在单酵母细胞MAPK诱导表达的时空定量

以下实验的总体目标是在单细胞水平上定量丝裂原活化蛋白的表达。为了实现这一目标，生成了一种带有荧光表达报告基因四重 Venus 的酵母菌株，该菌株由 STL 单启动子控制，并且对 hog 单图激酶的激活具有特异性。荧光蛋白表达可以通过活细胞显微镜测定进行定量，其中细胞直接在显微镜上受到应激以促进荧光的实时显示，或者通过流式细胞术进行定量，在这种情况下，细胞在微管中受到应激，蛋白质合成在给定时间被阻断。

通过添加环 heide，一次只能用活细胞显微镜分析几个细胞，但可以直接观察单个细胞的命运并与其他细胞特性流式细胞术相关联，另一方面，也允许一次评估大量细胞上的丝裂原活化蛋白表达。这种方法可以帮助回答信号转导领域的关键问题，例如哪些蛋白质参与基因表达的调节。虽然这种方法可以提供对酵母途径的洞察，但它也可以应用于其他信号级联反应，具体取决于正确表达的可用性。记者。

为了准备用于活细胞显微镜检查的细胞，首先用酵母接种 5 毫升合成培养基，然后在 30 摄氏度下培养细胞过夜。第二天早上，测量过夜培养物的 OD 600，然后在 5 毫升合成培养基中稀释过夜培养物至 OD 600 为 0.05。将稀释的培养物在 30 摄氏度下培养至少 4 小时。

接下来，将约 200 微升新鲜制备的 conna valent a 溶液过滤到载玻片中。30 分钟后，去除 con a 溶液并向井中加入 150 微升水。现在除去水，让孔干燥，同时准备细胞。

再次测量细胞培养物的 OD 600，然后稀释细胞以获得 300 微升的细胞培养物，OD 600 为 0.02 和 1.5 毫升微管。在水浴中对细胞进行超声处理 45 秒。短暂涡旋微管，然后再次超声处理并涡旋细胞。

现在将 200 μL 细胞添加到孔载玻片中，然后让细胞沉降到孔底部约 30 分钟后，将载玻片放在显微镜上。接下来，选择要记录的荧光通道和两个明场图像的照明设置，将其中一个明场设置调整到焦平面下方约 3 微米处，以允许适当的细胞分割。然后设置延时测量的时间间隔，并选择成像的视野。

现在开始采集几帧，然后暂停采集以添加 100 微升新鲜制备的 0.6 摩尔氯化钠培养基，然后恢复成像以准备细胞以进行流式细胞术测量。首先将酵母接种在 5 毫升合成培养基中，然后在 30 摄氏度下培养细胞过夜。第二天早上，测量过夜培养物的 OD 600，然后在 5 毫升合成培养基中将细胞悬液稀释至 OD 600 为 0.1。

在 30 摄氏度下培养培养物至少 4 小时，以达到 0.2 至 0.4 的 OD 600。然后将 100 微升新鲜制备的 0.6 摩尔氯化钠添加到 1.5 毫升微管中，用于在时间零处测量的每个时间点。向每个微管中加入 200 微升细胞，并在 30 摄氏度下振荡孵育培养物。

然后在每个实验时间点，将 30 微升新鲜制备的 cyclo heide 添加到其中一个微管中。在微管孵育时，将 400 微升 PBS 添加到每个微管的相应传真管中。孵育后，短暂涡旋微管，然后对细胞进行超声处理，并加入水浴 1 分钟，如刚才所示。

然后在细胞仪的流动下，将来自每个微管的 100 微升细胞培养物添加到其相应的传真管中。加载正确的激发和检测设置，并测试未表达和完全表达的样品，以验证它们是否在检测器灵敏度范围内。最后，测量这些图像中每个样品的 10， 000 个细胞，在 TL one 启动子的控制下携带表达报告基因四静脉蛋白并附着在孔载玻片底部的酵母细胞通过直接版本的应激培养基刺激。

正如刚才所展示的，以 10 分钟的间隔监测细胞约两个小时，并在刺激之前和之后获取图像。注意，在活化细胞期间报告的荧光表达。要提取这些图像中包含的定量信息，必须在此处执行复杂的图像分析过程。

显示了使用酵母定量分析平台获得的结果。每条红色轨迹代表单个细胞的平均荧光强度的时间演变。蓝线表示在从同一孔的五个不同视野采集的 5 个延时电影的 20 帧中分割和跟踪的 500 多个细胞的中位数，浅蓝色区域代表在给定时间点测量的所有强度的第 25 个和第 75 个百分位数，以研究流式细胞术同一报告基因表达的动力学 将放线菌酮添加到酵母中不同时间点的细胞培养物，间隔 5 到 10 分钟。

该药物阻断新蛋白质的合成，但已经表达的荧光蛋白的成熟不会受到干扰。因此，通过在 Cycl H 版时可以通过直方图向右的位移来量化蛋白质表达，从而规避了与荧光蛋白成熟相关的问题。在该图中，比较了通过显微镜或流式细胞术测量的表达报告基因的动力学，而荧光信号在通过显微镜测量的应激培养基版本后 30 至 40 分钟上升，流式细胞术测量清楚地表明蛋白质在刺激后 10 至 15 分钟之间已经产生，证明荧光蛋白成熟缓慢。

这两种技术都允许访问这些简单实验的单细胞信息，与通过显微镜或流式细胞术在单细胞反应中观察到的巨大变异性相比，三个生物学重复之间的差异很小。按照这些程序，可以执行其他方法（如这些响应测量）来回答其他问题，例如基因表达的阈值。观看本视频后，您应该对如何使用流式细胞术显微镜测量单细胞水平的蛋白质表达有很好的了解。