以及复杂基质中的复杂群落。我们描述了针对不同样本类型的采样与固定方法，以及优化的染色方案；详细阐述了使用复杂科研型和应用导向型台式仪器进行的流式分析，介绍了细胞分选流程，并推荐了数据分析软件包。此外，我们提出了关键的实验对照措施，并将所展示的工作流程应用于相应的样本类型。

以下代表性结果强调了设置重复的必要性，并展示了针对三组样本中每一组所适用的不同数据可视化与分析技术。这些结果展示了可用于回答各组样本相关标准科研问题的数据评估流程。然而，所呈现的技术并不仅限于与其一同展示的样本组。流式细胞术原始数据已通过 FlowRepository 编号 FR-FCM-ZY46 公开提供。此前上传的 ASC 数据可在编号 FR-FCM-ZYD7 下获取。
根据已发表的方案采集、制备并分析生物学重复和技术重复样本11。PC 和 ASC 的生物学重复样本取自三个平行的培养瓶。BC 的生物学重复样本是在中试规模装置的同一位置进行三次连续采样获得。每个样本取三个等分试样进行固定、染色和分析，以确保技术上的可重复性。方法的可重复性评估依据先前发表的流程进行11。使用针对同一样本组所有样本的门控模板（补充文件 1-S6）计算每个门控的标准偏差（%）。
对于PC，相对丰度的最大标准偏差为3.44%，平均标准偏差为2.13%（图1）。对于ASC和BC，相对丰度的最大标准偏差分别为1.27%和0.88%，标准偏差的平均值分别为2.13%和0.21%（补充文件1-S8）。
在研究纯菌株培养物时，一个标准操作是绘制生长曲线，以分析在特定条件下菌体的延滞期、世代时间及细胞密度。我们将该操作与流式细胞术分析流程相结合，以更深入地理解该系统（图2）。FSC 与 DAPI 荧光图谱揭示了分批培养过程中不同时间点菌群的细胞周期状态。我们建立了一个主门控模板（补充文件1-S6），用于量化含有一条（c1n）、两条（c2n）或多条染色体（cXn，图2B）的细胞比例。接种时绝大多数细胞仅含一条染色体（0小时时占93.7%）。在指数生长期，这一比例发生显著变化：几乎所有细胞均含有超过一条染色体（4小时时占99.6%），且超过半数细胞群体（53.1%）甚至含有超过两条染色体。这表明P. putida能够以快于其世代时间的速度复制其染色体。
流式细胞术分析已被证明在监测微生物群落演变方面非常有用，其对群落动态的追踪能力远超资源消耗更大的分子方法5,10。我们通过一段视频直观展示了这些动态，并获得了随时间变化的活性污泥群落演替概览。每一秒的帧显示了一个样本点的前向散射光（FSC）与DAPI荧光图（补充文件2）。从第0天到第4天出现了非常显著的群落变化，随后在第7天之后形成了一个核心群落。到第21天时，又出现了额外的亚群落。我们建立了一个主门控模板（补充文件1-S6），实现了在亚群落水平上对微生物动态的评估。利用CyBar工具可清晰识别实验不同阶段中的优势亚群落（图3）。结合相对亚群落丰度的频率分布，有助于筛选出具有研究意义（在关键时间点触发丰度显著变化）且可行（相对丰度超过5%）的门控区域，用于分选及后续分析22。
工业规模生物反应器的应用可能因搅拌受限而面临潜在的空间异质性问题，同时还经常受到操作参数变化的影响，例如非合成底物质量的波动。该生物膜群落（BC）代表了此类系统，并从动态驱动的推流式反应器中不同位置进行了取样。代表性取样点的FSC与DAPI荧光图谱（图4）显示，空间异质性较小，但时间异质性显著。进一步采用快速自动化的CHIC方法以及基于主门控模板的深度分析方法CyBar对BC进行了研究。
其自动化、快速且无偏倚的特性，使得CHIC在工业环境中对生物工艺的现场控制尤为适用。它可比较所有可用样本的原始.fcs数据。其中两项比较显示在 图5. 结果所得的相异性值证实了先前关于空间和时间异质性的观察结果。由 CHIC 工具生成的相异性矩阵所绘制的 NMDS 图图6进一步证实了这一结果，并对此进行了相应的可视化。
此外，我们使用主门控模板（补充文件1-S6）计算了BC中23个子群落的相对丰度。对为期一年的48个样本进行了相关性分析，以了解微生物群落中的功能关系，这有助于确定值得进一步研究的关注门控（4 细胞分选）。与产物滴度等非生物参数之间的强正相关或负相关性，有助于理解并优化生态系统和生物技术过程。相关性分析中还包括了有机负荷率图7）是此类非生物参数的一个例证。G5、G4 和 G10 表现出强烈的正相关性，可能含有发酵型物种，而 G8 中的负相关性可能提示存在产甲烷古菌。
