Name: 在单酵母细胞MAPK诱导表达的时空定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习在单细胞水平定量酵母MAPK通路基因表达的时空动态。本方法结合活细胞显微成像与流式细胞术，利用荧光报告基因实时追踪蛋白表达变化，为信号转导研究提供可靠工具。

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作者感谢苏黎世联邦理工学院生物化学研究所的 Matthias Peter 及其研究团队，这些方法即在其实验室中开发完成。本研究得到了瑞士国家科学基金会的资助。

1. 显微镜测量
<ol>
	<li>用酵母接种5 ml合成培养基。</li>
	<li>在30 °C条件下培养细胞过夜。</li>
	<li>次日早晨测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600）。</li>
	<li>将过夜培养物用5 ml合成培养基稀释至OD600为0.05。</li>
	<li>将稀释后的培养物在30 °C下培养至少4小时。</li>
	<li>在合成培养基中配制3倍浓缩的（0.6 M）NaCl溶液。</li>
	<li>在PBS中配制1 mg/ml的刀豆球蛋白A（ConA）溶液。</li>
	<li>将约200 μl ConA溶液过滤加入载玻片的孔中。</li>
	<li>静置30分钟。</li>
	<li>移除ConA溶液。</li>
	<li>向孔中加入150 μl H2O。</li>
	<li>移除H2O。</li>
	<li>测定细胞培养物的OD600。</li>
	<li>在1.5 ml离心管中制备300 μl、OD600 = 0.02的细胞培养物。</li>
	<li>在水浴中超声处理细胞45秒。</li>
	<li>短暂涡旋振荡离心管。</li>
	<li>在水浴中超声处理细胞45秒。</li>
	<li>短暂涡旋振荡离心管。</li>
	<li>向孔中加入200 μl细胞培养物。</li>
	<li>等待30分钟，使细胞沉降到孔底。</li>
	<li>将载玻片置于显微镜上。</li>
	<li>选择待记录的荧光通道的照明设置。</li>
	<li>选择两个明场图像的照明设置（其中一个略微失焦：焦平面下方3 μm，以实现细胞的准确分割）。</li>
	<li>选择延时成像的时间间隔。</li>
	<li>选择待成像的视野。</li>
	<li>开始采集若干帧图像。</li>
	<li>暂停采集，加入100 μl 0.6 M NaCl培养基。</li>
	<li>恢复成像。</li>
</ol>
2. 流式细胞术检测
<ol>
	<li>用酵母接种5 ml合成培养基。</li>
	<li>在30 °C下培养过夜。</li>
	<li>次日早晨测定过夜培养物的OD600。</li>
	<li>将过夜培养物用5 ml合成培养基稀释至OD600为0.1。</li>
	<li>在30 °C下继续培养至少4小时，使OD600达到0.2–0.4。</li>
	<li>用H2O配制1 mg/ml的环己酰亚胺溶液。</li>
	<li>在合成培养基中配制3倍浓缩（0.6 M）的NaCl溶液。</li>
	<li>为每个待测时间点准备一个含100 μl 0.6 M NaCl培养基的1.5 ml微量离心管。</li>
	<li>在时间0时，向每根微量离心管中加入200 μl细胞培养物。</li>
	<li>在30 °C下振荡孵育。</li>
	<li>在时间T时，向一个微量离心管中加入30 μl环己酰亚胺。</li>
	<li>对所有需要的时间点重复步骤2.11。</li>
	<li>将所有微量离心管在30 °C下振荡孵育至少45分钟，最长不超过3小时。</li>
	<li>在流式管中预先加入400 μl PBS。</li>
	<li>在水浴中超声处理细胞1分钟。</li>
	<li>短暂涡旋振荡微量离心管。</li>
	<li>在水浴中超声处理细胞1分钟。</li>
	<li>短暂涡旋振荡微量离心管。</li>
	<li>从每根微量离心管中取100 μl细胞培养物加入对应的流式管中。</li>
	<li>选择488 nm激发激光和530/30 nm带通滤光片进行检测。</li>
	<li>检测非表达和完全表达的样品，以确认其是否处于检测器的灵敏度范围内。</li>
	<li>每份样品至少检测10,000个细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

