Name: 伤口的牙髓评价一个直接盖髓模型的开发和治疗小鼠中修复性牙本质形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学习小鼠直接盖髓术以研究牙髓伤口愈合和修复性牙本质形成。该方法使用MTA材料和复合树脂，通过显微CT和组织学分析评估牙髓生物学反应，为改进牙科材料提供可靠的体内研究模型。

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本研究由美国国立牙科与颅面研究所/国立卫生研究院资助项目R01DE023348（RHK）以及加州大学洛杉矶分校学术参议院研究委员会教员研究资助项目（RHK）支持。

小鼠购自杰克逊实验室，并饲养于加州大学洛杉矶分校实验动物医学部（DLAM）的无病原体动物房。实验操作均依照校长动物研究委员会批准的机构指南进行。&#160;（ARC#2016-037）
1. 小鼠麻醉
<ol>
	<li>使用8周龄雌性C57/BL6小鼠（n = 3）。</li>
	<li>使用氯胺酮（80–120 mg/kg小鼠体重）/赛拉嗪（5 mg/kg小鼠体重）溶液对小鼠进行麻醉，并以10 mL/kg剂量腹腔注射（ip）给药。</li>
	<li>配制氯胺酮（80–120 mg/kg）/赛拉嗪（5 mg/kg）溶液，并以10 mL/kg剂量腹腔注射（ip）给药。</li>
	<li>通过脚趾夹捏实验确认小鼠已完全麻醉。</li>
</ol>
2. 盖髓术操作步骤
<ol>
	<li>将口撑器放入小鼠口中。</li>
	<li>将口撑器固定在桌面上，使小鼠头部朝上。</li>
	<li>将显微镜（10倍）置于口腔上方，使上颌第一磨牙完全可见。</li>
	<li>使用高速手机上的¼圆钻针，以200,000 rpm转速，从中部去除牙釉质部分，直至通过透明的牙本质可见牙髓，但不得用钻针暴露牙髓。</li>
	<li>使用#15根管K锉（直径150 µm），穿透牙本质并暴露牙髓。 
	注意：操作时需格外小心，避免牙本质碎屑被推入牙髓腔。可通过每四分之一圈旋转K锉后将其退出的方式避免此问题。</li>
	<li>按照制造商说明，将MTA与无菌H2O混合。用探针尖端将MTA输送并放置于暴露的牙髓上。使用纸尖（细型）的背面，通过轻敲方式将MTA压实至暴露的牙髓中。纸尖较厚的一侧为平面，有助于将MTA适当压实于暴露的牙髓处。</li>
	<li>将35%磷酸酸蚀剂涂布于牙齿表面，酸蚀15秒，用量以刚好覆盖牙齿为宜。需特别注意控制酸蚀剂的范围，以免刺激牙龈组织。 
	注意：酸蚀剂以注射器形式提供，用于粗糙化牙面，使牙科粘接剂能够渗入并实现与牙齿的微机械结合。由于其具有粘性，可通过直接在牙面施加少量实现局部控制。</li>
	<li>使用负压吸引装置清除酸蚀剂。用少量浸湿H2O的棉球轻轻擦拭残留酸蚀剂。重复此步骤，直至牙齿表面完全清除酸蚀剂。</li>
	<li>使用压缩空气吹气器，轻柔吹干牙齿表面。</li>
	<li>用纸尖的背面将牙科粘接剂涂布于牙齿表面。</li>
	<li>用压缩空气吹3秒，使粘接剂形成薄层。</li>
	<li>使用光固化仪照射20秒，固化牙科粘接剂。</li>
	<li>将流动性复合树脂少量分次置于已用MTA覆盖的牙齿上。用探针尖端将复合树脂导入牙齿沟隙中。</li>
	<li>使用光固化仪照射30秒，使复合树脂聚合固化。用探针确认复合树脂已完全固化且坚硬。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>在牙髓盖髓手术后立即皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）。</li>
	<li>将小鼠置于低功率加热垫上，以保持动物在苏醒前体温。</li>
	<li>将小鼠送回动物房进行饲养。</li>
