Name: 通过多色荧光跨染色体畸变稳定的检测原位杂交（渔业部）和光谱核型分析（SKY）的照射小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 了解多色荧光原位杂交和光谱核型分析技术，用于检测全身照射小鼠骨髓细胞中的染色体间稳定畸变。该方法可追踪辐射诱导的遗传损伤在多代细胞中的传播，为评估辐射遗传风险提供重要工具。

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本研究由阿肯色州空间资助联盟和国家航空航天局资助的国家空间生物医学研究所通过以下项目资助：NNX15AK32A（RP）、RE03701（MH-J）、P20 GM109005（MH-J）以及美国退伍军人事务部（MH-J）。我们感谢阿肯色大学医学科学学院环境与职业健康系项目协调员Christopher Fettes在稿件准备过程中提供的编辑协助。

所有动物实验均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。动物实验方案已获阿肯色大学医学科学分校机构动物护理和使用委员会批准。所有动物均饲养于标准空调动物设施中，温度为 20 ± 2 °C，每小时换气 10 - 15 次，并可自由获取标准啮齿类动物饲料和饮水。动物到达后，小鼠需进行为期 1 周的隔离检疫，并提供经认证的啮齿类动物饲料。
1. 辐射暴露与 体内 中期细胞的阻滞
<ol>
	<li>将未麻醉的小鼠置于照射室中，接受2 Gy全身辐射。照射期间，将小鼠放入通风良好的固定装置中，确保其不能自由移动，以获得均匀的辐射剂量。</li>
	<li>使用连接1 mL一次性注射器的25 G针头，向小鼠腹腔注射100 µL 0.05%秋水仙素溶液（将秋水仙素粉末溶于无钙无镁的PBS中）。避免将溶液直接注入任何器官。</li>
	<li>注射后将动物在笼中静置2小时，再进行骨髓细胞采集。期间应观察动物是否有疼痛或不适的迹象。</li>
</ol>
2. 通过密度梯度离心法获取骨髓细胞并分离骨髓单个核细胞
<ol>
	<li>通过 CO2 窒息法处死小鼠。</li>
	<li>在小鼠背部和腹部喷洒 70% 乙醇。</li>
	<li>用锋利的剪刀在腹部皮肤上做一个 2 cm 的切口。用钝头镊子夹住切口两侧的皮肤，轻轻拉开腹肌。</li>
	<li>用剪刀剪下两只后肢，并立即放入含 4% FBS 的预冷 PBS 中。</li>
	<li>用锋利的剃刀和棉纱布仔细清除附着在后肢上的所有肌肉组织。</li>
	<li>将胫骨与股骨分离。用剃刀修去每根骨头的两端。</li>
	<li>使用连接在 3 mL 注射器上的 23 G 针头，以 3 mL PBS（含 4% FBS）冲洗骨髓内容物，并将冲洗液收集至 15 mL 离心管中。将细胞悬液至少通过针头吹打 10 次，以制成单细胞悬液。</li>
	<li>小心地将细胞悬液叠加到等体积的淋巴细胞分离液（3 mL）上，避免破坏细胞悬液与淋巴细胞分离液之间的界面。在室温下以 400 × g 离心 30 分钟。</li>
	<li>小心收集中间白膜层，避免扰动其他层，转移至新的 15 mL 离心管中。</li>
</ol>
3. 中期细胞涂片的制备
<ol>
	<li>向含有血沉棕黄层的试管中加入 10 mL PBS。</li>
	<li>在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>小心移除上清液，然后轻轻敲击试管使细胞沉淀重悬，再加入 10 mL PBS。</li>
	<li>在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>移除上清液时避免扰动细胞沉淀，将沉淀轻轻敲散后，加入 4 mL 预热的低渗 0.075 M 氯化钾溶液，并在轻柔持续振荡下逐滴加入低渗溶液。</li>
	<li>将细胞在 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。</li>
	<li>低渗处理后，在 15 mL 试管中加入等体积（4 mL）固定液（甲醇：冰醋酸，3:1 v/v），通过轻轻颠倒试管混合均匀。</li>
	<li>在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>轻敲试管使细胞沉淀分散，随后轻轻涡旋数秒，再在持续振荡下逐滴加入 3 mL 固定液，充分混匀。</li>
	<li>室温孵育 30 分钟，然后以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>移除上清液，轻敲试管使细胞沉淀重悬，再加入 3 mL 新鲜固定液。</li>
	<li>在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，移除上清液；轻敲试管使沉淀重悬，再加入 3 mL 新鲜固定液。</li>
	<li>重复步骤 3.12 两次。</li>
	<li>在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，移除上清液时避免扰动细胞沉淀；然后加入 400 至 600 µL 固定液，用移液器充分混匀。</li>
	<li>取 30 µL 固定后的细胞悬液滴加到预先清洁并润湿、倾斜成 45° 角的载玻片上，室温静置过夜使其完全自然干燥。</li>
</ol>
4. 通过mFISH进行小鼠染色体涂染
<ol>
	<li>染色体变性
	<ol>
		<li>将含有中期细胞 spreads 的载玻片置于 2x SSC 溶液中，室温下孵育 2 分钟。</li>
		<li>依次用 70%、80% 和 100% 乙醇洗涤载玻片，每次 2 分钟，进行脱水处理。随后在 65 °C 下孵育 60 分钟。</li>
		<li>在玻璃染色缸中，将 40 mL 变性液（70% 甲酰胺 / 2x SSC；pH 7.0）预热至 70 °C（± 2 °C），持续 30 分钟。将载玻片放入预热的变性液中，孵育 1 至 1.5 分钟，以实现染色体变性。</li>
		<li>立即在冰浴的 70% 乙醇中淬灭载玻片，持续 2 分钟，以终止变性过程并防止变性后的染色体复性。随后用 80% 乙醇洗涤 2 分钟。再用 100% 乙醇重复洗涤一次，持续 2 分钟。最后在室温下完全干燥载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探针混合物的变性与杂交
	<ol>
		<li>短暂离心生产商提供的探针混合物，取 10 µL 探针混合物转移至 500 µL 带螺帽的离心管中，在水浴中于 80 °C（± 2 °C）孵育 7 分钟以进行变性。</li>
		<li>将含有探针混合物的离心管置于 37 °C 水浴中孵育 10 分钟。</li>
		<li>将变性后的探针混合物滴加到已变性的染色体载玻片上。</li>