显微镜检查
用ConA处理小室是确保细胞成像质量的关键步骤。由于ConA在PBS中的溶解度较低（5 mg/ml），过滤过程可去除未过滤溶液中存在的大颗粒聚集体，这些聚集体会影响成像效果。细胞能够相对牢固地附着在经处理的表面，加入诱导溶液不应干扰细胞的定位，从而实现刺激前后对细胞的连续追踪。该处理方法也可应用于细胞处于持续流动条件下的流道或微流控装置7,15。如果处理后未用清水充分冲洗小室，细胞将无法正常黏附于玻璃表面，原因可能是溶液中的ConA直接与细胞结合，阻碍了细胞在玻璃表面形成牢固的黏附。洗涤步骤完成后，小室在接种细胞前可干燥放置3-4小时，而不会显著影响细胞在玻璃表面的黏附能力。
荧光通道曝光时间的选择是实验成功的关键设置之一。由于细胞的荧光信号会随着时间推移而增强，因此在正式实验前，使用已诱导的样品预先测试可用于避免图像采集过程中信号饱和的最大曝光时间至关重要。在选择曝光时间时，另一个需要考虑的参数是荧光信号的漂白效应。对于每个样品，必须在图像亮度与因时间推移过程中漂白导致的信号衰减之间找到平衡点。每...

信号转导级联反应通常最终导致蛋白质的表达。对这种表达谱的表征是理解生物通路功能的关键环节。通过多种技术可鉴定上调蛋白质的谱系及其活化动态，例如微阵列、Northern印迹或Western印迹1-3。然而，这些技术反映的是整个细胞群体反应的平均值。为了深入理解蛋白质表达的精细调控，理想情况下应在单细胞水平进行测量。此外，这些测量还应提供可用于建立潜在通路数学模型的定量数据。
显微镜和流式细胞术是两种非常适合提供此类定量单细胞测量结果的技术。通过将荧光蛋白与内源蛋白进行末端标记，可用于定量其表达水平4。然而，由于在蛋白末端添加较大的荧光基团可能导致其失去功能，因此通常更理想的方法是构建基于启动子驱动荧光表达元件的特异性表达报告系统。该报告蛋白为细胞系统的外源蛋白，因此不会影响细胞内发生的信号传导事件。
显微镜和流式细胞术在酵母信号传导研究领域均得到了广泛应用。例如，Colman-Lerner 及其同事通过显微镜在单细胞水平上关联了交配特异性报告基因与组成型表达报告基因的表达情况，以量化酵母交配信号转导级联中的噪声5；Acar 及其同事则利用流式细胞术研究了调控 GAL 基因表达的调控网络6。在之前的一项研究中7，我们结合使用了这两种技术，以研究芽殖酵母中高渗甘油（HOG）通路的表达输出。该通路是一种丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，可由高渗应激激活，导致 MAPK Hog1 激活，并转位至细胞核内，诱导转录程序，从而引发约 300 个基因的表达。为研究这一过程，我们构建了一种基于 STL1 启动子（一个特异性响应 Hog1 活性而被诱导的基因8）驱动四聚体 Venus 荧光蛋白表达的报告系统（pSTL1-qV）。流式细胞术检测发现，在中等应激水平（0.1 M NaCl）下存在两个细胞群体，其中仅有一部分细胞表达荧光报告蛋白。我们进一步利用显微镜深入探究了这一现象，发现蛋白表达中的这种噪声主要由内在因素决定9。我们还观察到，即使 Hog1 活性水平相似的细胞，其基因表达结果也可能表现出显著差异。结合使用这两种技术使我们得以揭示应激响应基因的缓慢重塑如何在单细胞水平上影响基因表达结果7。
在本文中，我们以高渗冲击诱导的 pSTL1-qV 报告基因表达为例，说明通过显微镜和流式细胞术对蛋白质表达进行定量的方法。使用相同菌株在 0.2 M NaCl 胁迫条件下，分别采用这两种技术进行研究。这将有助于我们突出这两种高度互补技术之间的一些关键差异。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>酵母氮源基础培养基</td><td>对于培养基</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>CSM氨基酸混合物</td><td>用于培养基</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>环己酰亚胺</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>有毒的</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - 四重V Venus</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>尼康</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>显微镜控制软件</td><td>Micro-manager</td><td>版本 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>孵育室</td><td>LIS</td><td>盒子</td><td></td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>超声波遥控</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8孔板 </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>基质生物科学</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

单个酵母细胞中mapk诱导表达的时间定量分析

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

在单细胞水平上对基因表达进行定量，能够揭示在群体水平测量中被掩盖的新型调控机制。本文介绍了基于显微镜和流式细胞术的两种方法，以展示如何获取此类数据。以酵母中高渗甘油应答MAPK通路激活后诱导的荧光报告基因表达为例，突出说明了每种方法的具体优势。流式细胞术可测量大量细胞（10,000个），并能够直接反映蛋白质表达的动力学过程，而不受荧光蛋白缓慢成熟动力学的影响。相比之下，显微镜对活细胞的成像仅限于检测少数细胞中已成熟报告蛋白的形式。然而，该技术所产生的数据集可能极为丰富，这得益于多种报告基因的组合以及从单个细胞获得的空间和时间信息。结合使用这两种测量方法，可为信号通路对蛋白质表达的调控机制提供新的见解。

