Name: 使用扫描透射电子显微镜研究纳米大小的物体的动态过程中的液体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 了解液体扫描透射电子显微镜技术，用于观察水中金纳米颗粒的动态过程。该方法可实时捕捉纳米材料的形态变化，为材料科学和生物学研究提供重要的原位成像手段。

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我们感谢E. Arzt通过INM提供的支持。本研究部分得到了2014年莱布尼茨竞赛的资助。

<ol><li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy.</a> Science. 350, 9881-9889 (2015).</li>
<li>de Jonge, N., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+specimens+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of specimens in liquid.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).</li>
<li>Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+single+colloidal+platinum+nanocrystal+growth+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories.</a> Science. 324, 1309-1312 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+growth+of+nanoparticles+from+solution+with+in+situ+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).</li>
<li>Alloyeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+kinetic+and+thermodynamic+effects+on+the+growth+of+gold+nanoplates+by+liquid+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).</li>
<li>Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+carbonate+nucleation+driven+by+ion+binding+in+a+biomimetic+matrix+revealed+by+in+situ+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy.</a> Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).</li>
<li>de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li>
<li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+macromolecular+complexes+with+in+situ+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Micron. 43, 1085-1090 (2012).</li>
<li>Dukes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microchip+design+and+application+for+in+situ+transmission+electron+microscopy+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules.</a> Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li>
<li>de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/278397751_Practical_Aspects_of_Transmission_Electron_Microscopy_in_Liquid">Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid.</a> Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).</li>
<li>Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exceptionally+slow+movement+of+gold+nanoparticles+at+a+solid%3Aliquid+interface+investigated+by+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy.</a> Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).</li>