</ol>
4. 组织获取
<ol>
	<li>5 - 6 周后，在异氟烷完全麻醉条件下，通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>小心地将上颌骨从颅底取出，并放入 50 mL 离心管中。将包含牙髓切断牙及对侧未处理牙的完整上颌骨置于含 4% 多聚甲醛的 PBS（pH 7.4）溶液中，于 4 °C 固定过夜，随后转移至 70% 乙醇溶液中保存。 
	注意：多聚甲醛具有毒性和致癌性，其使用应遵循标准操作程序（SOP）中的相关规定。</li>
	<li>使用 µCT 扫描仪对小鼠上颌骨进行扫描。为确保扫描过程中样本固定，应用浸有 70% 乙醇的纱布包裹样本，并将其置于 15 mL 细胞培养管中。</li>
</ol>
5. µCT 扫描
<ol>
	<li>准备样品以进行微计算机断层扫描（µCT）。简而言之，用浸有70%乙醇的纱布包裹样品，并将其固定于标准的15 mL细胞培养锥形管中。根据制造商说明书，将该管安装到µCT扫描仪的样品台上。</li>
	<li>将X射线源设置为电流145 µA、电压55 kVp、曝光时间200 ms。</li>
	<li>使用µCT扫描仪以20 µm分辨率和0.5 mm铝滤片进行图像采集。</li>
	<li>重建图像并进行可视化11。</li>
	<li>µCT扫描完成后，使用含5% EDTA和4%蔗糖的PBS（pH 7.4）开始脱钙，持续2周。</li>
</ol>
6. 组织处理与染色
<ol>
	<li>将脱钙组织包埋于石蜡中。包埋前，于第一磨牙前方立即进行矢状切面切割，修整上颌骨。包埋时，将此切面朝下放置，使第一磨牙的纵切面成为切片表面。</li>
	<li>使用切片机制备厚度为 5 µm 的切片。牙髓盖髓区域通常与远中腭侧（DP）根一致，可作为解剖标志。通过光学显微镜观察组织学切片并结合 µCT 图像，确定确切的兴趣区域。</li>
	<li>进行 H&amp;#38;E 染色时，使用二甲苯（2 次）及梯度稀释的乙醇（100% 乙醇 2 次、95% 乙醇 2 次、70% 乙醇 1 次）对切片进行脱蜡和水化处理。</li>
	<li>用流动的自来水冲洗切片。</li>
	<li>用苏木精溶液染色 2.5 分钟，随后用自来水冲洗。</li>
	<li>将切片浸入 95% 乙醇中 1 分钟。</li>
	<li>用伊红溶液染色 1 分钟，随后用自来水冲洗。</li>
	<li>使用梯度稀释的乙醇（70% 乙醇 1 次、95% 乙醇 2 次、100% 乙醇 3 次）和二甲苯（3 次）进行脱水处理。</li>
	<li>用封片剂封片。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前，已有多种不同的实验模型可用于验证牙科材料、支架或生长因子对牙髓干细胞（DPSCs）成牙本质向分化in vivo 效应13。这些模型包括将DPSCs异位自体移植至器官（如肾包膜）中，或将DPSCs与支架材料一起皮下移植至免疫缺陷小鼠体内14,15。然而，这些方法的局限性在于，其对DPSCs的成牙本质作用并非发生在原位牙髓环境中。另一方面，原位牙髓内移植或牙齿的活髓保存术则常用于较大的动物模型16,17。尽管这些模型在评估原位环境中的成牙本质潜能方面具有重要价值，但其应用主要局限于观察性研究，对于牙髓伤口愈合及修复性牙本质形成的机制性认识仍十分有限。
本文介绍了一种在小鼠中进行牙髓盖髓的详细方法。该逐步操作流程包括对小鼠进行麻醉、制备类Ⅰ型窝洞、放置盖髓材料、采集上颌骨、进行µCT扫描分析，以及评估组织样本中的修复性牙本质形成情况。我们的小鼠盖髓模型将有助于在修复性牙本质形成的背景下，利用转基因或基因敲除小鼠（在科研领域广泛可得）研究牙髓伤口愈合的基本分子机制体内过程。
...