<img alt="DAPI 荧光、生物重复与技术重复的 FSC 图、数据分析结果的流式细胞术图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：纯培养物流式细胞分析的可重复性。 FSC 与 DAPI 荧光散点图（含对照微球）（A, B），以及三个亚群相对丰度 [%] 的柱状图，误差线表示 ± 一个标准差（C, D）。相对丰度通过补充文件 1-S6 所示的设门模板确定。在生长曲线 4 h 时间点采集了三个生物重复 A、B 和 C；从样本 A 制备了三个技术重复 P1、P2、P3，并分别测量三次：M1、M2、M3，各数据均附其对应的标准差。细胞门内共记录 50,000 个事件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="流式细胞术细胞周期分析示意图与生长曲线图，展示DNA含量与OD600。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：在12小时生长曲线实验过程中采集的纯培养物的细胞周期分析。（A） 每两小时取样的前向散射光（FSC）与DAPI荧光散点图，显示在对数生长期DNA含量发生偏移。该测量系列未包含微球（参见补充文件1-S3）。（B） 基于光密度的生长曲线，误差线表示±一个标准差，以及随时间变化的亚群相对丰度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有树状图、颜色图例和PCA图的数据分析相对丰度热图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：活性污泥群落结构在24天内的演变。（A）flowCyBar图，其中叠加了箱形图显示各个门控的频率分布，门控按趋势相似性排列；相应的颜色图例（B）；以及NMDS图中的相似性分析，R &lt;0.001（C）。基础图表见补充文件2中的视频序列。相对丰度是使用补充文件1-S6中的门控模板确定的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="空间和时间异质性流式细胞术图；DAPI荧光 vs. FSC对数刻度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：工业规模推流式沼气反应器中微生物群落结构的空间和时间异质性。（A）第223天四个采样口I-IV的微生物群落结构比较。（B）第II号采样口从第0天到第384天随时间变化的群落结构比较。为增强可视化效果，后期已去除噪声。细胞门控中检测了250,000个事件（补充文件1-S6）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；包含CHIC图像、异或/叠加组合及差异性度量的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：细胞计量直方图图像比较 — CHIC。 CHIC算法的原理通过比较两个分别代表空间异质性和时间异质性的样本进行说明。(i) 在选择两个参数显示（FSC 与 DAPI 荧光）后，从.fcs文件生成CHIC图像。灰度值（0–255）编码每个像素中的事件数量。(ii) 在指定包含细胞的区域后（此处为：200 &lt; x &lt; 4000，200 &lt; y &lt; 2200），生成CHIC子集。(iii) 通过比较子集之间的像素生成异或（XOR）组合图像。无差异对应值为0，以黑色显示；最大差异对应值为200，以白色显示。相应的XOR值通过累加XOR图像中所有像素的灰度值计算得出。(iv) 叠加组合图像通过将子集像素的灰度值相加生成。相应的叠加值通过统计叠加图像中不等于零、即含有信息的像素数量计算得出。(v) 差异性值通过将XOR值除以叠加值得到。这些值是图 6中NMDS图的基础。差异性值和NMDS图均显示空间群落异质性可忽略，而时间群落异质性显著。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="主成分分析（PCA）双标图，展示随时间变化的数据分组和方差情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：基于 CHIC 的沼气微生物群落样本相似性分析。 