通过多色荧光跨染色体畸变稳定的检测原位杂交（渔业部）和光谱核型分析（SKY）的照射小鼠
January 11th, 2017
本方案描述了多重荧光原位杂交 （mFISH） 和光谱核型 （SKY） 在识别小鼠全身照射后骨髓细胞染色体间稳定畸变的有用性。
这种分子细胞生成方法的总体目标是观察暴露于全身照射的小鼠骨髓细胞中的染色体间稳定畸变。这种方法可以帮助回答放射生物学领域的关键问题，例如暴露于全身辐射的小鼠骨髓细胞中诱导稳定染色体畸变的风险。该技术的主要优点是它允许对辐射诱导的小鼠骨髓细胞中稳定的遗传损伤进行引导可视化，这些损伤可以通过许多细胞代传播。
从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓并根据文本方案制备单细胞悬液后，小心地将细胞悬液覆盖在等体积的骨髓单核细胞分离培养基上。在室温下以 400 x G 离心梯度 30 分钟。然后，小心地收集血沉棕黄层，不要干扰其余层，并将溶液转移到新的 15 毫升离心管中。
要制备中期细胞扩散液，请将 10 毫升 PBS 添加到含有血沉棕黄层的试管中。然后在室温下以 400 倍 G 离心管 5 分钟。接下来，小心地取出上清液并轻轻敲击试管以打碎细胞沉淀。
然后加入 10 毫升 PBS 并再次离心悬浮液。在不干扰细胞沉淀的情况下去除上清液。打碎沉淀，逐滴加入 4 毫升预热的低渗 0.075 摩尔氯化钾溶液，轻轻、持续摇晃。
将细胞悬液在 37 摄氏度下在水浴中孵育 20 分钟。然后，向试管中加入等体积的固定剂，并倒置试管轻轻混匀。离心管，去除上清液。
然后，打碎细胞沉淀并加入新鲜的固定剂。重复旋转并添加固定剂五次。将细胞重悬于 400 至 600 μL 固定剂中后，将 30 μL 固定细胞滴到以 45 度角倾斜的预清洁湿玻片上，让玻片完全风干过夜。
为了通过 mFISH 进行小鼠染色体绘制，将含有中期细胞扩散的载玻片置于 2X SSC 中，在室温下放置 2 分钟。然后，通过在 70%80% 和 100% 乙醇中连续洗涤 2 分钟来脱水玻片。将 40 毫升变性溶液放入玻璃 coplin 罐中预热至 70 摄氏度 30 分钟。
然后将玻片转移到预热的溶液中，并将样品孵育 1 至 1 1/2 分钟，使染色体变性。立即使用冰冷的 70% 乙醇淬灭玻片两分钟，以停止变性过程并防止变性染色体重新退火。然后使用从 80% 乙醇开始的乙醇系列对玻片脱水 2 分钟。
接下来，将玻片置于 100% 乙醇中 2 分钟。然后在室温下完全干燥载玻片。要使探针变性，请将制造商提供的探针混合物短暂离心，然后将 10 微升转移到 500 微升卡口盖离心管中，并将管在 80 摄氏度的水浴中孵育 7 分钟。
现在将装有变性探针的试管放入 37 摄氏度的水浴中 10 分钟。然后将探针混合物涂在带有变性染色体的载玻片上。用 18 毫米 x 18 毫米的玻璃盖玻片小心地覆盖该区域，并通过非常轻轻地将盖玻片压在载玻片上来消除任何可见的气泡。
使用橡胶水泥密封盖玻片的所有四个侧面。并将载玻片在 37 摄氏度的加湿室中避光孵育 12 至 16 小时。杂交后，小心地去除橡胶粘接剂和盖玻片，并将玻片放入预热的 0.4X SSC 中，在 74 摄氏度下放置 5 分钟。
然后将玻片转移到洗涤液 3 中 2 分钟。在载玻片上加入 20 微升含 DAPI 复染剂的抗淬灭封固剂，并用玻璃盖玻片盖住。使用实验室薄纸轻轻按压盖玻片，以去除任何气泡和多余的封片剂。
然后用指甲油密封盖玻片的边缘。使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察载玻片。对于小鼠染色体的光谱核型分析，在将探针杂交到变性染色体上并根据文本方案洗涤样品后，将 80 微升 SY5 染色试剂涂在载玻片上。
将 24 x 60 毫米的塑料盖玻片放在样品顶部，并在 37 摄氏度的加湿室中避光孵育 40 分钟。将玻片浸入装有预热洗涤液 3 的玻璃 coplin 罐中，并在 45 摄氏度的水浴中振荡孵育 2 分钟。重复洗涤 3 次。
将 80 μL SY5.5 染色试剂涂在样品上，用 24 x 60 毫米的塑料盖玻片覆盖，然后在 37 摄氏度的加湿室中避光孵育 40 分钟。使用预热的洗涤液 3 将玻片清洗 3 次，然后将玻片靠在纸巾上以倾斜位置以排出多余的液体。向样品中加入 20 微升抗淬灭 DAPI 试剂，并小心地将玻璃盖玻片放在顶部，不要引入任何气泡。
使用指甲油密封边缘，并使用配备用于捕获天空图像的落射荧光显微镜观察样品。该图显示了具有正常和异常小鼠染色体对 1、2 和 3 的代表性中期细胞扩散。这是一个涉及 1 号染色体的稳定畸变，其中 1 号染色体的一部分已整合到未绘制的 DAPI 染色体中，而另一部分已形成无着丝粒片段。
在这个例子中，二号染色体的一部分已经整合到一条未绘制的染色体中。这种稳定的畸变涉及 3 号染色体。在这个中期传播中可以看到涉及所有三个绘制染色体的稳定畸变。
这里显示的是正常雌性小鼠的光谱核型分析示例。该面板代表了涉及 4 号和 12 号染色体的稳定畸变。最后，该面板中的稳定染色体畸变涉及 7 号和 10 号染色体。
一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 48 到 72 小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住只能使用增殖细胞。遵循此程序和其他方法（如带内）可用于回答其他问题，例如受照射的细胞中是否存在染色体间稳定畸变。
该技术发展后，为分子细胞遗传学领域的研究人员探索遗传畸变与各种疾病之间的关联铺平了道路。看完这个视频后，你应该对如何确定染色体间的稳定畸变有一个更清晰的了解。不要忘记，使用秋水仙碱可能非常危险，因为它是致癌物，因此在进行此实验时应始终采取预防措施，例如戴手套。
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概览
本协议概述了多重荧光原位杂交（mFISH）和光谱核型分析（SKY）在识别小鼠全身照射后骨髓细胞的染色体间稳定畸变中的应用。这种方法在理解辐射暴露的遗传影响方面具有重要意义。
关键研究组成部分
科学领域
- 辐射生物学
- 细胞遗传学
- 分子生物学
背景
- 稳定的染色体畸变可由辐射暴露引起。
- 骨髓细胞对研究遗传损伤至关重要。
- 理解这些畸变有助于评估辐射风险。
- mFISH和SKY是用于可视化遗传变化的先进技术。
研究目的
- 观察骨髓细胞中的染色体间稳定畸变。
- 评估全身照射导致的稳定染色体损伤风险。
- 提供一种用于指导遗传损伤可视化的方法。
使用的方法
- 从小鼠股骨和胫骨中分离骨髓。
- 制备单细胞悬液。
- 使用骨髓单核细胞分离介质。
- 离心收集白色血细胞层进行分析。
主要结果
- 识别照射细胞中的稳定染色体畸变。
- 展示mFISH和SKY技术的有效性。
- 洞察遗传损伤在细胞代间的传播。
- 对理解辐射诱导的遗传风险做出贡献。
结论
- mFISH和SKY是研究辐射效应的有价值工具。
- 可以通过多次细胞分裂来跟踪稳定畸变。
- 本研究有助于评估辐射暴露的长期影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Detection of stable chromosomal aberrations in irradiated bone marrow cells provides critical data for assessing long-term genetic risks in preclinical radiation safety studies. The mFISH and SKY techniques enable visualization of inter-chromosomal translocations that persist across cell generations, supporting mechanistic de-risking in target validation pipelines. This approach enhances predictive confidence by linking radiation exposure to stable genomic alterations relevant to carcinogenesis and therapeutic response modeling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of radiation-induced genomic instability as a biomarker for DNA repair pathway efficacy.
