在单酵母细胞MAPK诱导表达的时空定量
2013年10月4日
基于流式细胞术和显微术的两个互补的方法给出，使定量基因表达的诱导通过MAPK途径在酵母的激活的动力学，在单细胞水平。
以下实验的总体目标是在单细胞水平上定量丝裂原活化蛋白的表达。为了实现这一目标，生成了一种带有荧光表达报告基因四重 Venus 的酵母菌株，该菌株由 STL 单启动子控制，并且对 hog 单图激酶的激活具有特异性。荧光蛋白表达可以通过活细胞显微镜测定进行定量，其中细胞直接在显微镜上受到应激以促进荧光的实时显示，或者通过流式细胞术进行定量，在这种情况下，细胞在微管中受到应激，蛋白质合成在给定时间被阻断。
通过添加环 heide，一次只能用活细胞显微镜分析几个细胞，但可以直接观察单个细胞的命运并与其他细胞特性流式细胞术相关联，另一方面，也允许一次评估大量细胞上的丝裂原活化蛋白表达。这种方法可以帮助回答信号转导领域的关键问题，例如哪些蛋白质参与基因表达的调节。虽然这种方法可以提供对酵母途径的洞察，但它也可以应用于其他信号级联反应，具体取决于正确表达的可用性。记者。
为了准备用于活细胞显微镜检查的细胞，首先用酵母接种 5 毫升合成培养基，然后在 30 摄氏度下培养细胞过夜。第二天早上，测量过夜培养物的 OD 600，然后在 5 毫升合成培养基中稀释过夜培养物至 OD 600 为 0.05。将稀释的培养物在 30 摄氏度下培养至少 4 小时。
接下来，将约 200 微升新鲜制备的 conna valent a 溶液过滤到载玻片中。30 分钟后，去除 con a 溶液并向井中加入 150 微升水。现在除去水，让孔干燥，同时准备细胞。
再次测量细胞培养物的 OD 600，然后稀释细胞以获得 300 微升的细胞培养物，OD 600 为 0.02 和 1.5 毫升微管。在水浴中对细胞进行超声处理 45 秒。短暂涡旋微管，然后再次超声处理并涡旋细胞。
现在将 200 μL 细胞添加到孔载玻片中，然后让细胞沉降到孔底部约 30 分钟后，将载玻片放在显微镜上。接下来，选择要记录的荧光通道和两个明场图像的照明设置，将其中一个明场设置调整到焦平面下方约 3 微米处，以允许适当的细胞分割。然后设置延时测量的时间间隔，并选择成像的视野。
现在开始采集几帧，然后暂停采集以添加 100 微升新鲜制备的 0.6 摩尔氯化钠培养基，然后恢复成像以准备细胞以进行流式细胞术测量。首先将酵母接种在 5 毫升合成培养基中，然后在 30 摄氏度下培养细胞过夜。第二天早上，测量过夜培养物的 OD 600，然后在 5 毫升合成培养基中将细胞悬液稀释至 OD 600 为 0.1。
在 30 摄氏度下培养培养物至少 4 小时，以达到 0.2 至 0.4 的 OD 600。然后将 100 微升新鲜制备的 0.6 摩尔氯化钠添加到 1.5 毫升微管中，用于在时间零处测量的每个时间点。向每个微管中加入 200 微升细胞，并在 30 摄氏度下振荡孵育培养物。
然后在每个实验时间点，将 30 微升新鲜制备的 cyclo heide 添加到其中一个微管中。在微管孵育时，将 400 微升 PBS 添加到每个微管的相应传真管中。孵育后，短暂涡旋微管，然后对细胞进行超声处理，并加入水浴 1 分钟，如刚才所示。
然后在细胞仪的流动下，将来自每个微管的 100 微升细胞培养物添加到其相应的传真管中。加载正确的激发和检测设置，并测试未表达和完全表达的样品，以验证它们是否在检测器灵敏度范围内。最后，测量这些图像中每个样品的 10， 000 个细胞，在 TL one 启动子的控制下携带表达报告基因四静脉蛋白并附着在孔载玻片底部的酵母细胞通过直接版本的应激培养基刺激。
正如刚才所展示的，以 10 分钟的间隔监测细胞约两个小时，并在刺激之前和之后获取图像。注意，在活化细胞期间报告的荧光表达。要提取这些图像中包含的定量信息，必须在此处执行复杂的图像分析过程。
显示了使用酵母定量分析平台获得的结果。每条红色轨迹代表单个细胞的平均荧光强度的时间演变。蓝线表示在从同一孔的五个不同视野采集的 5 个延时电影的 20 帧中分割和跟踪的 500 多个细胞的中位数，浅蓝色区域代表在给定时间点测量的所有强度的第 25 个和第 75 个百分位数，以研究流式细胞术同一报告基因表达的动力学 将放线菌酮添加到酵母中不同时间点的细胞培养物，间隔 5 到 10 分钟。
该药物阻断新蛋白质的合成，但已经表达的荧光蛋白的成熟不会受到干扰。因此，通过在 Cycl H 版时可以通过直方图向右的位移来量化蛋白质表达，从而规避了与荧光蛋白成熟相关的问题。在该图中，比较了通过显微镜或流式细胞术测量的表达报告基因的动力学，而荧光信号在通过显微镜测量的应激培养基版本后 30 至 40 分钟上升，流式细胞术测量清楚地表明蛋白质在刺激后 10 至 15 分钟之间已经产生，证明荧光蛋白成熟缓慢。
这两种技术都允许访问这些简单实验的单细胞信息，与通过显微镜或流式细胞术在单细胞反应中观察到的巨大变异性相比，三个生物学重复之间的差异很小。按照这些程序，可以执行其他方法（如这些响应测量）来回答其他问题，例如基因表达的阈值。观看本视频后，您应该对如何使用流式细胞术显微镜测量单细胞水平的蛋白质表达有很好的了解。
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概述
本研究提出了两种互补的方法，用于在单细胞水平上量化酵母的基因表达动态，特别关注MAPK通路的激活。所使用的技术包括活细胞显微镜和流式细胞术，每种方法都为观察蛋白质表达提供了独特的优势。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 信号转导
- 基因表达
背景
- 丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）在细胞信号传导中起着至关重要的作用。
- 了解基因表达调控对于洞察各种生物过程至关重要。
- 酵母作为研究MAPK通路的模式生物。
- 荧光报告基因可用于实时可视化基因表达变化。
研究目的
- 在酵母中量化单细胞水平的MAPK表达。
- 比较活细胞显微镜和流式细胞术在测量基因表达方面的有效性。
- 调查基因表达调节中涉及的调控蛋白。
使用的方法
- 生成具有荧光表达报告基因的酵母菌株。
- 活细胞显微镜用于观察受压力影响的细胞中的实时荧光。
- 流式细胞术用于分析大量细胞群体。
- 使用环己酰亚胺来在特定时间点阻断蛋白质合成。
主要结果
- 两种方法都成功地量化了基因表达动态。
- 活细胞显微镜提供了对单个细胞行为的详细见解。
- 流式细胞术允许分析大量细胞群体。
- 研究结果有助于理解酵母以及其他生物体中的信号传导通路。
结论
- 该研究证明了结合显微镜和流式细胞术用于基因表达分析的实用性。
- 获得的见解可以为未来关于MAPK信号传导通路的研究提供信息。
