伤口的牙髓评价一个直接盖髓模型的开发和治疗小鼠中修复性牙本质形成
2017年1月12日
我们描述了执行直接纸浆对小鼠齿封盖为牙髓创伤愈合和体内修复象牙质形成的所述评估的步骤的分步方法。
该协议的总体目标是在小鼠中提出直接的牙髓加帽程序。这种方法可以帮助您回答牙髓生物学中的关键问题，例如，当您将捕获的牙髓覆盖材料放在暴露的牙髓上时，牙髓如何愈合或修复牙本质如何形成。该技术的主要优点是，在人类中进行的实际直接牙髓加帽程序也可以在小鼠中以完全相同的方式进行。
这项技术的影响延伸到改善材料性能以挽救牙齿，否则这些牙齿注定需要更具侵入性的治疗，例如根管治疗。在为手术对鼠标进行适当麻醉后，将嘴托放在嘴里，并将另一端固定在桌子上，使头部朝上。使用良好的照明和立体镜，观察第一上颌磨牙。
然后，以 200， 000 rpm 的速度在高速手机中使用四分之一圆车针，去除牙齿牙釉质的中央区域，直到通过透明牙本质看到牙髓。小心不要渗入果肉。接下来，使用 no.
15 牙髓 K 型锉，穿过牙本质穿孔并露出牙髓。不要将任何碎屑推入果肉中;这可以通过每季度轮换一次 K 文件，然后将 K 文件拉出来避免。现在，准备 MTA，并使用浏览器投递 MTA，然后使用纸点的背面轻轻敲击将其打包到曝光区域。
接下来，使用装有 35% 磷酸蚀刻剂的注射器，用蚀刻剂覆盖牙齿，避开牙龈组织，让蚀刻剂工作 15 秒。15 秒后，将蚀刻剂从牙齿上吸出，并使用水湿润的棉签擦去任何残留的蚀刻剂。吸吮并擦拭，直到去除所有蚀刻剂。
然后使用纸尖的背面涂抹牙科粘合剂。用压缩空气吹几秒钟，使胶粘剂层变薄。然后在适当的光线下固化胶粘剂 30 秒。
现在，使用导向器的尖端将少量复合材料涂在牙齿上，使复合材料流入齿槽中。应用后，将复合材料固化 30 秒。对小鼠实施安乐死并去除整个上颌骨后，将下巴放入 pH 值为 7.4 的 PBS 中的 4% 多聚甲醛中。
将组织在 4 摄氏度下保存过夜，第二天早上将其转移到 70% 乙醇中储存，直到可以处理。要对上颌骨进行显微 CT 扫描，首先将其固定在浸泡有 70% 乙醇的纱布中，然后将其装入 15 毫升细胞培养管中。然后将管子安装到显微 CT 扫描台上。
接下来，将 X 射线源设置为在 200 毫秒内提供 145 微安的电流和 55 的峰值千伏。使用 0.5 毫米铝制滤光片，以 20 微米的分辨率采集图像。扫描完成后，在 pH 值为 7.4 的 PBS 中开始用 5% EDTA 和 4% 蔗糖对上颌骨脱钙。
让这个反应在 4 摄氏度下持续两周。包埋上颌骨后，制作 5 微米厚的切片。牙髓覆盖区域通常与远端腭根重合，可以用作地标。
通过在光学显微镜下检查组织学，并将结果与显微 CT 扫描进行比较，确定精确的感兴趣区域。对于 H&E 染色，去除石蜡，并在载玻片中用两个二甲苯浴重新水化，每次几分钟。然后将它们通过一系列连续稀释的乙醇。
每次沐浴只需 1 分钟。再水化后冲洗干净。然后涂抹血毒素溶液两分半钟。
冲洗去除染料，然后将玻片放入 95% 乙醇中 1 分钟。接下来，用伊红溶液对玻片染色 1 分钟，然后冲洗干净。从乙醇开始，反转水合步骤以使染色组织脱水。
然后，用二甲苯处理它们。然后可以对载玻片进行安装和成像。使用所描述的程序，对 8 周龄小鼠进行牙髓加帽。
六周后，他们的上颌骨被采集并检查。奇怪的是，H&E 染色显示整个牙髓腔和根管中牙本质形成。相比之下，未加帽的磨牙没有表现出相同的牙本质形成。
在加帽磨牙中，存在牙本质样和骨样形成的特征，因为在修复牙本质中发现了牙本质小管和骨细胞，这表明受伤的牙髓可能被驻留的成牙细胞和迁移的成骨细胞矿化。DMP1 免疫组织化学染色的使用进一步证实了形成修复牙本质的细胞活性增加。就像真正的牙科临床实践一样，有一个助手非常有帮助。
例如，有了助手，一旦掌握了这项技术，只需十分钟即可完成。重要的是，当您暴露牙髓时，请记住使用 endofile，而不是 bur。当你递给 MTA 时，要小心。
不要忘记，使用多聚甲醛等固定剂可能非常危险。应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。
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概述
本文介绍了一种在小鼠牙齿上进行直接髓冠修复的详细协议，旨在研究髓组织伤口愈合和修复性牙本质的形成。该方法使研究人员能够研究髓组织生物学的关键方面，包括愈合过程和材料相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 牙科学
- 神经科学
- 再生医学
背景
- 直接髓冠修复是一种旨在保存髓活力的牙科程序。
- 这种技术可应用于人类和小鼠模型。
- 了解髓愈合可以导致改进的牙科治疗。
- 该研究关注髓对封顶材料的反应。
研究目的
- 评估直接封顶后髓的愈合过程。
- 评估封顶材料引起的修复性牙本质的形成。
- 为体内研究髓生物学提供可靠的方法。
使用的方法
- 小鼠麻醉和手术位置准备。
- 使用固定器稳定小鼠以便进行手术。
- 在暴露的髓上应用髓封顶材料。
- 使用立体显微镜观察第一恒磨牙。
主要结果
- 该协议允许在小鼠中一致地进行髓封顶。
- 它提供了关于牙髓愈合能力的见解。
- 可以有效监测修复性牙本质的形成。
- 该技术对改进牙科材料具有意义。
结论
- 这种方法是研究髓生物学的有价值工具。
- 它弥合了人类和动物牙科手术之间的差距。
- 未来的研究可以改善材料特性以获得更好的牙科结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic investigation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in a murine model, supporting target validation in regenerative dentistry. By allowing use of transgenic and knockout mice, it facilitates preclinical screening of biocompatible materials and de-risks translational pathways for pulp-protective therapeutics. The model addresses a key gap in dental R&D by providing an in vivo system to evaluate molecular mechanisms underlying dentin regeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular and molecular pathways involved in pulp healing and dentinogenesis.
