研究内质网和线粒体相互作用通过原位接近连接分析在固定细胞

本实验的总体目标是在固定细胞中使用原位邻近连接测定来可视化和量化内质网线粒体相互作用。这种方法可以帮助回答生物医学领域的关键问题，以使用简单的免疫荧光技术更好地分析固定细胞中的 ER 线粒体相互作用。希望能提出新的治疗策略。该技术的主要优点是我们可以可视化和量化固定细胞中的 ER 线粒体相互作用，并且该技术可应用于患者的石蜡包埋组织活检。使用本视频中演示的原位邻位连接测定，线粒体外膜上针对 VDAC1 的小鼠一抗和内质网膜上针对 IP3R1 的兔一抗结合到线粒体相关膜界面附近的表位。添加带有 DNA 末端尾部且针对小鼠和兔 IgG 的邻位连接探针，可以形成连接寡核苷酸连接的模板，并且可以使用 Texas Red 寡核苷酸进行扩增和可视化。与两个细胞器膜之间的距离一致，在线粒体相关膜界面处。为了固定和封闭细胞以进行原位邻位连接测定，每个未编码的 35 mm 玻璃底培养皿以 150， 000 个细胞的速度接种人 H7 细胞。第二天，去除培养基并使用 1 mL PBS 洗涤细胞。然后，吸出缓冲液并加入 1 mL 10% 甲醛。将板在室温下搅拌孵育 10 分钟以固定细胞。要终止反应，加入 1 mL 1 M 甘氨酸，并旋转混合板。去除甘氨酸溶液并加入 1 mL 1XPBS。然后，短暂搅拌板并吸出缓冲液。接下来，向细胞中加入 1 mL 100 mM 甘氨酸。将板在室温下搅拌孵育 15 分钟。吸出溶液后，通过在 PBS 中加入 1 mL 的 0.1% triton-X100 来透化细胞。并重复孵育。吸出去污剂并加入 1 mL PBS 洗涤细胞。去除缓冲液后，向每个细胞培养皿中加入 40 微升封闭液，并将样品在 37 摄氏度的潮湿室中孵育 30 分钟。然后从培养皿上拍打封闭溶液，尝试为每张载玻片获得相等的缓冲液残留体积，同时不允许载玻片干燥。要进行邻位连接测定，请使用 PBS 稀释一抗。涡旋并将溶液加入培养皿中。将样品在 4