量化诱导剂梯度板上细菌表面聚集运动

在这里，我们描述了使用诱导剂梯度板来评估细菌聚集运动，同时获得多种浓度响应。

该协议同时跟踪半固体琼脂上不同诱导剂浓度的细菌聚集反应。这是以具有成本效益的方式实现的。这种高通量筛选技术消除了具有各种诱导剂浓度的琼脂观察微化学反应的需要。

该技术旨在用于药物筛选以及观察微病原体SD反应。此外，它还可用于研究人类宿主中对各种生化线索的微反应。这种方法可以提供对细菌趋化性的洞察。

细菌会对各种浓度的化学引诱剂（称为正趋化性）或化学驱虫剂（称为阴性趋化性）作出反应。精心准备的设置对于避免下层凝胶角度之间的变化至关重要，以防止再现性问题。首先，在13×13厘米见方的培养皿上贴上污渍和诱导剂名称。

然后将盘子撑在盖子的边缘。将阿拉伯糖溶液加入温暖的底层培养基中。加入40毫升温底层培养基。

让底层介质在层流罩内裸露固化一小时，不受干扰。一旦底层完全凝固，取下盖子并将培养皿放在层流罩内。使用电动移液器过滤器加入40毫升温热的上层介质。

固化双层板覆盖且不受干扰一小时，然后在四摄氏度下储存24小时。将标记的A4纸放在凝固良好的梯度板下。将100微升移液器吸头的较宽侧推入半固体介质表面的标记位置，然后按压移液器吸头，直到其到达上层介质的底部。

当尖端接触底部时，停止对尖端施加任何垂直力，并轻轻旋转尖端以隔离圆柱形孔的内容物。沿一小段距离水平移动移液器吸头，让气流进入预留的狭窄位置。用食指按压吸头以阻挡吸头内的气体流。

垂直拉出尖端，在将其拉出时将孔内容物保持在尖端中。将80微升的过夜生长培养物加入每孔中。每12小时将蜂群板从培养箱中取出一个，并将其置于凝胶成像系统中。

选择凝胶成像模式，将蜂群板暴露在白光下，并调整焦距以获得群的清晰视图。通过将曝光时间调整为300毫秒，增强群体的亮度以进行精确观察。调整阈值以最大程度地减少来自背景光的干扰。

保存图像文件以供进一步分析。在txt文件中记录成像时间，诱导剂类型，梯度方向和菌株。单击"处理"，然后单击"阴影"以增强图像的清晰度。

单击"处理"，然后单击"批处理"以处理图像。然后通过单击"处理"、"阴影"和"南"将图像作为参考进行处理。单击"处理"、"批处理"、"宏"以打开"批处理"窗口。

查找窗口中显示的命令。在输出文件地址中键入原始图像的文件夹地址，方法是单击"批处理"窗口中的"处理"。使用魔杖追踪工具单独选择群，然后双击魔杖追踪工具以调整容差，直到生成的线正确拟合群边界。

单击"分析"，然后单击"测量"以导出区域值。在阿拉伯糖梯度板上测试大肠杆菌K12 YdeH，用于证明相邻井之间发生重叠的表面聚集过程。具有三个测试井的板能够形成非重叠边界。

铜绿假单胞菌PAO1 YdeH聚集运动随着阿拉伯糖浓度从最低浓度的增加而得到促进，但逐渐限制为较高浓度的阿拉伯糖浓度。在0至400微升浓度范围内的白藜芦醇梯度板上测试的大肠杆菌K12野生型菌株显示，随着白藜芦醇浓度的增加，聚集运动受到适度限制。Swarm区域由ImageJ软件量化。

群动曲线显示了多重浓度响应。该过程最关键的部分是制造具有特定浓度范围的诱导剂的双层蜂群板。这种方法使研究人员能够在特定浓度范围内研究诱导的表面聚集，并量化其他诱导剂和组分对群体的影响。