		<li>小心地用 18 mm × 18 mm 的玻璃盖玻片覆盖杂交区域，并通过轻轻按压盖玻片以去除可见气泡。用橡胶胶水密封盖玻片四周，在 37 °C 湿润的杂交盒中避光孵育 12 至 16 小时，以完成杂交。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交后洗涤与信号检测
	<ol>
		<li>小心去除橡胶胶水和盖玻片。</li>
		<li>将载玻片放入预热至 74 °C（± 2 °C）的 0.4x SSC 溶液中，孵育 5 分钟。</li>
		<li>在洗涤液 II（4x SSC / 0.1% Tween-20）中洗涤载玻片 2 分钟。</li>
		<li>滴加 20 µL 含 DAPI 复染剂（1.5 µg/mL）的抗荧光淬灭封片剂，盖上玻璃盖玻片。用实验室纸巾轻轻按压盖玻片以去除气泡和多余封片剂。用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
		<li>使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 小鼠染色体的光谱核型分析（SKY）
<ol>
	<li>染色体与探针变性
	<ol>
		<li>将载玻片在室温下置于2x SSC中平衡2分钟，不振荡。</li>
		<li>将载玻片依次在70%、80%和100%乙醇系列中各脱水2分钟（室温）。空气干燥以彻底去除乙醇。</li>
		<li>将40 mL变性溶液（70%甲酰胺/2x SSC；pH 7.0）置于玻璃染色缸中，在水浴中预热30分钟。</li>
		<li>将载玻片放入预热的变性溶液中孵育1至1.5分钟。</li>
		<li>立即把载玻片浸入冰浴的70%乙醇中2分钟，以终止变性过程，并防止变性的染色体重新退火。</li>
		<li>将载玻片依次放入80%乙醇中2分钟，再放入100%乙醇中2分钟（室温）进行脱水。</li>
		<li>将SKY探针（厂家提供的第1管）在80 °C（± 2 °C）水浴中变性7分钟，随后立即转移至37 °C水浴中孵育10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探针杂交
	<ol>
		<li>将10 µL变性后的SKY探针加至变性染色体区域。</li>
		<li>小心地将一块18 mm × 18 mm的玻璃盖玻片覆盖在SKY探针上，确保无气泡产生。</li>
		<li>用橡胶胶水密封盖玻片边缘。</li>
		<li>将载玻片置于湿润避光的杂交盒中，在37 °C黑暗条件下孵育24至36小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交后洗涤与荧光检测
	<ol>
		<li>小心去除橡胶胶水，避免扰动盖玻片。</li>
		<li>将载玻片放入预热的快速洗涤液（0.4x SSC）中，在72 °C（± 2 °C）水浴中持续振荡5分钟。随后将载玻片浸入洗涤液III（4x SSC/0.1% Tween 20）中，振荡孵育1分钟。</li>
		<li>可选步骤：在杂交区域加入80 µL封闭试剂（厂家提供的第2管），覆盖24 mm × 60 mm塑料盖玻片，在湿润的避光环境中37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>轻轻移除塑料盖玻片，并用预热（45 ºC）的洗涤液III洗涤载玻片5分钟。</li>
		<li>加入80 µL Cy5染色试剂（厂家提供的第3管），覆盖24 mm × 60 mm塑料盖玻片，在湿润避光环境中37 °C孵育40分钟。</li>
		<li>将载玻片浸入盛有预热（45 ºC）洗涤液III（4x SSC/0.1% Tween 20）的玻璃染色缸中，在45 °C水浴中振荡孵育2分钟。重复此洗涤步骤3次。</li>
		<li>加入80 µL Cy5.5染色试剂（厂家提供的第4管），覆盖24 mm × 60 mm塑料盖玻片，在湿润避光环境中37 °C孵育40分钟。</li>
		<li>用预热（45 ºC）的洗涤液III洗涤载玻片3次。</li>
		<li>将载玻片倾斜靠在纸巾上以去除多余液体。加入20 µL抗荧光淬灭DAPI试剂（厂家提供的第5管），小心覆盖24 mm × 60 mm玻璃盖玻片，避免引入气泡。用指甲油密封盖玻片边缘，并使用配备SKY图像采集功能的落射荧光显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Lucas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+translocation+frequency+analysis+in+humans+decades+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).</li>
<li>Braselmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKY+and+FISH+analysis+of+radiation-induced+chromosome+aberrations%3A+a+comparison+of+whole+and+partial+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis.</a> Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).</li>
<li>Sokolova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+multitarget%2C+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+assay+for+the+detection+of+urothelial+carcinoma+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine.</a> J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).</li>
<li>Lindholm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodosimetry+after+accidental+radiation+exposure+by+conventional+chromosome+analysis+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH.</a> Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