<li>Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp507400n">Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).</li>
<li>Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+beam+induced+chemistry+of+gold+nanoparticles+in+saline+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution.</a> Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).</li>
<li>Schuh, T., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S163107051300203X">Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids.</a> C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).</li>
<li>Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+chip+system+with+a+microfluidic+channel+for+in+situ+electron+microscopy+of+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids.</a> Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).</li>
<li>Creemer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/5428851/">A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions.</a> J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).</li>
<li>Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microscopy+of+nanoscale+cluster+growth+at+the+solid-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface.</a> Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).</li>
<li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+cells+and+tissues+under+fully+hydrated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Reimer, L., Kohl, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReimer%2C+L+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+quantitative+liquid+%28scanning%29+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy.</a> Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).</li>
<li>Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+procedures+to+mitigate+electron+beam+induced+artifacts+during+in+situ+fluid+imaging+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials.</a> Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).</li>
<li>Hohmann-Marriott, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+3D+cellular+imaging+by+axial+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography.</a> Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).</li>
<li>Unocic, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+electrochemical+measurements+using+in+situ+ec-S%2FTEM+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices.</a> Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).</li>
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<li>Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+microscopy+at+a+spatial+resolution+better+than+15+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm.</a> Nature. 435, 1210-1213 (2005).</li>
<li>Larabell, C. A., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+architecture+with+X-rays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular architecture with X-rays.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).</li>
<li>Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((atomic+force+microscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">atomic force microscopy of biological samples.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).</li>
<li>Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+between+conventional+and+video-speed+scanning+probe+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes.</a> Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).</li>
<li>Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instr%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy in liquid.</a> Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述方案能够实现液相中金纳米颗粒（AuNPs）的扫描透射电子显微成像（STEM），包括对动态过程的观察。液体流动型透射电镜载网支架的组装是一种易于掌握的技术。然而，在使用液体流动型透射电镜载网支架时，需考虑若干关键因素。例如，硅微芯片的破损边缘或O型圈上的大颗粒可能导致液体池泄漏。另一方面，大颗粒（&#62;200 nm 例如， 硅膜上的灰尘或硅碎屑可能导致液体池厚度增加，从而引起成像对比度降低或空间分辨率下降，甚至可能导致氮化硅窗口破裂。尤为重要的是，盐分或其他化学物质的残留可能以非预期的方式影响实验结果。因此，必须在洁净无尘的环境中仔细进行样品制备和样品台组装的各个步骤。
液体池的厚度决定了可达到的分辨率以及所获图像的对比度17. 该厚度可通过位于两个硅微芯片之一上的间隔物进行调节。根据样品的尺寸，可实现不同厚度的液体池。在研究金纳米颗粒（AuNPs）时，可使用较小的间隔物（200–500 nm），而完整的真核细胞则需要最大达5 µm的较大间隔物。液体池的厚度还受到氮化硅（SiN）薄膜窗因液体池内部与周围真空之间的压差而发生凸起的影响。这种效应在较大的SiN薄膜窗中更为显著。因此，为尽量减小液体池的厚度，建议使用较小的SiN薄膜窗。若难以使两个小窗口完全重叠，可采用不同的基底微芯片将它们以交叉构型组装。其他替代构型可显著抑制凸起现象，其中包括使用一体式（monolithic）微芯片的结构18 或由支柱支撑的膜窗19，但这些方法在样品加载方面存在劣势。当前技术最具挑战性的问题之一是对液体厚度缺乏精确控制。通常，液体厚度远大于所用间隔片尺寸预期的厚度，正如本文所示。一些研究团队采用了封闭式液体池4,20,21,22；这些系统在空间分辨率方面具有一些优势，因为可以通过在液体中引入气泡来减小液层厚度。或者，可使氮化硅窗口破裂，从而形成更薄的液体层。第三，也可采用其他更薄的窗口材料封装样品（例如， 石墨烯23，也会产生比本方案所述系统所能实现的更稀薄的液体。然而，在那些系统中无法实现液体流动。
对于任何高&#160;分辨率显微技术，都必须考虑若干实验因素。其中最重要的因素是电子束与液体或样品之间的相互作用。除了辐射损伤（这会限制许多固体样品所能达到的空间分辨率）24之外，液体样品还会受到电子束诱导产生的辐射分解产物的影响15,25。由于这些产物可能影响实验结果，因此严谨的数据解释和实验设计至关重要26。显微镜参数的设置应根据具体研究目标来选择。对于在较厚液体池中成像高原子序数（Z）的纳米颗粒，ADF STEM 更具优势；而透射电子显微镜（TEM）对低Z材料具有更好的对比度，通常成像速度更快，但需要更薄的液体层3。有时也可使用明场（BF）探测器对液体池进行成像，因为BF STEM在厚层中对低Z材料的成像更具优势27。随着液体池厚度的增加，需要更高的束流。然而，这也会提高辐射分解产物的浓度，并加剧辐射损伤。还应注意，在液体池非常厚的情况下（水层厚度&#62;10 µm），ADF探测器中会出现对比度反转现象。