- 这些方法可以适用于其他具有适当报告基因的信号级联反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying gene expression dynamics at single-cell resolution enables mechanistic de-risking of signaling pathway targets by revealing heterogeneity masked in bulk assays. This approach supports target validation and assay development in early discovery by providing quantitative, time-resolved readouts of pathway activation. The combination of microscopy and flow cytometry offers complementary scalability and phenotypic depth for predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking MAPK activation to single-cell reporter dynamics.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct correlation of stimulus timing with protein expression kinetics.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by distinguishing transient vs. sustained pathway activation across cell populations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Flow cytometry provides standardized, high-throughput quantification of expression dynamics across 10,000+ cells.
- Reproducibility: Cycloheximide-based pulse-chase design enables isolation of synthesis-dependent signals, reducing confounding from reporter maturation.
- Multiplex Potential: Microscopy supports spatial and temporal co-detection of multiple reporters for pathway crosstalk analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Yeast MAPK pathway conservation allows mechanistic insights transferable to mammalian stress-response signaling.
- Translational Continuity: Single-cell resolution aids in identifying subpopulation responses relevant to fractional drug effects.
- Preclinical Modeling: Enables de-risking of targets by quantifying expression noise and response thresholds in isogenic systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis screening to lead optimization, where dynamic pathway modulation informs structure-activity relationships.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how genetic or pharmacological perturbations alter MAPK-driven expression timing and amplitude.
- Screening: Enables assay standardization through flow cytometry’s ability to generate population-level dynamics with single-cell sensitivity.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables (fluorescence intensity over time) that support statistical comparison of conditions and replicates.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a disease-relevant system for studying conserved signaling nodes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating kinase modulator effects across signaling cascades with appropriate reporters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving cell-to-cell variability in pathway activation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable readouts compatible with automation-friendly workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing activation thresholds and response heterogeneity early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative, dynamic target engagement metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, fluorescent reporter design, and microfluidic or microscopy-based stress delivery.
- Dependent on access to live-cell imaging systems and flow cytometers with compatible excitation/detection settings for Venus-derived reporters.
- Necessitates standardized protocols for stress induction (e.g., osmolarity shift) and translational arrest (e.g., cycloheximide) to ensure temporal precision.
- Adaptation to mammalian systems requires validation of promoter-reporter orthogonality and stress-response conservation.
- Practical limitations include reporter maturation kinetics affecting real-time accuracy in microscopy, mitigated by flow cytometry pulse-chase designs.