决定mFISH和SKY成功的关键步骤有多个。第一步也是最关键的一步是优化秋水仙素处理，以 体内 骨髓单个核细胞的有丝分裂阻滞。秋水仙素的浓度和处理时间各自或共同作用，决定了有丝分裂指数以及染色体的凝缩程度——这是实现有效染色体涂染的两个重要前提。过高的秋水仙素浓度或过长的处理时间会导致染色体高度凝缩，不利于后续的变性与杂交。此外，在染色体高度凝缩的中期细胞铺片中准确识别复杂的染色体重排并非易事。对体重在22至26 g的小鼠腹腔注射100 µL 0.05%秋水仙素，处理2 h，可获得数量充足且染色体凝缩程度适中的中期细胞铺片。第二个关键步骤是低渗处理。低渗溶液的体积、处理时间及温度均会影响染色体形态及其在载玻片上的铺展效果。若低渗处理时间过短或温度未达最佳条件，则可能导致染色体铺展不充分，形成染色体重叠的中期细胞铺片。染色体重叠会干扰后续分析 原位 杂交过程、荧光信号的特异性以及重排的正确识别。
第三，低渗后的固定是避免细胞结块形成的重要步骤。应沿离心管壁缓慢加入固定液，并持续轻轻振荡，以获得单细胞悬液。否则，中期细胞 spreads 会困在细胞团...

