从详细的空间表达图谱的动态表达数据的时间排序

该实验程序的总体目标是使用固定组织采样绘制脊椎动物分割时钟的时空基因表达动力学。这种方法允许对前体中胚层中的振荡基因动力学进行无偏倚的评估，这对于理解控制脊椎动物体细胞发生的分子机制至关重要。该技术的主要优点是可以同时生成和处理许多样品，从而可以对固定组织中的基因表达动力学进行高三部分分析。

演示该程序的是 Charlotte Bailey 博士，她是我实验室的前博士后。根据文本方案获得小鼠子宫角后，在立体显微镜下，用弯曲的剪刀剪开子宫角的厚肌肉膜，小心地提取每个胚胎。用弯曲的剪刀和细镊子，从每个胚胎中解剖出羊膜囊。

然后使用手术针或弯曲的剪刀，通过将胚胎剪在后肢芽的前方，从每个胚胎中收获尾部组织。平衡尾部组织腹侧朝下。然后用针头轻轻摇动，沿中线将尾部组织解剖成两半，从而产生成对的 PSM 外植体。

确保神经管、脊索和 PSM 组织在两个外植体之间平均分配。然后将每个对侧 PSM 外植体移液到少量预热培养基中的 35 mm 塑料培养皿盖的底面。将培养皿放在盖子顶部并快速倒置，使 PSM 组织以悬垂的培养基滴形式悬浮在盖子上。

然后将 PSM 外植体在 37 摄氏度的加湿室中培养 1 到 2 小时。将 PSM 外植体对转移到 24 孔组织培养板的各个孔中。然后向样品中加入 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，并在室温下孵育板 1 小时，或在 4 摄氏度下在摇床上孵育过夜。

孵育后，使用 PBS 在室温下在摇床上洗涤样品孔。用细塑料巴斯德移液管，将样品上的 PBS 溶液更换三到四次。为了进行免疫组织化学，将 PBS 中的 2%Triton X-100 添加到每个胚胎对的一个 PSM 外植体中，并将样品在室温下在摇床平台上孵育 1 小时以清洗它们。

使用 PBS 短暂冲洗样品。然后用封闭溶液替换 PBS，并将样品在 4 摄氏度下在摇床上孵育过夜。使用工作缓冲液稀释所需的一抗。

在本例中，针对 Delta 样 1 和 Notch1 的抗体以 1：25 的稀释度使用。将抗体添加到外植体中，并在 4 摄氏度的摇床平台上孵育样品 3 到 5 天。孵育后，使用 PBS 洗涤样品 2 次，每次 5 至 10 分钟。

然后在室温下在摇摆平台上用 0.3%Triton X-100 的 PBS 溶液进行 3 次洗涤。在工作缓冲液中稀释二抗后，向每个样品孔中加入 250-500 μL 抗体溶液，注意不要使用最后几 μL 的溶液，因为其中可能含有抗体聚集体。用锡箔纸盖住板，并将样品在 4 摄氏度的避光中置于二抗溶液中孵育 3 到 5 天。

孵育后，使用 PBST 洗涤样品 2 次，每次 10 分钟。然后使用 PBS 在室温下在摇床上洗涤组织一次，每次洗涤 5 分钟。按照文本方案，通过乙醇 PBST 稀释系列对剩余的对侧 PSM 外植体进行脱水和再水化。

向外植体中加入每毫升 10 μg 蛋白酶 K 的 0.1% PBST 溶液，并在不搅动的情况下孵育组织 5 分钟。然后快速去除蛋白酶 K 溶液并使用 PBST 短暂冲洗样品。将 4% 甲醛和 0.1% 戊二醛的 PBST 溶液添加到 PSM 外植体中，使其后固定，并将样品孵育 30 分钟。

然后，使用 PBST 洗涤样品两次，每次 10 分钟后，向组织中加入 50% 杂交混合物，并在 65 摄氏度下孵育 10 分钟，不要搅拌。根据文本方案孵育样品和杂交混合物后，去除溶液并加入 0.25 至 0.5 毫升预热的杂交混合物，其中含有地高辛标记的反义 RNA 探针，针对已知的分割时钟成分。使用胶带密封板，并将样品在 65 摄氏度下孵育两晚。

