使用扫描透射电子显微镜研究纳米大小的物体的动态过程中的液体
February 5th, 2017
这个协议描述一种用于扫描金纳米粒子的透射电子显微镜中的水，如用于纳米动态过程的观察液流试样保持器的操作。
液相扫描透射电子显微镜的总体目标是观察完全嵌入厚度达几微米的液体层中的生物样品中纳米材料的结构和现象。这种方法可以帮助回答材料科学领域的关键问题，例如纳米材料在液体中的行为和自然液体环境中生物样品的研究。该技术的主要优点是它提供了有关液体中标本的纳米级形态信息。
通常，刚接触这种方法的人会遇到困难，因为样品架的加载和图像采集并不像最初使用电子显微镜完成的那样简单。要开始该程序，请在干净的层流罩中，用无纤维组织和纯乙醇清洁光学显微镜载玻片。将载玻片放在带盖的培养皿中的洁净室纸巾上。
要作 SiN 微芯片，请使用碳涂层镊子，用力但小心地抓住微芯片的长边，保持 SiN 膜始终朝上。使用这种技术，在载玻片上放置 5 个没有垫片的微芯片和 5 个带有 200 纳米垫片的微芯片。关闭培养皿，将微芯片放入通风橱中。
将微芯片放入 HPLC 级丙酮烧杯中，膜面朝上。轻轻旋转烧杯两分钟以去除保护涂层，注意不要翻转微芯片。然后，将微芯片快速转移到装有纯乙醇的烧杯中。
用铝箔盖住烧杯。轻轻旋转烧杯两分钟以完成去除涂层，然后将其放入密闭培养皿中，放入层流罩中。将微芯片放在新鲜的洁净室纸巾上，小心不要在微芯片从镊子中释放时翻转微芯片。
让微芯片干燥几分钟。然后将微芯片放在培养皿中的载玻片上。关闭培养皿，将微芯片带到等离子清洁器中。
将载玻片和微芯片放入等离子清洗剂中，并运行五分钟的清洁程序以去除 SiN 膜上的碳氢化合物。使用光学显微镜检查微芯片是否有破裂的膜或污垢颗粒。丢弃损坏或脏污的微芯片。
在层流罩中，将微芯片固定在具有粘性内表面的干净运输箱中。将一微升三摩尔柠檬酸盐稳定的金纳米颗粒水溶液液滴涂在每个微芯片的 SiN 膜上，无需垫片，并让溶液干燥。然后，在膜上涂抹一微升去离子水以洗去盐和表面活性剂。
30 秒后，用滤纸小心地擦去水，让微芯片干燥。将液体流动 TEM 支架的尖端放在双目光学显微镜下。从支架尖端取下钛盖，并将其放在一块铝箔上。
设置一个微流体注射泵，配备一个装有 0.5 毫升 HPLC 级水的 1 毫升玻璃注射器。将注射器连接到流量系统并启动泵。当水通过系统冲洗时，检查管线是否有泄漏或流量受限。
泵送完成后，从液体池室中取出冲洗液，并用滤纸擦干支架尖端。用光学显微镜检查支架尖端。用洁净室纸巾擦干尖端，并用干净的 PTFE 涂层镊子去除灰尘或纤维。
检查支架尖端盖、O 形圈和螺钉，并使用涂有 PTFE 的镊子去除灰尘或纤维。将 O 形圈放在支架组中。放置第一个螺丝并转动几次，使其保持原状。
用干净的弯曲镊子将样品微芯片放入支架尖端的口袋中，使 SiN 膜朝上。使用双目光学显微镜检查微芯片是否正确就位。将 0.3 微升纯过滤水滴到样品微芯片上。
用镊子将微芯片固定到位。然后，拿起一个垫片微芯片，用倒置的弯曲镊子。小心地旋转镊子，使微芯片膜朝下。
将垫片微芯片放在样品微芯片上。将反光材料放在支架尖端下方，并检查双目光学显微镜下的微芯片对齐情况。如果 SiN 窗口未对齐，请使用镊子小心调整微芯片。
然后，用镊子拿起标本室盖。将盖子倒置，在不接触微芯片的情况下，将盖子的背面放在支架尖端上。用镊子放置剩余的螺丝，然后以迭代方式拧紧两个螺丝。
小心拧紧，直到它们遇到阻力。如果拧紧力过强，窗户很容易破裂。开始以每分钟 4 微升的速度流过系统，并检查支架尖端是否有泄漏。
然后，将支架带到真空泵站并进行泄漏检查。确保在 5 分钟内压力至少达到 10 到负 5 mbar。将支架放入其外壳中。
并将支架带到电子显微镜上。在 STEM 模式下设置显微镜。用涂有金纳米颗粒的薄碳膜作为不含水的参考样品测量电子束的电流密度。
以每分钟不超过 2 微升的速度启动纯水流出。将液流 TEM 支架插入真空负载锁并开始排空。确保压力正常降低。
然后将 TEM 支架完全插入显微镜。压力足够低后，打开光束阀并插入 ADF 检测器。将显微镜设置为连续采集模式，并沿 X 和 Y 方向平移样品台以找到 SiN 窗口。
调整对比度和亮度，使窗口的边缘清晰可见。沿 X 和 Y 方向平移舞台，使窗口的一角位于视野的中心。然后重置物镜。
调整样品台的垂直位置以粗略聚焦角落。将载物台来回倾斜 5 度，以检查样品是否处于全心高度。将窗口角置于视野中的中心，然后将载物台位置存储在软件中。
沿 X 和 Y 方向平移载物台，直到可以看到金纳米颗粒。然后聚焦物镜。记下电流密度并计算液体单元厚度。
沿 X 和 Y 方向平移载物台，以定位具有至少 20 个金纳米颗粒的区域。设置参数并获取图像。我们将金纳米颗粒固定在氮化硅膜上，并使用液相 STEM 进行成像。
在纯水中，金纳米颗粒在整个成像过程中保持其形状。水中的辐射分解产物可以氧化单个金原子，最终会改变纳米颗粒的形状。在另一个实验中，我们被引入液相中的氯离子。
随着氧化的金原子形成可溶性四氯金，金纳米颗粒在实验中缓慢溶解。为了研究金纳米颗粒在水中的运动，在随后的实验中，纳米颗粒没有完全固定在样品膜上。金纳米颗粒团聚，在达到临界簇大小时，移出视野。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。需要几周的培训。在尝试此程序时，重要的是要记住冷静地工作并检查真空密封性和液体厚度。
开发后，这项技术为材料科学、化学和生物学的研究人员探索纳米颗粒在液体中的生长和运动、纳米级材料在液体环境中的结构以及哺乳动物细胞中蛋白质的功能铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何对嵌入水层中的金纳米颗粒进行扫描透射电子显微镜，包括正确加载样品架和调整显微镜。不要忘记，如果样品架未正确加载，在电子显微镜中处理液体可能会造成损坏。
因此，在装载前检查真空泄漏非常重要。
概述
本协议描述了用于扫描透射电子显微镜观察水中AuNPs的液体流动样品持架的操作，便于观察纳米尺度动态过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 扫描透射电子显微镜
- 纳米材料
- 液相成像
背景
- 液相扫描透射电子显微镜允许在液体环境中观察纳米材料。
- 该技术提供了关于样品的纳米尺度形态信息。
- 它特别适用于在自然液体状态下研究生物样品。
- 新用户可能会发现样品加载和图像获取具有挑战性。
研究目的
- 观察生物样品中纳米材料的结构和现象。
- 研究纳米材料在液体中的行为。
- 增强对纳米尺度动态过程的理解。
使用的方法
- 清洁和准备SiN微芯片用于样品加载。
- 将金纳米粒子溶液应用于微芯片。
- 使用液体流动TEM持架进行成像。
- 进行泄漏检查并确保微芯片正确对齐。
主要结果
- 该协议成功展示了在液体环境中AuNPs的制备和成像。
- 它概述了确保过程中样品完整性的步骤。
- 结果表明液体流动持架在捕捉动态过程方面的有效性。
结论
- 该方法为纳米材料在液体中的行为提供了宝贵的见解。
- 它增强了电子显微镜研究生物样品的能力。
- 未来的应用可能扩展到材料科学的各个领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Liquid phase scanning transmission electron microscopy enables direct observation of nanomaterial behavior in physiologically relevant liquid environments, supporting target validation through mechanistic de-risking of nanoparticle-biological interactions. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by capturing dynamic processes such as agglomeration, dissolution, and cellular uptake under controlled fluid conditions. The method addresses a critical gap in nanomedicine development by providing nanoscale resolution in hydrated states, reducing reliance on inferential assays and improving go/no-go decisions in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing nanomaterial structural changes in liquid, clarifying mechanisms of action and degradation pathways.