龋齿是最常见的口腔疾病之一，也是几乎所有个体牙齿接受外科干预的首要原因1,2。牙齿外科治疗和修复的预后在很大程度上取决于牙髓的正常反应以及创面愈合的成功与否。事实上，深入穿透釉质和牙本质的龋齿常导致下方牙髓组织暴露，通常需使用牙科材料进行“盖髓”，例如氢氧化钙（Ca(OH)2）或水硬性硅酸钙水泥（HCSCs），后者包括矿物三氧化物凝聚体（MTA）。此类盖髓操作的最终目标是通过再生修复性牙本质——一种作为“生物封闭层”的物理屏障——来加速牙髓创面愈合，从而保护下方的牙髓组织，延长牙齿寿命并改善整体口腔健康。然而，牙髓创面愈合及修复性牙本质形成的潜在机制尚未完全阐明。
为了更好地理解牙髓伤口愈合及修复性牙本质形成的机制 体内曾使用过多种动物，包括猴子、狗和猪3-5其中，大鼠因体型相较于其他动物较小，但其牙齿足够大，便于进行直接盖髓术，且无技术上的困难，故常被选用。6-10这些动物模型是研究牙髓反应和修复性牙本质形成的理想替代方案。然而，它们的应用局限于细胞水平的观察性研究，极少能提供修复性牙本质形成过程中分子层面的机制性见解。
近年来，基因工程领域的技术进步提供了宝贵且不可或缺的研究工具——携带基因过表达或基因敲除的小鼠模型，这些工具对于在活体条件下研究人类疾病的分子机制至关重要。in vivo。在科学界，可诱导且具有细胞特异性表达策略的转基因小鼠或基因敲除小鼠品系数量正在持续增加。因此，在这些小鼠模型中研究牙髓伤口愈合及修复性牙本质再生过程，将极大促进我们从分子层面深入理解这些生物学过程。然而，由于小鼠牙齿体积微小，对其进行牙髓盖髓操作在技术上极具挑战性，这在很大程度上限制了小鼠模型的应用。本文中，我们介绍了一种可重复的小鼠直接盖髓操作方法，用于在活体条件下评估牙髓伤口愈合及修复性牙本质的形成。in vivo。

<table><tbody><tr><td>BM-LED 体视显微镜</td><td>MEIJI Techno</td><td></td><td>显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Optima MCX-LED&amp;nbsp;</td><td>Bien Air Dental</td><td>1700588-001</td><td>电动马达引擎</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein 动物健康公司</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td></td></tr><tr><td>1/4 圆形车针</td><td>Brasseler</td><td>001092T0</td><td></td></tr><tr><td>根管K锉</td><td>Roydent</td><td>98947</td><td></td></tr><tr><td>ProRoot MTA</td><td>Dentsply</td><td>PROROOT5W</td><td>MTA</td></tr><tr><td>吸纸尖</td><td>Henry Schein</td><td>100-3941</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Etch</td><td>Ultradent 产品公司</td><td></td><td>磷酸酸蚀剂</td></tr><tr><td>OptiBond SoloPlus</td><td>Kerr</td><td>29669</td><td>粘接剂</td></tr><tr><td>Coltolux LED</td><td>Coltene/Whaledent 公司</td><td>C7970100115</td><td>光固化灯装置</td></tr><tr><td>显色染料</td><td>Bisco</td><td>T-14012</td><td>可流动复合树脂</td></tr><tr><td>Skyscan</td><td>Breuker</td><td>1275</td><td>微计算机断层扫描仪（uCT scanner）</td></tr><tr><td>Microm</td><td>Thermo</td><td>HM355S</td><td>切片机</td></tr><tr><td>苏木精-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>7221</td><td></td></tr><tr><td>伊红-Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-16</td><td>封片液</td></tr></tbody></table>

小鼠牙髓直接盖髓模型的建立及其在牙髓创面愈合与修复性牙本质形成评价中的应用

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

牙髓是由釉质和牙本质完全保护的牙齿 vital 器官。当牙髓因龋源性或医源性损伤而暴露时，通常会使用生物相容性材料进行盖髓，以促进牙髓创面愈合。其最终目标是再生修复性牙本质——一种作为“生物封闭”屏障的结构，保护下方的牙髓组织。尽管直接盖髓术已在牙科临床长期应用，但牙髓创面愈合及修复性牙本质形成的分子机制仍不甚清楚。为诱导修复性牙本质形成，已有研究在大型动物中进行实验性盖髓操作，但在小鼠中开展较少，可能与其体型较小及随之而来的技术难度有关。本文介绍了一种在小鼠中实施盖髓术的详细分步方法，包括制备类Ⅰ类洞、放置盖髓材料以及使用牙科复合树脂进行修复的操作流程。本研究所建立的小鼠盖髓模型将有助于深入探究修复性牙本质形成背景下牙髓创面愈合的基本分子机制