识别辐射诱导的染色体间稳定畸变最可靠的两种方法是多重荧光原位杂交 原位 杂交（mFISH），可同时标记两条或更多条染色体，以及光谱核型分析（SKY），后者为基因组中每一对同源染色体赋予独特的颜色。与不稳定畸变不同，稳定畸变具有持久性，可在受照群体中持续存在并传递至若干代1，被视为辐射诱导的细胞遗传学损伤的关键分子“标志”2多项研究已表明，稳定的染色体畸变与包括癌症在内的多种疾病的发病机制及发展过程相关。3在染色体涂染（也称为分子细胞遗传学）时代之前，传统的G显带技术是检测稳定染色体畸变的唯一方法。然而，染色体显带对细胞遗传学家而言具有挑战性，因为其分辨率有限、重复性不确定、操作过程耗时耗力，且需要高度熟练和经验丰富的细胞遗传学家才能进行可靠的数据解读。4此外，经典的显带技术无法检测复杂的染色体重排，这类重排涉及两个或更多染色体上分布的三个或更多断裂点，是辐射损伤的常见结果。复杂的染色体畸变可在个体中持续多年，因此适用于辐射剂量的回顾性生物估算。5因此，需要采用一种替代方法来克服传统显带技术在检测稳定染色体畸变方面的局限性。 
20世纪60年代末，Gall和Pardue（1969年）在利用放射性标记核酸探针进行分子杂交方面的开创性工作，开启了细胞遗传学领域的新纪元，使得染色体上特定DNA序列的检测成为可能6。然而，使用放射性探针进行分子杂交存在若干缺点：放射性探针相对不稳定，其活性依赖于所用同位素的放射性衰变，杂交过程耗时较长，分辨率有限，探针成本相对较高，且放射性材料对健康有害。因此，开发和设计非放射性探针变得十分必要。20世纪80年代和90年代，荧光标记核酸探针的引入克服了放射性探针的局限性，显著提高了杂交技术的安全性、灵敏度和特异性7-10。在配备适当激发和发射滤光片的荧光显微镜下观察时，荧光探针可产生极为明亮的信号。通过该FISH技术，染色体或其部分的任何缺失、增加或重排均能被轻易识别。
荧光原位杂交染色技术对染色体畸变的分析多年来显著推动了细胞遗传学研究的发展。针对从位点特异性探针到全染色体涂染探针等特定应用设计的荧光标记探针，极大地促进了该领域的发展；同时也使得检测亚显微水平的（“隐匿性”）重排成为可能，而此类重排在传统染色体显带技术下无法被发现。多色荧光原位杂交（mFISH）和光谱核型分析（SKY）已被证实是识别简单及复杂染色体间重排的有力工具。这两种技术的基本原理相似，但在荧光信号的检测与分辨方法上存在差异。 原位 杂交和图像采集过程有所不同。在mFISH中，通过使用窄带通显微镜滤光片，分别捕获四种荧光染料各自的单色图像，然后利用专用软件将这些图像合并。而在SKY中，图像采集基于落射荧光显微镜、电荷耦合器件成像和傅里叶光谱技术的结合，可在一次曝光中对所有图像点的完整发射光谱进行测量。在mFISH和SKY中，均首先独立采集单色图像，随后将图像合并，最后根据连接到每种荧光染料探针上的特异性染料，为单色图像中的染色体分配独特的伪彩色。
多色荧光原位杂交（mFISH）与光谱核型分析（SKY）在辐射生物学领域中的贡献显著，尤其在电离辐射（IR）人体暴露的回顾性剂量估算（辐射生物剂量学）11-14、辐射致癌风险评估15，以及放射治疗相关继发性癌症的检测与风险评估16方面具有重要意义。最近一项针对小鼠的研究表明，基于荧光原位杂交的染色体涂染技术也是评估辐射防护措施有效性的关键工具17。在本研究中，采用mFISH与SKY技术，证实了全身辐射暴露对小鼠骨髓细胞中稳定染色体畸变诱导的影响。