通过将样品台从显微镜上取下，并更换样品和液体，可在不同实验之间改变液体条件。除了改变盐浓度外，还可以通过引入不同的液体来轻易调节液体的其他性质（例如，可使用缓冲溶液以设定特定的pH值16，或引入有机溶液或其他添加剂）。此外，也可在样品台仍插入显微镜时，通过微流控系统注入液体来更换液体环境。然而，在这种情况下，无法确切知道样品处液体更换完成的具体时间点。值得注意的是，已有支持电极的微芯片可供使用，因此可开展纳米尺度的电化学实验28。
研究对象不仅限于水中的金纳米颗粒（AuNPs），还可利用上述方案研究多种样品，包括二氧化硅、二氧化钛和聚合物等。若颗粒运动过快，导致在采集过程中无法在图像中捕捉到其运动轨迹，可通过使用50%甘油与50%水的混合液，使溶液黏度降低一个数量级。
从上述几点可以看出，液相扫描透射电子显微镜（STEM）具有一系列优势、可能性，同时也存在一些劣势。在进行液相STEM实验时，需要考虑的最重要缺点包括：1）任何实验都会受到电子束与整个样品（包括被观察物体、液体以及氮化硅薄膜）之间动态相互作用的影响；2）样品处理过程繁琐，且由于样品或微芯片中常含有微米级颗粒，通常难以形成均匀的薄液层；3）液体的实际厚度往往与通过间隔层设定的目标厚度存在显著差异；4）空间分辨率和对比度在很大程度上取决于液体厚度，以及被观察物体与液体之间密度变化的差异。
目前，已有多种方法可实现对液体中物体的纳米级空间分辨率显微观察。非晶冰中的电子显微技术是一种强大的方法29，但其实验流程较为精细，且并非所有实验都允许将样品制备在冰中，无法进行时间分辨实验。X射线显微技术30,31原则上可以使用，但其空间分辨率有限，且在实验室中尚未广泛普及。液相中的原子力显微技术虽已建立，但仅适用于表面成像32,33,34,35。光学显微技术则不具备足够的空间分辨率。目前，液相电子显微技术似乎是直接观察液体中纳米尺度物体与过程的最强大技术。
液相透射电子显微镜（TEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）目前尚未成为常规的分析技术，仍处于发展阶段。需要考虑的参数数量众多，实验结果往往难以重复。此外，由于所研究的效应与电子束引发的其他过程相互交织，定量数据的获取尤为困难。本文所述的实验方案旨在标准化实验流程，从而涵盖实验中所有相关的基本要素。我们希望该方案能够促进这一新兴领域内实验工作的更好重复性。

传统的扫描透射电子显微镜（STEM）受限于适合分析的样品类型，特别是适用于高真空环境的干燥固体样品。然而，许多科学与技术问题涉及液体环境中纳米尺度的材料与过程。如今，利用一种新型概念，可以对完全浸没在液体中的样品进行STEM研究，该方法通过在透射电子显微镜（TEM）和STEM样品 holder 中组装微流控腔室来实现1。这一新发展的技术正变得日益流行，因为它为多个研究领域的重要过程提供了新的见解，包括纳米颗粒的生长、溶解和聚集过程2,3,4,5,6。不仅可以研究金属材料，还可用于生物矿物7和生物系统的研究8,9,10,11。液相STEM的样品加载与图像采集不同于干燥样品的STEM操作，需要遵循特定的实验流程，并接受专门培训。
微流控系统由两块硅微芯片组成，这些芯片支撑着氮化硅（SiN）薄膜窗，该薄膜窗对能量为200 keV的电子束具有透射性12（见图1A）。有关这些微芯片的尺寸和操作细节可参见其他文献12,13。样品通常包含纳米尺度的物体。本文中我们观察的是金纳米颗粒（AuNPs）。AuNPs固定在上层窗口（相对于向下传播的电子束而言）或悬浮在液体中。STEM中的纳米级空间分辨率是通过将电子束扫描至AuNPs上，并使用环形暗场（ADF）探测器收集透射的散射电子而获得的9。这两块微芯片被放置在液体流动透射电镜样品杆尖端的一个小槽内1（该样品杆既可用于STEM也可用于TEM，但通常称为TEM样品杆）。其中一块微芯片包含一个间隔层，从而在两块微芯片之间形成一个液体腔室。位于两块微芯片两侧的O型圈为液体腔室提供真空密封13（见图1B）。
本文旨在演示样品加载和数据采集的基本步骤，以便感兴趣的用户能够轻松掌握这一新兴技术。虽然使用了某特定公司提供的系统，但本方案同样适用于其他公司的系统。该技术比传统的透射电子显微镜（TEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）更为复杂，在使用液体样品台系统时必须考虑多个实际因素13。其中最重要的是确保液体腔室正确组装，从而形成一层薄液并实现真空密封。因此，在液体流动型透射电镜样品台的制备与组装过程中，必须保持操作环境清洁，避免产生灰尘。特别是O型圈和两片硅微芯片必须完全无污染。即使微芯片上存在微小的尘粒，也可能显著增加组装后样品池的厚度，从而导致无法获得有效的空间分辨率。真空密封至关重要，以确保实验结束后不会对电子显微镜造成污染或损坏。本方案详细描述了样品加载流程以及若干必要的测试步骤。电子显微镜的操作本身较为直接，但相比固体样品的显微观察，需要额外执行一些步骤。随着液体厚度的增加，更多电子会被液体吸收和散射，因此测量液体厚度至关重要。最后，本方案还说明了如何进行成像以及如何研究动态过程。