显微镜检查
携带表达报告基因 pSTL1-qV（ySP97）的酵母细胞被固定在载玻片孔的底部，并置于显微镜下。在成像过程中，通过直接向孔中加入应激培养基来刺激细胞。这种方法使我们能够在信号通路诱导前获取少量细胞图像，并持续追踪刺激后细胞的命运变化。在本实验中，细胞被连续观察约 2 小时，时间间隔为 10 分钟。图 1A 为诱导前非荧光状态的细胞图像，图 1B 显示同一组细胞在受到应激处理 2 小时后的状态，此时表达报告基因已被诱导并产生荧光。
为了提取这些图像中包含的定量信息，必须进行复杂图像分析过程。该过程包括对细胞进行分割以在图像中定义对象，对这些对象进行逐帧追踪，以及测量这些对象的特征（形态和强度特性）。我们开发了名为 YeastQuant 的自主分析平台来完成此类分析10。此外，还有一些其他非商业软件可用于执行此类任务：CellProfiler 11、CellID ...

本文介绍了基于流式细胞术和显微镜技术的两种互补方法，可在单细胞水平上定量分析酵母中由MAPK通路激活所诱导的基因表达动态变化。

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

单细胞水平的基因表达定量揭示了在群体水平测量中难以察觉的新型调控机制

以下实验的总体目标是在单细胞水平上定量有丝分裂原激活蛋白的表达。为实现这一目标，构建了一种酵母菌株，该菌株携带由STL1启动子控制、特异性响应hog1 MAP激酶激活的荧光报告基因——四倍体Venus。荧光蛋白的表达可通过活细胞显微成像实验进行定量，即在显微镜下直接对细胞施加胁迫，以促进荧光信号的实时出现；也可通过流式细胞术进行定量，此时细胞在微量离心管中受到胁迫，并在特定时间点终止蛋白质合成。通过添加环己酰亚胺，每次只能利用活细胞显微镜分析少量细胞，但可直接观察单个细胞的命运，并将其与其他细胞特性相关联；而流式细胞术则能够在同一时间对大量细胞的丝裂原活化蛋白表达进行评估。该方法有助于回答信号转导领域中的关键问题，例如哪些蛋白质参与了基因表达的调控。尽管该方法可为酵母信号通路研究提供见解，但只要具备合适的报告基因，也可应用于其他信号级联途径。为进行活细胞显微镜观察，首先在5毫升合成培养基中接种酵母，并于30°C下过夜培养细胞。次日早晨，测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD 600），然后将过夜培养物用5毫升合成培养基稀释至OD 600为0.05。将稀释后的培养物在30°C下继续培养至少4小时以上。接下来，将约 200 微升新配制的刀豆蛋白 A 溶液过滤到凹玻片中。30 分钟后，吸除刀豆蛋白 A 溶液，并向凹槽中加入 150 微升水。随后吸去水，让凹槽在细胞准备期间自然干燥。再次测量细胞培养物在600 nm处的光密度（OD 600），然后将细胞稀释，以获得300微升、OD 600为0.02的细胞培养液，置于1.5毫升微量离心管中。将细胞在水浴中超声处理45秒。短暂涡旋振荡微量离心管，然后再次进行超声处理和涡旋振荡。现在将 200 微升细胞加入到孔玻片中，静置约 30 分钟使细胞沉降到孔底后，将玻片置于显微镜上。接着，选择待记录的荧光通道照明设置以及两个明场图像的设置，将其中一个明场设置调整至焦平面下方约三微米处，以实现准确的细胞分割。然后设定延时测量的时间间隔，并选择成像的视野区域。现在开始采集几帧图像，然后暂停采集，加入100微升新配制的0.6摩尔氯化钠培养基，随后继续成像，以准备进行流式细胞术检测。首先将酵母接种于5毫升合成培养基中，在30摄氏度下过夜培养。次日早晨，测定过夜培养物在600纳米处的光密度（OD 600），然后将细胞悬液用5毫升合成培养基稀释至OD 600为0.1。在30摄氏度下培养菌液至少4小时，使OD 600达到0.2至0.4。然后，为每个待测时间点准备一个1.5毫升的微量离心管，在零时刻加入100微升新配制的0.6摩尔氯化钠溶液。向每管中加入200微升菌液，并在30摄氏度下振荡培养。然后在每个实验时间点，向其中一个微量离心管中加入 30 微升 freshly prepared cyclo heide。在微量离心管孵育的同时，为每个微量离心管向相应的 fax 管中加入 400 微升 PBS。孵育结束后，短暂涡旋震荡微量离心管，然后对细胞进行超声处理，并如刚才所示在水浴中超声一分钟。然后将每个微量离心管中的100微升细胞培养物加入流式细胞仪中对应的流式管。加载适当的激发和检测设置，并检测非表达和完全表达的样品，以确认其处于检测器的灵敏度范围内。最后，对每份样品测量10,000个细胞。在这些图像中，携带由TL1启动子控制的表达报告基因四聚体静脉蛋白并贴附在孔板底部的酵母细胞，通过直接加入应激培养基进行刺激。如刚刚所展示的，细胞被监测约两个小时，每隔10分钟记录一次，并在刺激施加前后均采集了图像。请注意报告基因在细胞激活期间的荧光表达情况。为了从这些图像中提取定量信息，此处必须进行复杂的图像分析过程。展示了利用酵母定量分析平台获得的结果。每条红色轨迹代表单个细胞平均荧光强度随时间的变化过程。蓝色线条表示从同一孔中五个不同视野采集的五段延时影片共20帧内，超过500个被分割并追踪的细胞的中位值；浅蓝色区域表示在特定时间点测得的所有荧光强度的第25和第75百分位数。为了通过流式细胞术研究同一报告基因表达的动力学特性，放线菌酮（Cycloheximide）在不同时间点以5至10分钟的间隔被添加到酵母细胞培养物中。该药物可阻断新蛋白质的合成，但对已表达的荧光蛋白的成熟过程无干扰。因此，可通过分析直方图向右偏移所反映的蛋白表达情况，在Cycl H编辑时定量检测蛋白表达，从而规避与荧光蛋白成熟相关的问题。在本图中，通过显微镜或流式细胞术测量的报告蛋白表达动力学进行了比较：显微镜结果显示，在应激培养基编辑后30至40分钟荧光信号才开始上升，而流式细胞术的测量结果明确表明，蛋白质在刺激后10至15分钟内即已开始产生，揭示了荧光蛋白成熟过程较慢的特性。这两种技术均可在这些简单实验中获取单细胞信息，三次生物学重复之间的差异较小，远小于通过显微镜或流式细胞术观察到的单细胞反应的巨大变异性。在完成这些操作步骤后，还可进行其他方法（例如上述反应测量），以回答更多问题，例如基因表达的阈值是多少。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用显微镜或流式细胞术在单细胞水平上检测蛋白质表达。

