在诱导剂梯度平板上定量细菌表面群集运动能力

该方案可在半固体琼脂上以经济高效的方式，同时追踪细菌对不同诱导剂浓度的群集运动反应。这种高通量筛选技术避免了为观察微化学趋向性反应而制备含不同诱导剂浓度的琼脂的需要。

该技术旨在用于药物筛选，同时观察微病原体的亚致死剂量（SD）反应。此外，还可用于研究微生物对人类宿主中各种生化信号的微反应。该方法可为细菌趋化性提供深入见解。

细菌会对不同浓度的化学引诱物（称为正向趋化性）或化学排斥物（称为负向趋化性）产生反应。必须精心准备实验装置，以避免下层凝胶角度的差异，防止出现重复性问题。首先，用染料和诱导剂的名称标记13厘米×13厘米的方形培养皿。

然后将培养皿边缘撑起，架在盖子上方。向温热的底层培养基中加入阿拉伯糖溶液。加入40毫升温热的底层培养基。

将底层培养基置于超净工作台中，不加盖，静置一小时使其凝固。待底层完全凝固后，移去皿盖，将培养皿放置于超净工作台内。使用电动移液器过滤装置加入40毫升温热的上层培养基。

将双层平板盖好并静置一小时后，于4 °C保存24小时。将标记好的A4纸置于已充分凝固的梯度平板下方。将100 µL移液器吸头的较宽一端插入标记位置处的半固体培养基表面，并下压移液器吸头直至其到达上层培养基的底部。

当枪头接触底部时，停止对枪头施加任何垂直方向的力，并轻轻旋转枪头以分离圆柱形孔中的内容物。将移液器枪头水平移动一小段距离，使空气能够进入预留的狭窄空间。用食指按压枪头以阻断枪头内部的气体流动。

垂直拔出枪头，拔出时保持枪头内含有孔中的液体。向每个孔中加入 80 µL 过夜培养的菌液。每隔 12 小时从培养箱中依次取出一张群游平板，放入凝胶成像系统中。

选择凝胶成像模式，将泳动平板暴露于白光下，并调节焦距以获得清晰的泳动群视野。通过将曝光时间调整为300毫秒，增强泳动群的亮度，以便精确观察。调节阈值以尽量减少背景光的干扰。

保存图像文件以供进一步分析。在 txt 文件中记录成像时间、诱导剂类型、梯度方向和菌株信息。单击“Process”，然后选择“Shadows”以增强图像的清晰度。

单击“Process”（处理），然后单击“Batch”（批处理）以处理图像。接着通过单击“Process”（处理）、“Shadows”（阴影）和“South”（南向）来处理参考图像。再单击“Process”（处理）、“Batch”（批处理）、“Macro”（宏），以打开批处理窗口。

查看窗口中显示的命令。在批处理窗口中点击“处理”，然后在输出文件地址处输入原始图像的文件夹路径。使用魔棒追踪工具逐个选择群体，并双击魔棒追踪工具调整容差，直到生成的线条准确贴合群体边界。

单击“分析”，然后选择“测量”以导出面积值。大肠杆菌 K12 YdeH 在阿拉伯糖梯度平板上进行测试，用于展示表面群集运动过程，相邻孔之间出现重叠现象。使用含有三个测试孔的平板可形成无重叠的边界。

随着阿拉伯糖浓度从最低浓度逐渐增加，铜绿假单胞菌PAO1 YdeH的群集运动能力得到促进，但在较高浓度的阿拉伯糖条件下则逐渐受到抑制。在0至400微升浓度范围内，于白藜芦醇梯度平板上测试的大肠杆菌K12野生型菌株表现出随着白藜芦醇浓度升高，其群集运动能力受到轻度抑制。群集面积通过ImageJ软件进行定量分析。

群集曲线展示了多种浓度下的响应情况。该实验方法最关键的步骤是制备含有特定诱导剂浓度范围的双层群集平板。该方法可使研究人员在特定浓度范围内研究诱导的表面群集行为，并量化其他诱导剂及组分对群集的影响。