<img alt="液体池透射电镜装置示意图：电子束与液体流动中金纳米颗粒的相互作用。" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：用于扫描透射电子显微镜（STEM）的液体流动池。（A）组装好的液体池示意图。两个带有氮化硅（SiN）薄膜窗口的硅微芯片被置于两个O型圈之间。液体被封闭在SiN薄膜之间，从而与电子显微镜中的真空环境隔离。聚焦的电子束对样品进行扫描，通过散射电子获得衬度。金纳米颗粒（AuNPs）在SiN薄膜表面的液体中被固定，但也可能在液体中移动。（B）两个微芯片与O型圈堆叠结构的示意图侧视截面图。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>双目光学显微镜</td><td>Leica</td><td>M60 CMO</td><td></td></tr><tr><td>带球差校正器的扫描透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>ARM200F</td><td></td></tr><tr><td>液体流动透射电镜样品 holder</td><td>DENS Solutions</td><td>Ocean</td><td></td></tr><tr><td>微流控注射泵</td><td>Harvard Scientific</td><td>PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Gatan</td><td>Solarus950</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮，Rotisolv&amp;nbsp; Plus HPLC级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7328.2</td><td></td></tr><tr><td>水，chromasolv Plus HPLC级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，Rotisolv HPLC级</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐稳定的金胶体，直径30 nm</td><td>British-Biocell</td><td>EM.GC20</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基底硅微芯片，含50 nm厚氮化硅薄膜，尺寸为20 &amp;micro;m × 0.40 mm</td><td>DENS Solutions</td><td>适用于Ocean系统</td><td></td></tr><tr><td>间隔层硅微芯片，含50 nm厚氮化硅薄膜，尺寸为20 &amp;micro;m × 0.40 mm，间隔层厚度为200 nm</td><td>DENS Solutions</td><td>适用于Ocean系统</td><td></td></tr><tr><td>微流控peek管路</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1570</td><td></td></tr><tr><td>塑料可更换尖头镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>（抗磁、耐酸不锈钢主体，ESD PVDF (SV) 尖头）</td><td>ideal-tek</td><td>2ASVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>带特氟龙涂层的弯头钢镊（EMS SA，带&quot;PTFE&quot;涂层）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78322-7Te</td><td></td></tr><tr><td>带特氟龙涂层的宽头钢镊（EMS 2A，带&quot;PTFE&quot;涂层）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78322-2ATe</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器，1 mL，气密型（型号 1001 TLLX SYR）</td><td>Hamilton</td><td>81323</td><td></td></tr><tr><td>洁净室用Sontara Micropure AP擦拭纸（224 × 224 mm）</td><td>DuPont</td><td>Sontara MicroPure</td><td></td></tr></tbody></table>

使用扫描透射电子显微镜研究液体中纳米级物体的动态过程

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