由于0天样本的群落结构差异极大，影响分析结果，因此未包含在本图中（见补充文件1-S11）。非度量多维尺度分析（NMDS）图证实了使用CHIC工具得出的假设，即空间异质性较低而时间异质性较高，该假设在图 5中已有说明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达数据的热图与聚类分析图，展示数据相关性值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：沼气微生物群落的相关性分析。 该矩阵基于补充文件1-S6中主门控模板确定的23个亚群落的相对丰度，采用Spearman秩相关系数计算得出。分析涵盖了来自一年周期内的48个样品，并与有机负荷率（OLR）进行了相关性分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="PCA结果的散点图，显示废水样品中浮游（P）和污泥（S）群落的聚类分布，用于比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
图8：废水处理中浮游（P）与污泥（S）群落的相似性分析。 样品取自某实际规模废水处理厂的初沉池（PCL）、活性污泥池（AS）和消化池（DT）（参见补充文件1-S10中的点图）。相对丰度通过补充文件1-S6所示的门控模板确定。这些亚群落丰度还通过flowCyBar工具进行分析，生成CyBar图（补充文件1-S10）和NMDS图（R &lt;0.01）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示纯培养物随时间（0、2、28 天）DAPI 荧光与 FSC 关系的流式细胞术图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58033/58033fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 9"> 
图9：纯培养物的固定稳定性。 来自生长曲线实验的 0 h 样品经 15% 甘油固定后，在 -80 °C 下保存 28 天。图中显示了 FSC 与 DAPI 荧光的散点图及对照微球。测量系列中不包含微球（补充文件 1-S3）。在细胞门控中记录了 50,000 个事件（补充文件 1-S6）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/58033fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary-File-1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58033/Supplementary_File_2.gif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

流式细胞术分析已被证明在研究纯培养物和监测微生物群落动态方面具有重要价值。我们分别提供了从取样到数据分析的三个完整工作流程，适用于透明培养基中的纯培养物和复杂群落，以及具有挑战性的基质环境。

纯培养物的研究及微生物群落动态的监测对于理解与控制自然生态系统和技术系统至关重要……

该方法有助于回答微生物生态学和生物技术领域的关键问题，例如，哪些生态学概念驱动着特定的生态系统。该技术的主要优势在于，它能够在保持高度成本效益的同时，通过短时间间隔的采样方案，紧密追踪快速变化的微生物组动态。该方法可用于获取有关生物技术及自然微生物群落的信息，同时也可用于研究动物和人类微生物组，以评估营养与健康状态。进行该操作演示的是我们实验室的技术员兼SediMeter操作员Florian Schattenberg。干燥沼气微生物群样本时，使用经改造的1毫升移液器吸头，将200微升黏稠的消化液转移至含有1.7毫升PBS的2毫升离心管中。充分混匀后，将离心管放入超声波水浴中处理1分钟，以分散可能存在的大块细胞聚集体，并使黏附在植物细胞残渣上的细胞脱落。超声处理后，充分混匀样品，并通过孔径50微米的滤网将细胞过滤至2毫升塑料离心管中。将滤液均分为四份，每份400微升，将各份样品离心两次，每次均彻底弃去上清液，以尽可能充分地通过机械方式去除微生物样品中的水分。