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Biology

生物学

在单酵母细胞MAPK诱导表达的时空定量

一种用于可视化固定化酵母细胞生长的快速技术，此处应用于沉默交配位点 HML 和 HMR...

一种快速可视化活体固定酵母细胞的技术

酵母的时序性衰老是指细胞在静止期随着时间推移而丧失活力的现象。本文介绍一种用于定量测定酵母时序性寿命的高通量方法。...

通过老化细胞的再生长定量酵母时序性寿命

基于FRET的报告分子正越来越多地用于监测活细胞中激酶和磷酸酶的活性。本文介绍了一种利用基于FRET的报告分子评估细胞周期依赖性靶蛋白磷酸化变化的方法。...

通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

我们提供了一种简单的实验方案，用于获取酵母细胞生长过程的荧光显微镜视频，以及一个基于图形用户界面的软件包，用于提取单细胞时间序列数据。该分析方法结合了自动化的谱系追踪与分裂时间分配，并整合了可视化检查及对追踪数据的手动校正。...

获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

裂殖酵母中细胞分裂事件的时空分析

本文介绍了一种利用RNA-seq技术监测S.

测量酵母 S. cerevisiae 缺氧应答过程中 mRNA 水平随时间的变化

本文所述方案基于对经4-硫尿嘧啶标记的酵母细胞中纯化的新生mRNA进行全基因组水平的定量分析。该方法能够将mRNA合成与mRNA降解过程分离，从而准确测量RNA聚合酶II的转录活性。...

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

延时显微镜是研究芽殖酵母减数分裂的有力工具。本实验方案结合了细胞周期同步化、延时显微镜观察以及目标蛋白的条件性耗竭方法，展示了如何研究特定蛋白在减数分裂染色体分离过程中的功能。...

利用延时显微镜和时期特异性蛋白质核内耗竭研究减数分裂 S. cerevisiae

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

学习在单细胞水平定量酵母MAPK通路基因表达的时空动态。本方法结合活细胞显微成像与流式细胞术，利用荧光报告基因实时追踪蛋白表达变化，为信号转导研究提供可靠工具。

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

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