Name: 钙化事件的表征在海洋Tubeworm使用实时光学和电子显微镜技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: 了解海洋管虫Hydroides elegans钙化事件的表征方法，结合活细胞光学显微镜与电子显微镜技术，实时监测幼虫变态过程中的细胞内pH和钙信号变化，揭示生物矿化的功能与材料特性。

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作者谨向克莱姆森广播制作公司致以诚挚感谢，J. Bright 负责音频录制，A. D. McQuiston 负责旁白，K. Murphy 负责音频润色，G. Spake 负责摄影，T. Messervy 负责平面设计，T. Messervy 和 E. Rodgers 负责视频剪辑。本研究的技术支持与科学指导得益于 S. Kawada、S. Kubo、J. Hudson、T. Darroudi、D. Mulwee、H. Qian、Y. W. Lam、M. B. Johnstone、C. Campanati、A. C. Lane 和 R. Dineshram 提供的宝贵建议。本研究由香港特别行政区研究资助局（HKSAR-RGC）提供的三项优配研究金资助（项目编号：705511P、705112P 和 17304914）。

1. 利用活体成像技术对目标发育阶段和组织进行筛选
<ol>
	<li>根据已报道的方法将海洋幼虫培养至具有变态能力6,7,9。将管状蠕虫幼虫在含有10 µM SNARF-1 AM的过滤海水（每毫升5条幼虫）中于避光条件下孵育过夜。用铝箔覆盖容器，以防止荧光探针发生光漂白。</li>
	<li>使用解剖显微镜观察幼虫。具有变态能力的管状蠕虫幼虫将向前游动，而非做环形运动。</li>
	<li>将具有变态能力的幼虫转移至60 µm的滤网中。将滤网紧压在培养皿上，形成良好密封以保留液体。迅速解除密封，释放并弃去含有荧光染料的海水，保留幼虫。</li>
	<li>用过滤的人工海水（FASW）清洗幼虫两次，注意过程中避免幼虫干燥。</li>
	<li>将10至20条幼虫置于底部为薄玻璃的培养皿中，加入含10-4 M异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）的5 mL FASW，用于观察变态过程。</li>
	<li>插入滤光片组以检测SNARF-1信号（通道1：激发510/25，发射580/30；通道2：激发510/25，发射640/35），并获取幼虫的微分干涉差（DIC）图像。</li>
	<li>将正在变态的幼虫置于20倍物镜下，调整快门时间（100–300 ms），确保能够清晰捕捉活体动物的图像。</li>
	<li>设置1 µm的步距以采集三个通道的Z轴层扫图像；在对活体动物成像时，应在移动至下一个Z轴层面之前，完成当前层面所有三个通道的成像，以实现通道间更好的相关性。</li>
	<li>从显微镜软件中将所有通道和层面的灰度图像导出为TIF文件：文件 | 导出 | 文件类型 TIF | 开始。</li>
	<li>使用ImageJ导入每个通道的图像序列：文件 | 导入 | 图像序列。
	<ol>
		<li>导入通道1 λ1em时，输入起始图像编号为3，增量为4。</li>
		<li>导入通道2 λ2em时，输入起始图像编号为4，增量为4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每一层进行逐像素的λ2em除以λ1em运算，生成复合图像（处理 | 图像计算器... | 640 nm图像文件 &#34;除以&#34; 580 nm图像文件），即640/580 nm比值图像。</li>
	<li>选择 图像 | 查找表 | 16色。</li>
	<li>选择 分析 | 工具 | 标尺条。</li>
	<li>检查不同层面，识别出异质性最显著的层面，该层面可提供关于内部pH分布的最有价值信息。</li>
	<li>利用640/580 nm比值与pH之间的关系，构建轮廓图以可视化内部pH的分布情况。</li>
</ol>
2. 内部pH的校准
<ol>
	<li>将约20条幼虫用10 µM SNARF-1 AM染色过夜后，加入尼日里菌素（nigericin）和KCl的储备液，配制成含50 µM尼日里菌素和150 mM KCl的溶液用于校准。</li>
	<li>用稀释的NaOH或HCl调节校准用人工海水（AFSW）的pH值，直至pH值达到约5.9，记录确切的pH值。使用玻璃电极pH计测量pH值，该pH计需使用基于海水的2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）和2-氨基吡啶进行校准9。</li>
	<li>将一条已染色的管栖蠕虫幼虫连同已知pH值的液体转移至干燥洁净的培养皿中，测量其在640 nm和580 nm处的信号强度。</li>
	<li>重复步骤2.2和2.3，再测定另外四个pH点（范围从5.9至9.9），这些pH值代表生理上相关的一系列数值。</li>