- Operational Value: Supports functional validation of targets using genetic models to assess causal roles in reparative dentin formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized in vivo assay to evaluate biocompatibility and inductive potential of pulp-capping materials.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of dentin formation via micro-CT and histology for material screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges ex vivo findings to physiological relevance by modeling human pulp-capping outcomes in mice.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of lead materials for pulp vitality preservation and dentin repair.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing in regenerative dentistry.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on signaling pathways regulating odontoblast and osteoblast recruitment during pulp repair.
- Screening: Enables standardized evaluation of material-induced reparative dentin formation as a functional readout.
- Analytics: Generates quantitative micro-CT and histological outputs to compare material efficacy and healing kinetics.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation of pulp-capping agents prior to IND-enabling studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative material optimization and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in material performance by capturing complex tissue-level healing responses.
- Operational Value: Delivers a reproducible, standardized procedure for cross-laboratory material comparison.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in pulp-regenerative approaches.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of pulp therapeutics based on in vivo dentin regeneration evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dental procedures, anesthesia, and microsurgical techniques.
- Dependent on access to high-speed handpieces, stereoscopes, micro-CT, and histological processing equipment.
- Necessitates standardization across operators to ensure consistent pulp exposure and material placement.
- Adaptation considerations include variations in mouse strain, age, and pulp-capping material viscosity.
- Practical limitations include technical difficulty due to small murine tooth size and potential variability in healing responses.