关键词：牙髓，盖髓术，修复性牙本质，创面愈合，小鼠模型，牙科材料，牙体修复 体内 通过利用研究领域广泛可得的转基因或基因敲除小鼠。

本文展示了在小鼠牙齿上进行活髓保存治疗的逐步操作流程。小鼠活髓保存的关键之一是具备合适的设备。为此，使用放大倍数为10倍的显微镜至关重要（图1A）。为了在牙齿上制备类似I类洞的结构，我们采用电动高速手机以200,000 rpm的转速配合¼圆形车针进行操作（图1B）。此外，也可使用其他类型的手机，包括气动手机，来完成牙体预备。
在图2A-2E中，展示了进行活髓切断术的代表性步骤。首先进行类I类洞型预备（图2B）。由于使用水喷雾可能在操作过程中导致小鼠窒息，因此不建议使用。为此，必须采用轻柔且间断的磨牙手法预备牙齿，以防止产热过多。同时建议使用压缩空气以达到冷却效果。在使用根管锉暴露牙髓时，需注意避免将牙本质碎屑推入牙髓腔内，否则可能干扰修复性牙本质形成的数据解读（图2C）。此问题可通过使...

我们介绍了一种在小鼠牙齿上进行直接盖髓的逐步操作方法，用于评估牙髓伤口愈合及修复性牙本质的形成。 体内.

牙髓是由釉质和牙本质完全保护的牙齿 vital 器官。当牙髓因龋源性或医源性损伤而暴露时，它会……

本方案的总体目标是展示在小鼠中进行直接盖髓术的操作过程。该方法有助于回答牙髓生物学中的关键问题，例如，当将盖髓材料置于暴露的牙髓表面时，牙髓如何愈合，或修复性牙本质如何形成。该技术的主要优势在于，临床上用于人类的直接盖髓术可完全以相同的方式在小鼠中实施。该技术的应用意义在于改善材料性能，从而挽救那些原本需要接受更侵入性治疗（如根管治疗）的牙齿。在对小鼠进行适当麻醉后，将其口腔固定器置入其口腔内，并将另一端固定于实验台上，使头部朝上。在良好照明条件下，使用体视显微镜观察上颌第一磨牙。然后，使用高速手机以 200,000 rpm 的转速配合四分之一圆钻针，去除牙齿釉质的中央区域，直至通过透明的牙本质可见牙髓。注意不要穿透进入牙髓。接下来，使用编号使用15号根管K锉，穿透牙本质并暴露牙髓。切勿将任何碎屑推入牙髓腔内；可通过每四分之一圈旋转K锉后即刻将其退出的方式来避免此问题。现在，制备MTA材料，使用探针将MTA输送至暴露区域，然后用纸尖的背面轻轻敲打，将MTA压实至暴露部位。接下来，使用装有35%磷酸酸蚀剂的注射器将酸蚀剂涂布于牙面，注意避免接触牙龈组织，酸蚀15秒。15秒后，用吸唾器吸除牙面的酸蚀剂，并用蘸水的棉签擦拭去除任何残留的酸蚀剂。反复吸除和擦拭，直至彻底清除所有酸蚀剂。使用纸尖的背面涂抹牙科粘接剂。用压缩空气吹数秒钟，使粘接剂形成薄层。然后用适当的光源照射30秒，使粘接剂固化。现在，使用探针的尖端将少量复合树脂涂布于牙齿表面，使复合树脂流入牙齿的窝沟内。涂布完成后，光照固化30秒。在处死小鼠并取出整个上颌后，将颌骨置于pH 7.4的PBS中含4%多聚甲醛的溶液中固定。将组织在 4 摄氏度下保存过夜，次日早晨转移至 70% 乙醇中储存，直至进行后续处理。为获取上颌骨的显微 CT 扫描图像，首先将其固定于浸有 70% 乙醇的纱布中，然后装入 15 毫升细胞培养管内。随后将该管置于显微 CT 扫描仪的样品台上。 接下来，将X射线源设置为以55千伏峰值和145微安电流照射200毫秒。使用0.5毫米铝滤膜，以20微米分辨率采集图像。扫描完成后，用含5% EDTA和4%蔗糖的PBS溶液（pH 7.4）开始对上颌骨进行脱钙处理。将此反应在 4 摄氏度下持续进行两周。在包埋上颌骨后，切取 5 µm 厚的切片。牙髓盖髓区域通常与远中腭侧根重合，可作为解剖标志。通过光学显微镜观察组织学切片，并将其结果与微计算机断层扫描（micro CT）图像进行比较，以确定精确的目标区域。对于苏木精-伊红（H&E）染色，先用二甲苯浸泡两次，每次数分钟，以去除石蜡，随后将切片依次通过梯度稀释的乙醇进行再水化处理。每种染色液应作用一分钟。复水后进行冲洗，然后加入苏木精染色液作用两分半钟。用冲洗液洗去染料，然后将切片放入95%乙醇中一分钟。接着用伊红溶液染色一分钟，再冲洗干净。从乙醇开始，逆

