使用扫描透射电子显微镜研究液体中纳米级物体的动态过程

液相扫描透射电子显微镜的总体目标是观察完全嵌入厚度达数微米液层中的生物样品内纳米材料的结构与现象。该方法有助于回答材料科学领域中的关键问题，例如纳米材料在液体中的行为以及生物样品在天然液体环境中的研究。该技术的主要优势在于能够提供液态环境下样品的纳米级形貌信息。

通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为样品台的装载和图像采集并不像最初使用电子显微镜时那样简单。开始操作前，在洁净的超净工作台中，使用无纤维擦拭纸和纯乙醇清洁光学显微镜玻片。将玻片放置于培养皿内的洁净室擦拭纸上，并盖上培养皿盖子。

使用碳涂层镊子操作氮化硅微芯片时，应牢固但小心地夹住微芯片的长边，始终确保氮化硅膜朝上。采用此方法，将五个无间隔层的微芯片和五个带有200纳米间隔层的微芯片放置在玻璃载片上。盖上培养皿，并将微芯片转移至通风橱中。

将微芯片膜面朝上放入盛有HPLC级丙酮的烧杯中。轻轻摇晃烧杯两分钟，以去除保护涂层，注意避免微芯片翻转。随后，迅速将微芯片转移至盛有纯乙醇的烧杯中。

用铝箔覆盖烧杯。轻轻摇晃烧杯两分钟，以彻底去除涂层，然后将其放入密闭的培养皿中，并移至超净工作台。将微芯片放置在一张洁净室专用纸巾上，注意在镊子松开时不要翻转微芯片。

让微芯片干燥几分钟，然后将微芯片放置在培养皿中的载玻片上。盖上培养皿，将微芯片送至等离子清洗仪。

将玻璃载玻片和微芯片放入等离子清洗机中，运行五分钟清洗程序，以去除氮化硅膜上的碳氢化合物。使用光学显微镜检查微芯片是否存在膜破裂或颗粒污染物。丢弃破损或污染的微芯片。

在层流罩中，将微芯片固定于内表面具有黏性的洁净转运盒内。在无间隔垫片的各微芯片氮化硅膜上，加入1微升3摩尔柠檬酸盐稳定的水相金纳米颗粒溶液，并使其自然干燥。随后，在膜上加入1微升去离子水，以洗去盐分和表面活性剂。

30 秒后，使用滤纸小心吸去水分，并让微芯片自然干燥。将液体流动透射电镜样品台的尖端置于双目光学显微镜下。取下样品台尖端的钛盖，并将其放置在一张铝箔上。

使用一个装有0.5毫升HPLC级水的一毫升玻璃注射器，设置微流控注射泵。将注射器连接至流动系统并启动泵。当水冲洗系统时，检查管路是否存在泄漏或流动受阻情况。

当抽吸完成后，从液体池腔室中移除清洗液，并用滤纸擦干样品杆尖端。使用光学显微镜检查样品杆尖端。用洁净室专用纸巾擦干尖端，并使用洁净的聚四氟乙烯（PTFE）涂层镊子去除灰尘或纤维。

检查持样器尖端盖、O型圈和螺丝，使用聚四氟乙烯涂层镊子去除灰尘或纤维。将O型圈放入持样器组件中。安装第一颗螺丝并旋转数次，使其刚好固定。

使用洁净的弧形镊子将样品微芯片放置在夹持器尖端的凹槽中，确保氮化硅（SiN）薄膜朝上。利用双目光学显微镜检查微芯片是否正确就位。在样品微芯片上滴加0.3 µL纯过滤水。

用镊子固定微芯片的位置。然后，用倒持的弯头镊子夹起一个间隔微芯片。小心旋转镊子，使微芯片的膜面朝下。

将间隔微芯片放置在样品微芯片上。在夹持器尖端下方放置反光材料，并在双目光学显微镜下检查微芯片的对准情况。如果氮化硅窗口未对准，使用镊子小心调整微芯片。

然后用镊子夹起样品室盖。将盖子倒置，不要触碰微芯片，将盖子的背面放在支架尖端上。用镊子放置剩下的螺丝，并以交替方式拧紧两颗螺丝。

小心拧紧，直至遇到阻力为止。若拧得过紧，窗口容易破裂。启动每分钟四微升的液体流速，通过系统检查持样器尖端是否泄漏。

然后，将样品台移至真空泵站并进行漏气检查。确保在五分钟内压力至少达到10的负5次方毫巴。将样品台放入其外壳中。

将样品台移至电子显微镜中。将显微镜设置为STEM模式。使用镀有金纳米颗粒的超薄碳膜作为无水参考样品，测量电子束的电流密度。

以不超过每分钟2 µL的流速开始通入纯水。将液体流动TEM样品台插入真空装载锁，并开始抽真空。确保压力正常下降。

然后将透射电镜样品杆完全插入显微镜中。当真空度足够低时，打开电子束阀门并插入ADF探测器。将显微镜设置为连续采集模式，并在X和Y方向上移动样品台，以找到SiN窗口。

调节对比度和亮度，使窗口的边缘清晰可见。在 X 和 Y 方向上移动载物台，使窗口的一个角位于视野中心。然后重置物镜。

调整样品台的垂直位置，以粗略聚焦角落。将样品台前后倾斜五度，检查样品是否处于齐焦高度。将视场中的窗口角落居中，然后在软件中保存样品台位置。

在 X 和 Y 方向上移动载物台，直至观察到金纳米颗粒。然后调节物镜焦距。记录当前电流密度，并计算液体池厚度。

在 X 和 Y 方向上移动载物台，找到至少含有 20 个金纳米颗粒的区域。设置参数并采集图像。金纳米颗粒被固定在氮化硅膜上，并通过液相扫描透射电子显微镜（STEM）成像。

在纯水中，金纳米颗粒在整个成像过程中保持其形状。水的辐射分解产物可能氧化单个金原子，最终导致纳米颗粒形状的改变。在另一项实验中，将氯离子引入液相中。

在实验过程中，氧化的金原子形成了可溶性的四氯金酸盐，导致金纳米颗粒逐渐溶解。为了研究金纳米颗粒在水中的运动行为，在后续实验中，纳米颗粒未被完全固定在样品膜上。金纳米颗粒发生团聚，当达到临界团簇尺寸时，便移出了视野范围。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。但需要数周的培训。在尝试该操作过程中，重要的是要保持冷静，并注意检查真空密封性和液体厚度。

该技术问世后，为材料科学、化学和生物学领域的研究人员探索液相中纳米颗粒的生长与运动、液相环境下纳米材料的结构以及哺乳动物细胞中蛋白质的功能开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对嵌入水层中的金纳米颗粒进行扫描透射电子显微镜观察，包括正确装载样品杆和调节显微镜的操作方法。请务必注意，若样品杆装载不当，在电子显微镜中使用液体样品可能导致设备损坏。

因此，在加载前检查真空泄漏非常重要。