<table><tbody><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221198-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC缓冲液 20&amp;times; 浓缩液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>小鼠SKY实验试剂</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0030/M40</td><td></td></tr><tr><td>CAD—浓缩抗体检测试剂盒</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0033</td><td></td></tr><tr><td>定制单色探针—3种颜色；小鼠1号染色体：红色，小鼠2号染色体：绿色，小鼠3号染色体：青色</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0182/10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545B</td><td></td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，37%，Acros Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45055-0025&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand带螺旋盖的玻璃染色缸&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX氯化钾溶液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10575-090</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>秋水仙胺粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-464-757&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd Mark I，型号25&lt;sup&gt;137&lt;/sup&gt;Cs 照射仪</td><td>J. L. Shepherd &amp; Associates</td><td>Model 484B</td><td></td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>647911</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200度</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEX02761</td><td></td></tr><tr><td>PBS（1× PBS 液体），不含钙和镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-437-010</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC295320010</td><td></td></tr><tr><td>蔡司显微镜</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager.Z2</td><td></td></tr></tbody></table>

通过多重荧光检测染色体间稳定畸变 原位 辐射小鼠中的多重荧光原位杂交（mfish）与光谱核型分析（sky）

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

电离辐射（IR）可诱导产生多种稳定和不稳定的染色体畸变。不稳定的畸变通常表现为染色体形态显著受损，可通过常规染色体染色技术轻松识别。然而，稳定畸变涉及遗传物质的交换或易位，染色体形态变化不大，因此需要依赖复杂的染色体涂染技术进行检测，该技术基于 原位 荧光标记DNA探针的杂交，一种被称为荧光原位杂交的染色体显带技术 原位 杂交（FISH）。FISH探针可针对整条染色体或染色体上的特定亚区域。该方法不仅能够可视化稳定的染色体畸变，还可用于检测参与特定畸变形成的染色体或特定DNA序列。细胞遗传学中存在多种染色体涂染技术；本文介绍两种高灵敏度的方法：多重荧光 原位 杂交（mFISH）和光谱核型分析（SKY）被用于鉴定小鼠全身照射后骨髓细胞中形成的染色体间稳定型畸变。尽管这两种技术均依赖于荧光标记的DNA探针，但其信号检测方法及荧光信号的图像采集过程有所不同。这两种技术已广泛应用于多个研究领域，如辐射生物学、肿瘤细胞遗传学、辐射生物剂量回顾性估算、临床细胞遗传学、进化细胞遗传学以及比较细胞遗传学。

全身照射可诱导受照小鼠骨髓细胞产生大量染色体畸变。本方案已针对 体内 辐射暴露后骨髓细胞的有丝分裂阻滞，从受照小鼠后肢采集骨髓细胞，通过密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，制备中期细胞涂片，随后利用mFISH和SKY技术检测辐射诱导的稳定型染色体畸变。采用这些技术进行染色体显带可用于检测并评估多种病理生理状况的风险。
图1展示了具有代表性的小鼠第1、2和3号染色体正常与异常的中期细胞铺片。图2展示了正常与异常小鼠中期染色体的光谱核型分析。这些结果表明，电离辐射可在增殖的小鼠骨髓细胞中诱导染色体间的稳定型畸变，而骨髓细胞主要由负责自我更新并分化为多种细胞类型的干细胞和前体细胞组成。研究表明，干细胞和前体细胞中的细胞遗传学改变与多种临床疾病（包括癌症）相关，并被认为是疾病严重程度和总体生存率的最强预测指标。因此，可以合理推断，电离辐射诱导的染色体间稳定型畸变可能导致癌症发生...