- Operational Value: Provides a reproducible method to detect stable aberrations that may correlate with oncogenic transformation risk.
- Predictive Value: Supports assessment of compound-induced genotoxicity by visualizing chromosomal translocations in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of stable aberration frequency per cell, enabling dose-response modeling.
- Operational Value: Standardized chromosome painting protocols allow inter-laboratory comparability in genotoxicity screening.
- Scalability: Metaphase spread preparation and hybridization steps can be adapted for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks propagation of stable aberrations through multiple cell divisions, informing clonal evolution models.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of genetic damage in bone marrow-derived cell populations.
- Translational Continuity: Aberration patterns observed in mice can inform human-relevant radiation biodosimetry frameworks.
Pipeline & Workflow Integration
The mFISH and SKY methods integrate into preclinical safety assessment workflows following in vivo irradiation studies, bridging phenotypic observation with molecular cytogenetic analysis. These techniques are positioned post-exposure and pre-analytical validation to confirm genomic integrity of bone marrow-derived cells used in downstream functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding radiation-induced chromosomal rearrangements and their persistence in stem/progenitor cell compartments.
- Screening: Delivers assay-ready metaphase spreads with quantifiable aberration counts for compound library profiling.
- Analytics: Generates karyotype-specific imaging data and DAPI counterstained images enabling automated translocation scoring.
- Translational Research: Connects murine cytogenetic endpoints to human-relevant biomarkers of genomic instability in radiation-exposed tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytogenetic platform for evaluating genotoxic potential across radiation modifiers, radioprotectors, and DNA damage response inhibitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly visualizing stable inter-chromosomal exchanges undetectable by conventional staining.
- Operational Value: Enables standardization of chromosome preparation, hybridization, and imaging across multiple sites.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing evidence of chromosomal translocations that may indicate leukemogenic risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on low-aberration profiles in irradiated bone marrow models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromosome spreading, fluorescence microscopy, and spectral imaging analysis.
- Dependent on access to mFISH/SKY probe sets, epifluorescence or spectral microscopy systems, and antifade mounting reagents.
- Necessitates standardization of bone marrow isolation, metaphase arrest, and slide preparation across user groups.
- Adaptation to alternative tissue types (e.g., spleen, lymph nodes) may require optimization of hypotonic treatment and fixation steps.
- Limited to proliferating cells; quiescent or non-dividing populations require alternative methods to assess stable aberrations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Isolation of Bone Marrow Mononuclear Cells by Density Gradient Centrifugation and Preparation of Metaphase Cell Spreads
3:04
Mouse Chromosome Painting by mFISH
6:07
Spectral Karyotyping of Mouse Chromosomes
7:45
Results: Inter-chromosomal Stable Aberration Analysis by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization and Spectral Karyotyping
9:02
Conclusion