利用透射电子显微镜（TEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）中装配于样品台内的微流控腔室，可对完全浸没在液体中的样品进行纳米级空间分辨率的研究。该微流控系统由两片支撑着薄氮化硅（SiN）膜窗的硅微芯片组成。本文描述了样品加载和数据采集的基本步骤。最重要的是确保液体腔室正确组装，从而形成一层薄液体并实现真空密封。本实验方案还包括在样品加载过程中必须执行的一系列检测步骤，以确保组装正确。一旦样品装入电子显微镜，需测量液体层的厚度。组装不当可能导致液体过厚，而液体过薄则可能表明液体缺失，例如气泡形成的情况。最后，本方案还说明了如何进行成像以及如何研究动态过程。实验对含有金纳米颗粒（AuNPs）的样品分别在纯水和生理盐水中进行了成像。

使用液体流动透射电镜样品台研究了金纳米颗粒（AuNPs）在液体中的行为。在纯水中，AuNPs稳定地固定在氮化硅（SiN）膜上，并利用液相扫描透射电子显微镜（STEM）实现了纳米级分辨率成像（图6）。对于强散射的金材料，获得了优异的对比度。在干燥测试样品上测得荧光屏上的电流密度为20 pA/cm²，而插入液体流动透射电镜样品台后，电流密度降至8 pA/cm²。根据公式1计算，水层厚度twater = 2.4 ± 0.5 µm，远大于由间隔层设定的200 nm厚度。尽管如此，该厚度仍足以支持对AuNPs进行纳米级空间分辨率的成像。液体层厚度超过200 nm的设定值，主要是由于氮化硅膜的鼓胀、微芯片表面不平整以及微芯片上存在的杂质所致。
对于纯水，金纳米颗粒（AuNPs）在成像过程中能保持其形状16，尽管电子束与水相互作用产生的活性辐射分解产物（e-aq、H•、H+、OH•）可能氧化单个金原子，导致AuNPs形状改变15。然而，在另一项实验中使用液体流动系统引入氯离子后，AuNPs的稳定性发生了变化。氯离子能够以四氯金酸根（AuCl4-）的形式稳定被氧化的金原子。图7显示，在STEM时间序列成像过程中，AuNPs逐渐溶解，这与先前报道的结果相似16。在所用的电子剂量率下，溶解30 nm大小的AuNPs约需300秒。
在第三次实验中研究了金纳米颗粒（AuNPs）在水中的运动行为（图8）。实验前，对液体流动透射电镜样品台进行了清洗，以去除任何残留的盐分。与第一次实验不同，本实验采用了一种替代的样品制备方法，以实现AuNPs与氮化硅（SiN）膜之间更弱的结合14。具体而言，将AuNP溶液滴加到硅微芯片上，并在溶液未完全干燥的情况下将其组装进液体流动透射电镜样品台。通过这种方式，在所使用的电子束剂量率下，AuNPs容易从SiN膜上脱离。部分AuNPs移出视野进入本体溶液中，而其余的AuNPs则保留在视野内，靠近SiN窗口区域。观察到这些AuNPs发生了运动，并最终发生团聚。一段时间后，这些团聚体也从SiN膜上脱落，移出视野并进入溶液中。
<img alt="纳米颗粒聚集，电子显微镜图像，比例尺100 nm，材料科学研究。" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6：直径为30 nm的金纳米颗粒（AuNPs）位于纯水层顶部的扫描透射电子显微镜（STEM）显微图像。 所示图像为原始图像的选定区域。图像尺寸为1,024 × 1,024像素，像素驻留时间为19 µs，像素尺寸为0.73 nm，放大倍数为400,000X。因此，电子剂量为7.1 × 104 e-/nm²。在荧光屏上测得的电流密度为8 pA/cm2，据此计算出液体层厚度为2.4 µm。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="90秒内纳米颗粒聚集的时间推移显微图像；比例尺为60 nm。" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7：盐水中金纳米颗粒（AuNPs）的扫描透射电子显微镜（STEM）时间推移序列图像。 （A-D）从时间推移的STEM图像序列中每隔30秒提取的图像。由于氯离子的存在，AuNPs在液体中逐渐溶解。像素驻留时间为2 µs，时间推移序列的帧时间为1.75 s，像素尺寸为0.44 nm，放大倍数为500,000X。每幅图像的电子剂量为1.2 × 104 e-/nm²。液体厚度为2.4 µm。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜中的动态粒子追踪；图A：粒子运动路径，图B：彩色轨迹。" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 8"> 
图 8：金纳米颗粒在纯水中运动的扫描透射电子显微镜（STEM）图像。（A）含金纳米颗粒（AuNPs）的氮化硅（SiN）膜，其中若干颗粒以箭头标出。（B）所选金纳米颗粒的运动轨迹（见图 A）。部分金纳米颗粒在成像过程中移出视野。其余金纳米颗粒沿氮化硅膜表面横向移动并开始聚集。当聚集体达到临界尺寸后，便从膜表面脱离并移出视野。像素驻留时间为 1 µs，帧时间为 0.52 s，像素尺寸为 1.8 nm，放大倍数为 120,000X。每幅图像的电子剂量为 3.5 x 102 e-/nm²，液体层厚度为 2.4 µm。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了用于在水中观察金纳米颗粒（AuNPs）纳米尺度动态过程的液体流动样品 holder 在扫描透射电子显微镜中的操作方法。

完全浸没在液体中的样品可利用扫描透射电子显微镜（STEM）以纳米级空间分辨率进行研究，通过……