本实验方案描述了多重荧光技术的应用价值 原位 杂交（mFISH）和光谱核型分析（SKY）在识别小鼠全身照射后骨髓细胞中染色体间稳定畸变中的应用

通过多重荧光检测染色体间稳定畸变 原位 辐射小鼠中的多重荧光原位杂交（mFISH）与光谱核型分析（SKY）

电离辐射（IR）可诱导产生多种稳定和不稳定的染色体畸变。不稳定的畸变表现为染色体形态发生显著改变……

该分子细胞遗传学方法的总体目标是观察经全身照射的小鼠骨髓细胞中的染色体间稳定畸变。该方法有助于回答辐射生物学领域中的一个关键问题，即全身辐射暴露诱导小鼠骨髓细胞中产生稳定染色体畸变的风险。该技术的主要优势在于，它能够实现对小鼠骨髓细胞中辐射诱导的稳定遗传损伤进行定向可视化，且这些损伤可在多代细胞分裂中持续传递。按照文本方案从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓并制备单细胞悬液后，小心地将细胞悬液叠加在等体积的骨髓单个核细胞分离液上。在室温下以400 × g离心30分钟。随后，小心收集中间白膜层，避免扰动其余各层，并将该溶液转移至新的15毫升离心管中。为制备中期细胞涂片，向含有血沉棕黄层的离心管中加入10毫升磷酸盐缓冲液。然后在室温下以400 × g离心5分钟。接着，小心移除上清液，并轻轻敲击离心管以打散细胞沉淀。然后加入 10 毫升 PBS，再次离心悬浮液。移除上清液时注意不要扰动细胞沉淀。将沉淀打散，并在轻柔且持续振荡的条件下，逐滴加入 4 毫升预热的低渗 0.075 摩尔氯化钾溶液。将细胞悬液在37摄氏度的水浴中孵育20分钟。然后向管中加入等体积的固定剂，通过轻轻颠倒管子混匀。离心管子，弃去上清液。然后，重悬细胞沉淀并加入新鲜固定液。重复离心及添加固定液共五次。将细胞重悬于 400 至 600 微升固定液后，取 30 微升固定后的细胞悬液滴加到预先清洗并润湿、倾斜成 45 度角的载玻片上，室温静置过夜，使载玻片完全自然干燥。为进行小鼠染色体mFISH显带，将含有中期细胞 spreads 的载玻片置于2X SSC溶液中，室温下孵育两分钟。随后，依次在70%、80%和100%乙醇中进行梯度脱水，每次乙醇处理两分钟。将40毫升变性溶液预热至70摄氏度，置于玻璃染色缸中，加热30分钟。然后将玻片转移至预热的溶液中，孵育样本1至1.5分钟，以使染色体变性。立即用冰冻的70%乙醇淬灭玻片2分钟，以终止变性过程并防止变性的染色体重新退火。随后使用乙醇梯度进行脱水，先用80%乙醇处理2分钟。接下来，将玻片放入100%乙醇中处理两分钟。然后在室温下将玻片完全干燥。为变性探针，先将制造商提供的探针混合物短暂离心，然后取10 µL转移至一个500 µL带盖离心管中，并将该管置于80 °C水浴中孵育7分钟。现在将含有变性探针的离心管放入37摄氏度的水浴中孵育10分钟。然后将探针混合物加到已变性的染色体玻片上。用18毫米×18毫米的盖玻片小心覆盖该区域，并轻轻按压盖玻片，以彻底去除任何可见的气泡。使用橡胶胶水密封盖玻片的四个边缘。然后将载玻片置于湿润的避光孵育盒中，在37摄氏度下孵育12至16小时。杂交完成后，小心去除橡胶胶水和盖玻片，将载玻片放入预热至74摄氏度的0.4X SSC溶液中孵育5分钟。然后将玻片转移至洗涤液三中，孵育两分钟。在玻片上加入20微升含DAPI复染剂的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片。用实验室纸巾轻轻按压盖玻片，以去除气泡和多余的封片剂。然后用指甲油密封盖玻片边缘。使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察载玻片。对于小鼠染色体的光谱核型分析，在探针与变性染色体杂交后，按照文本方案洗涤样本，向载玻片上加入80微升SY5染色试剂。将一块 24 × 60 毫米的塑料盖玻片置于样品上，于 37 摄氏度的湿化暗盒中孵育 40 分钟。将载玻片浸入盛有预热洗涤液的玻璃染色缸中三次，并在 45 摄氏度水浴中振荡孵育 2 分钟。重复洗涤三次。向样本中加入80微升SY5.5染色试剂，盖上24 × 60毫米的塑料盖玻片，在37摄氏度的湿化避光孵育盒中孵育40分钟。用预热的洗涤液3洗涤玻片三次，然后将玻片倾斜靠在纸巾上以去除多余液体。向样本中加入20微升抗荧光淬灭DAPI试剂，小心地加盖玻璃盖玻片，避免产生气泡。使用指甲油封固边缘，并用配备拍摄天体图像功能的落射荧光显微镜观察样品。该图显示了具有正常和异常小鼠1号、2号及3号染色体配对的代表性中期细胞铺展图像。此处为涉及1号染色体的稳定型畸变，其中1号染色体的一部分已整合到一条未标记的DAPI染色染色体中，而另一部分则形成了无着丝粒片段。在此示例中，二号染色体的一部分已整合到未标记染色体中。这种稳定的畸变涉及三号染色体。在此中期分裂相中，可见涉及所有三个标记染色体的稳定畸变。此处展示的是正常雌性小鼠的光谱核型分析示例。该图显示了涉及4号和12号染色体的稳定畸变。最后，该图中的稳定染色体畸变涉及7号和10号染色体。一旦掌握，该技术若操作得当，可在 48 至 72 小时内完成。在进行该操作时，需牢记只能使用处于增殖状态的细胞。在完成该操作后，还可结合其他方法（如染色带分析）来回答更多问题，例如受照细胞中是否存在染色体间的稳定畸变。该技术发展之后，为分子细胞遗传学领域的研究人员探索遗传畸变与各种疾病之间的关联铺平了道路。观看本视频后，您应能更清楚地了解如何检测染色体间的稳定畸变。请注意，使用秋水仙素时可能极为危险，因其具有致癌性，因此在进行本实验时，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