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of nanoparticle interactions with biological components in near-native conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying unstable or reactive nanomaterials early, reducing late-stage failure risk due to unforeseen liquid-phase behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming nanomaterial stability and dispersion in liquid media prior to high-content screening.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of particle size, shape, and concentration changes over time, providing reproducible metrics for assay standardization.
- Platform Reuse: Facilitates screening readiness and scalability through standardized microfluidic chip preparation and leak-tight holder assembly, supporting repeated use across compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining nanomaterials in liquid environments that mimic physiological conditions, improving relevance of efficacy and toxicity readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying dynamic processes such as ion-induced dissolution or agglomeration, which directly impact bioavailability and safety profiles.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking when primarily mechanistic, clarifying whether observed effects stem from the nanomaterial itself or liquid-phase transformation products.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and translational continuity when nanomaterials are evaluated in liquid environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct visualization of nanomaterial behavior in liquid, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible liquid cell formation and nanoparticle immobilization, ensuring consistent starting conditions for compound evaluation.
- Analytics: Highlights liquid thickness measurement and nanoparticle tracking as key readouts that help teams compare stability across formulations or environmental conditions.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity by maintaining nanomaterials in hydrated states that reflect in vivo exposure, supporting biomarker alignment when dissolution products or agglomerates correlate with biological response.
- Enterprise Reuse:Frames the method as a reusable capability through standardized microfluidic chip preparation, holder assembly, and leak testing protocols, enabling consistent application across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nanomaterial-biological interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of liquid cell preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying unstable nanomaterials early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of liquid-phase stability and transformation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, vacuum systems, and electron microscopy to ensure proper specimen holder assembly and leak testing.
- Depends on instrumentation including plasma cleaners, liquid flow TEM holders, and STEM-capable microscopes with environmental holders.
- Necessitates cross-team standardization of chip cleaning, spacer use, and flow rate protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from water-based to complex biological media, including viscosity effects and potential membrane fouling.
- Includes practical limitations such as beam-induced radiolysis effects on liquid chemistry and the need for vacuum compatibility, which may restrict certain volatile or reactive formulations.