液相扫描透射电子显微镜的总体目标是观察完全嵌入厚度达数微米液层中的生物样品内纳米材料的结构与现象。该方法有助于回答材料科学领域中的关键问题，例如纳米材料在液体中的行为以及生物样品在天然液体环境中的研究。该技术的主要优势在于能够提供液态环境下样品的纳米级形貌信息。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为样品台的装载和图像采集并不像最初使用电子显微镜时那样简单。开始操作前，在洁净的超净工作台中，使用无纤维擦拭纸和纯乙醇清洁光学显微镜玻片。将玻片放置于培养皿内的洁净室擦拭纸上，并盖上培养皿盖子。使用碳涂层镊子操作氮化硅微芯片时，应牢固但小心地夹住微芯片的长边，始终确保氮化硅膜朝上。采用此方法，将五个无间隔层的微芯片和五个带有200纳米间隔层的微芯片放置在玻璃载片上。盖上培养皿，并将微芯片转移至通风橱中。将微芯片膜面朝上放入盛有HPLC级丙酮的烧杯中。轻轻摇晃烧杯两分钟，以去除保护涂层，注意避免微芯片翻转。随后，迅速将微芯片转移至盛有纯乙醇的烧杯中。用铝箔覆盖烧杯。轻轻摇晃烧杯两分钟，以彻底去除涂层，然后将其放入密闭的培养皿中，并移至超净工作台。将微芯片放置在一张洁净室专用纸巾上，注意在镊子松开时不要翻转微芯片。让微芯片干燥几分钟，然后将微芯片放置在培养皿中的载玻片上。盖上培养皿，将微芯片送至等离子清洗仪。将玻璃载玻片和微芯片放入等离子清洗机中，运行五分钟清洗程序，以去除氮化硅膜上的碳氢化合物。使用光学显微镜检查微芯片是否存在膜破裂或颗粒污染物。丢弃破损或污染的微芯片。在层流罩中，将微芯片固定于内表面具有黏性的洁净转运盒内。在无间隔垫片的各微芯片氮化硅膜上，加入1微升3摩尔柠檬酸盐稳定的水相金纳米颗粒溶液，并使其自然干燥。随后，在膜上加入1微升去离子水，以洗去盐分和表面活性剂。30 秒后，使用滤纸小心吸去水分，并让微芯片自然干燥。将液体流动透射电镜样品台的尖端置于双目光学显微镜下。取下样品台尖端的钛盖，并将其放置在一张铝箔上。使用一个装有0.5毫升HPLC级水的一毫升玻璃注射器，设置微流控注射泵。将注射器连接至流动系统并启动泵。当水冲洗系统时，检查管路是否存在泄漏或流动受阻情况。当抽吸完成后，从液体池腔室中移除清洗液，并用滤纸擦干样品杆尖端。使用光学显微镜检查样品杆尖端。用洁净室专用纸巾擦干尖端，并使用洁净的聚四氟乙烯（PTFE）涂层镊子去除灰尘或纤维。检查持样器尖端盖、O型圈和螺丝，使用聚四氟乙烯涂层镊子去除灰尘或纤维。将O型圈放入持样器组件中。安装第一颗螺丝并旋转数次，使其刚好固定。使用洁净的弧形镊子将样品微芯片放置在夹持器尖端的凹槽中，确保氮化硅（SiN）薄膜朝上。利用双目光学显微镜检查微芯片是否正确就位。在样品微芯片上滴加0.3 µL纯过滤水。 用镊子固定微芯片的位置。然后，用倒持的弯头镊子夹起一个间隔微芯片。小心旋转镊子，使微芯片的膜面朝下。将间隔微芯片放置在样品微芯片上。在夹持器尖端下方放置反光材料，并在双目光学显微镜下检查微芯片的对准情况。如果氮化硅窗口未对准，使用镊子小心调整微芯片。然后用镊子夹起样品室盖。将盖子倒置，不要触碰微芯片，将盖子的背面放在支架尖端上。用镊子放置剩下的螺丝，并以交替方式拧紧两颗螺丝。小心拧紧，直至遇到阻力为止。若拧得过紧，窗口容易破裂。启动每分钟四微升的液体流速，通过系统检查持样器尖端是否泄漏。然后，将样品台移至真空泵站并进行漏气检查。确保在五分钟内压力至少达到10的负5次方毫巴。将样品台放入其外壳中。将样品台移至电子显微镜中。将显微镜设置为STEM模式。使用镀有金纳米颗粒的超薄碳膜作为无水参考样品，测量电子束的电流密度。以不超过每分钟2 µL的流速开始通入纯水。将液体流动TEM样品台插入真空装载锁，并开始抽真空。确保压力正常下降。然后将透射电镜样品杆完全插入显微镜中。当真空度足够低时，打开电子束阀门并插入ADF探测器。将显微镜设置为连续采集模式，并在X和Y方向上移动样品台，以找到SiN窗口。调节对比度和亮度，使窗口的边缘清晰可见。在 X 和 Y 方向上移动载物台，使窗口的一个角位于视野中心。然后重置物镜。调整样品台的垂直位置，以粗略聚焦角落。将样品台前后倾斜五度，检查样品是否处于齐焦高度。将视场中的窗口角落居中，然后在软件中保存样品台位置。在 X 和 Y 方向上移动载物台，直至观察到金纳米颗粒。然后调节物镜焦距。记录当前电流密度，并计算液体池厚度。在 X 和 Y 方向上移动载物台，找到至少含有 20 个金纳米颗粒的区域。设置参数并采集图像。金纳米颗粒被固定在氮化硅膜上，并通过液相扫描透射电子显微镜（STEM）成像。在纯水中，金纳米颗粒在整个成像过程中保持其形状。水的辐射分解产物可能氧化单个金原子，最终导致纳米颗粒形状的改变。在另一项实验中，将氯离子引入液相中。在实验过程中，氧化的金原子形成了可溶性的四氯金酸盐，导致金纳米颗粒逐渐溶解。为了研究金纳米颗粒在水中的运动行为，在后续实验中，纳米颗粒未被完全固定在样品膜上。金纳米颗粒发生团聚，当达到临界团簇尺寸时，便移出了视野范围。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。但需要数周的培训。在尝试该操作过程中，重要的是要保持冷静，并注意检查真空密封性和液体厚度。该技术问世后，为材料科学、化学和生物学领域的研究人员探索液相中纳米颗粒的生长与运动、液相环境下纳米材料的结构以及哺乳动物细胞中蛋白质的功能开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对嵌入水层中的金纳米颗粒进行扫描透射电子显微镜观察，包括正确装载样品杆和调节显微镜的操作方法。请务必注意，若样品杆装载不当，在电子显微镜中使用液体样品可能导致设备损坏。因此，在加载前检查真空泄漏非常重要。

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