通过多色荧光跨染色体畸变稳定的检测<em&gt;原位</em&gt;杂交（渔业部）和光谱核型分析（SKY）的照射小鼠

本文介绍了在临床环境中应用于胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的单细胞FISH探针选择、卵裂球细胞核铺展技术、原位杂交以及信号判读方法。...

用于胚胎植入前遗传学诊断的荧光原位杂交技术

染色体组学：利用新型OctoChrome FISH检测技术同时检测全部24条人类染色体的数目与结构异常

染色体组学, 染色体异常, FISH检测, OctoChrome, 人类染色体, 数目变异, 结构重排, 分子细胞遗传学, 染色体分析, 荧光原位杂交

光谱核型分析（SKY）是一种先进的细胞遗传学技术，用于鉴定基因组和染色体异常。该技术利用染色体涂染探针，能够对所有染色体进行分类。SKY...

多囊肾病患者及小鼠染色体异常研究的光谱核型分析

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使用直接标记探针的稳定3D DNA FISH方法

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间期荧光 原位 多发性骨髓瘤骨髓涂片杂交

小鼠卵母细胞减数分裂染色体铺片的制备用于联会与重组的评估

了解多色荧光原位杂交和光谱核型分析技术，用于检测全身照射小鼠骨髓细胞中的染色体间稳定畸变。该方法可追踪辐射诱导的遗传损伤在多代细胞中的传播，为评估辐射遗传风险提供重要工具。

通过多重荧光检测染色体间稳定畸变原位辐射小鼠中的多重荧光原位杂交（mFISH）与光谱核型分析（SKY）

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