孵育后，使用预热的 TBST 中预热的 50% 杂交混合物洗涤样品 15 分钟。然后使用 TBST 冲洗样品两次，然后将组织在 TBST 中于室温下在摇床上孵育 30 分钟。接下来，将外植体在封闭溶液中预孵育至少两个小时。

然后用新鲜的封闭溶液替换溶液，该溶液含有 1：200 稀释的 HRB 偶联抗地高辛抗体。将样品在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，使用 TBST 在室温下冲洗样品 3 次，然后将它们转移到新的 24 孔组织培养板的各个孔中。

然后用 TBST 洗涤外植体 3 次，每次 1 小时。在制备用于成像的样品之前，使用酪胺信号放大试剂盒对检测到的 mRNA 进行观察。通过从 0.12 mm 厚的成像垫片中取出粘合衬垫并将其粘贴到载玻片上，为每对外植体准备一个带电粘附载玻片。

根据文本方案将一对或外植体定位到载玻片上后，让样品粘附在载玻片上 45-60 秒，直到组织开始出现粘性和半透明性，而不会完全变干。同时，使用镊子从垫片上去除剩余的粘性衬垫，并在垫片中心的样品中加入一大滴双功能封固剂和透明溶液。在样品上盖上圆形盖玻片，确保封固剂均匀分布，并且所有边缘都与垫片接触。

然后将盖玻片倒置在一些低绒纸上。用力按下以确保盖玻片完全粘附在垫片上，并去除任何多余的封固剂。重复此过程，直到没有更多封固剂吸干纸张。

清洁并标记载玻片并将其存放在黑暗中直至成像。然后根据文本协议进行成像和分析。在这个实验中，Delta-Like 1 和 Notch1 蛋白表达显示，根据在每个外植体对的一半中检测到的 Notch 调节分割时钟内含子疯狂边缘的新生转录，通过暂时排列胚胎来不同步地振荡。

面板根据 Segmentation clock cycle的第一阶段、第二阶段和第三阶段进行排列。沿 PSM 前后轴的 Delta-Like 1、Notch1 和内含子疯狂边缘的表达域范围由颜色编码条划定。如此处所示，生成了一个图来量化 Delta-Like 1、Notch1 和 inelectro lunatic fringe 信号强度与 PSM 前后轴的关系，并说明了整个 clock cycle中 PSM 的轴向变化和信号强度。

运动图可视化了 Delta-Like 1、Notch1 和内含子疯狂条纹在许多 PSM 中的空间分布。运动量计的每一行代表单个 PSM 外植体的信号强度。相对于 PSM 前后轴的 Delta-Like 1、Notch1 和内含子疯狂边缘信号强度的定量揭示了这些靶标的清晰振荡表达动力学。

最后，这些运动图显示了 Notch 受体 NICD 、 Delta-Like 1 、 内含子疯狂边缘和 Notch1 的裂解和激活形式在许多 PSM 中的空间分布。这项技术帮助脊椎动物有丝分裂发生领域的研究人员更好地了解雏鸡和小鼠前体中胚层的分割基因振荡动力学。一旦掌握，该技术就可以对大量样品进行，从而可以同时分析多种 mRNA 和目标蛋白质的表达谱。

按照此程序，图像数据的额外定量可以了解基因表达的时间延迟以及研究人员感兴趣的 RNA 和蛋白质信号的亚细胞定位。看完这个视频，你应该对如何使用厚组织采样来绘制脊椎动物分割时钟的时空基因表达动力学有了很好的了解。这可以随后进行自动图像分析，如文本协议中所述。

在尝试此程序时，重要的是要确保 PSM、脊索和神经管在 PSM 外植体之间均匀分布，并在开始前仔细优化抗体稀释度。请记住，使用甲酰胺、多聚甲醛和戊二醛可能非常危险。注意佩戴个人防护设备，并在适用的情况下在通风橱中工作。