随后，将样品置于加热的真空离心浓缩仪中干燥，形成稳定的沉淀，并将沉淀物于4摄氏度避光保存。为稳定和固定活性污泥样品，将4毫升细胞离心，并将沉淀重悬于4毫升含2%甲醛的PBS溶液中。室温孵育30分钟后，离心已稳定的细胞样品，并将沉淀固定于4毫升70%乙醇中，于-20摄氏度保存。充分混匀后，取0.6毫升固定后的细胞悬液转移至含有1.4毫升PBS的玻璃管中，彻底混匀后，按所示方法超声处理10分钟。超声处理结束后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升新鲜 PBS 中。充分混匀后，按照前述方法再次超声处理 5 分钟，并用新鲜 PBS 将 OD 700 纳米调整至 0.35。离心收集细胞，将沉淀重悬于 1 毫升透化缓冲液中，缓冲液含有 0.11 摩尔/升柠檬酸和 4.1 毫摩尔/升吐温 20，充分混匀后于室温孵育 20 分钟。然后通过离心收集细胞，并将沉淀充分重悬于2毫升含有0.68微摩尔DAPI的染色液中，在室温下避光孵育至少60分钟。对于珠子校准，将用于线性校准的珠子混合液加入流式细胞仪，持续测量珠子，同时调节喷嘴和激光光学位置，以在线性范围内对仪器进行预校准。当珠子峰能够拟合到预设的校准模板时，切换至对数模式，并加载对数校准珠子样本。将对数微球峰拟合到预设的校准模板，以微调仪器硬件，并利用光电倍增管增益设置对微球位置进行必要的最终调整。该流程中最关键的环节是保持测量的一致性，以确保不同实验之间的可比性。因此，每日对流式细胞仪进行校准，以及在生物样本中使用微球，对于实现稳定的流式细胞术微生物组透析至关重要。当细胞准备就绪后，混合并过滤样品，然后将对数微球混合物加入细胞中。现在混合样本并将其上样至流式细胞仪，设置门控以包含染色的细胞，并排除噪声和微珠。随后以每秒最多3,000个事件的速度连续分析样本，直至在细胞门内检测到250,000个细胞。为分析流式细胞术数据，需建立一个主门控模板，并将其应用于所有样本。首先将流式细胞术标准文件载入合适的流式细胞术分析软件，并依次处理样品。载入样品后，双击某次测量，然后从各自的下拉菜单中选择X轴和Y轴参数，以打开前向散射光与DAPI荧光图。使用多边形绘制工具重现先前设定的测量细胞门控，以排除微球和噪声，并将该门控命名。将细胞门控条目拖动到所有样本组列表中，并双击该细胞门控以选择性地仅显示细胞事件。使用椭圆门控工具定义样本中占主导地位的亚群，并将其合并。然后添加额外的亚群划分及后续样本，直至主门控模板适用于所有样本。通过侧向散射扫描方法控制主门控模板，以分辨彼此靠近聚集的亚群。然后，将所有亚群添加到表格编辑器中，并将输出统计量设置为父群频率。使用表格编辑器将相对亚群丰度导出至合适的电子表格软件，并根据侧边栏手册中的指南调整数据格式。然后，为了可视化亚群落的动态变化和相关性，安装并加载 R 软件包，导入并归一化 txt 文件。前向散射与 DAPI 荧光图可揭示分批培养过程中不同时间点纯菌株培养物的细胞周期状态。使用主门控模板可定量具有一个、两个或多条染色体的细胞比例，从而揭示该代表性微生物复制其染色体的速度快于其世代时间的能力。在随时间研究复杂的微生物群落时，可通过点图序列直观地展示群落变化的速度和重要性。利用流式细胞条形码工具，可以清晰识别实验不同阶段中的优势亚群落。将此数据与各亚群落相对丰度的频率分布相结合，可筛选出在关键时间点表现出显著丰度变化的门控区域。在非度量多维尺度图中对这些数据进行可视化，有助于深入理解群落动态。由于搅拌受限，沼气群落可能面临空间异质性问题。示例性沼气群落采样点表现出较弱的空间异质性，但具有显著的时间异质性。与产品紧密度等非生物参数存在强正相关或负相关关系，有助于理解并优化生态系统和生物技术过程。此外，这些相关性有助于识别具有特殊兴趣的目标群体，以便进行后续分选和分析。在建立该流程时，建议评估不同的固定和染色方法，以确定其在每批新样本中的表现和稳定性。分选完成后，可进一步采用扩增子测序、宏基因组学和蛋白质组学等方法，筛选出最具代表性的微生物群落，从而获取有关代谢通路中潜在基因归属及活性状态的信息。该方法为微生物生态学家和生物过程工程师提供了研究自然和受控生态系统中微生物组动态变化的有效途径，且资源投入合理。

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