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

伤口的牙髓评价一个直接盖髓模型的开发和治疗小鼠中修复性牙本质形成

一种可用于在生理和病理生理条件下评估治疗化合物的皮肤伤口愈合小鼠模型。...

小鼠伤口愈合模型

本文介绍了一种在小鼠中局部诱导根尖周炎的实验方案。我们展示了如何在小鼠牙齿上钻孔并暴露其牙髓，以引发局部炎症。同时演示了用于研究该炎症性质的分析方法，如显微CT和组织学分析。...

在小鼠中诱导根尖周炎

本文介绍了两种小鼠伤口愈合模型，一种用于评估细胞和细胞因子介导的伤口愈合反应，另一种用于量化伤口闭合速率。这些方法可与糖尿病等复杂疾病模型联合使用，以探究伤口愈合不良各个方面的潜在机制。...

使用背部皮下聚乙烯醇海绵植入和尾部皮肤切除伤口模型评估急性伤口愈合

我们描述了牙髓（DP）原代细胞的分离、分散和接种，并在上层的transwell小室滤膜上共培养三叉神经节（TG）神经元。可通过免疫荧光或RNA/蛋白质分析来检测DP细胞的细胞反应。利用共聚焦显微镜进行神经元标志物的免疫荧光染色，可分析神经突的生长反应。...

一种共培养方法用于研究神经突起对牙髓旁分泌信号的反应性生长

本方案逐步演示了如何从小鼠中提取下颌第一磨牙，为专注于颌骨愈合与再生研究的研究人员提供了一种替代方法。...

小鼠下颌磨牙拔牙窝愈合模型的建立

本文介绍了一种利用创新性开口器在小鼠中建立牙髓炎模型的简化方案，并随后进行组织学分析。...

建立用于牙髓炎研究的新型开口器小鼠牙髓暴露模型

本研究介绍了两种关键的实验技术：构建小鼠伤口模型以评估伤口闭合情况，以及从小鼠皮肤制备单细胞悬液以保持细胞活性。...

小鼠伤口模型的建立与单细胞悬液的制备

显微硬度是一种机械性能，也是评估硬组织病理生理学的有用参数。本文中，我们展示了一种标准化的显微硬度分析方案（包括样品制备、抛光、平整表面及压痕位点选择），用于啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨的显微硬度检测，具体模型为氟斑牙和结扎诱导的牙周骨吸收。...

啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿与牙槽骨的显微硬度测量

伤口是全球健康面临的一项挑战。本研究开发了一种利用数字平面测量法的标准化摄影装置，以减少伤口测量的变异性。对小鼠伤口进行为期14天的监测发现，伤口面积和周长在初期增加，随后逐渐闭合。该方法可能有助于评估临床前模型中的伤口闭合动力学。...

利用数字平面测量法评估小鼠模型中伤口闭合动力学

小型动物成像技术可实现活体内的连续诊断检查和治疗干预。in...

小鼠内窥镜检查技术 在体 内 癌症发生的多模态成像及肠道伤口愈合与炎症评估

学习小鼠直接盖髓术以研究牙髓伤口愈合和修复性牙本质形成。该方法使用MTA材料和复合树脂，通过显微CT和组织学分析评估牙髓生物学反应，为改进牙科材料提供可靠的体内研究模型。

小鼠牙髓直接盖髓模型的建立及其在牙髓创面愈合与修复性牙本质形成评价中的应用

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