	<li>检查信号是否在整个动物体内分布均匀，这表明细胞内pH已与周围海水环境达到平衡。</li>
	<li>在五种不同海水pH环境下对管栖蠕虫幼虫进行成像，记录在640 nm和580 nm处的信号强度（即λ2exc和λ1exc），以&#34;灰度值&#34;表示。</li>
</ol>
3. 比值成像数据的分析
<ol>
	<li>在电子表格中输入从五个随机位置或感兴趣区域测得的灰度值。</li>
	<li>检查五点校准是否显示出线性关系，以指示细胞内pH值例如，方程如 y = 0.30x - 1.47；其中 y 为灰度值，x 为 pH 值，R² = 0.934。</li>
	<li>根据步骤1.13中测得的640/580 nm强度比，利用方程计算细胞内pH值。</li>
</ol>
4. 电子显微镜样品的保存、脱水与封片
<ol>
	<li>使用4%多聚甲醛固定目标生活史阶段。本研究中，在管状蠕虫附着后2-4天进行固定，并将样品保存在固定液中直至分析。</li>
	<li>在通风橱中，用1%四氧化锇水溶液对样品进行后固定，处理30分钟，以尽量减少脱水过程中的组织收缩。</li>
	<li>采用梯度乙醇系列对样品进行脱水：50%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟，85%乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，最后用无水乙醇处理两次，每次5分钟。</li>
	<li>在通风橱中，向样品加入体积比为1:1的乙醇与六甲基二硅氮烷（HMDS）混合溶液，待液体完全挥发。</li>
	<li>在通风橱中，向样品加入100% HMDS，待液体完全挥发。</li>
	<li>使用金刚石刀在培养皿上切出数道切口，围绕若干管状蠕虫。盖上皿盖后，将培养皿底部紧贴铝质载片，将其折断。</li>
	<li>在解剖显微镜下，寻找含有完整管状蠕虫的断裂碎片。</li>
	<li>在铝质载片上涂抹导电银漆，小心地将碎片固定于载片上。在塑料碎片边缘周围涂漆，以减少电荷积累。</li>
</ol>
5. 使用扫描电镜-能谱仪（SEM-EDS）定位富含钙的区域
<ol>
	<li>将样品台固定在样品 holder 上。</li>
	<li>使用显微镜附带的量规测量整个组件的高度，通过松开锁紧垫圈并旋转支柱来调节高度，直至样品达到标准高度，或输入已记录的高度值。</li>
	<li>向显微镜交换室中通入空气，打开交换室门。将样品 holder 滑至交换杆末端，然后关闭并抽空交换室。</li>
	<li>打开闸阀，将交换杆向显微镜腔室方向推入。将交换杆完全推入，使样品 holder 完全就位到显微镜载物台上。取出交换杆并关闭闸阀。</li>
	<li>输入样品尺寸，并将载物台移至“Home”位置，使样品位于电子束柱下方。</li>
	<li>在 VP-SEM 模式下将腔室真空度设为 20–30 Pa。将电子加速电压设为 20 kV，并开启高压。</li>
	<li>升高载物台，使样品工作距离为 10 mm。获取实时图像并定位样品。根据需要调节像散和聚焦，以优化图像质量。</li>
	<li>打开 SEM-EDS 程序，选择 EDS-SEM 模式选项。选择菜单中的 EDS 面扫描（map）运行选项。</li>
	<li>调整聚光镜和光阑设置，使在 SEM-EDS 程序中通过计数率表监测时，处理时间为 3 时的探头“死时间”约为 30%。每次更改束流设置后，均需运行束流和光阑对中程序。</li>
	<li>选择合适的放大倍数，使单个生物体充满整个视野。启用漂移校正功能，并在 SEM-EDS 程序中采集一幅图像。</li>
	<li>以 50–100 ms 的驻留时间，对充满整个视野的生物体进行面扫描数据采集。持续运行面扫描，直至数据清晰显示生物体内 Ca 的定位分布（约 15 分钟）。</li>
	<li>为获得定点定量数据，将处理时间改为 6，并调节电子探针，使“死时间”约为 30%。执行对中步骤，并根据需要优化图像。</li>
	<li>在 SEM-EDS 程序中选择“Point and ID”选项并采集另一幅图像。使用单点工具，点击 EDS 面扫描图中显示富含 Ca 的区域，以及 Ca 缺乏的区域作为对照。每个点扫描的实时时间为 30 秒。</li>
</ol>
6. 使用扫描电镜-电子背散射衍射技术鉴定富钙区域的晶体学信息
<ol>
	<li>从平面样品台上取下含有目标样本的塑料碎片，并使用银导电胶将其固定在45°预倾斜样品台的斜面上。</li>
	<li>将样品台拧紧在样品托上，并使样品台的倾斜面（含样品）朝向样品托前端。通过交换室将样品托插入显微镜腔体中。</li>
	<li>将腔体真空度设为30 Pa，电子加速电压设为20 kV。将样品送至电子柱下方，并将样品台倾斜25°，使样品表面与电子束法线方向夹角约为70°。开启高压。</li>
	<li>升高样品台至约18 mm的工作距离。使用轨迹球移动样品台并定位样本。增加放大倍数以框选感兴趣的特定结构。根据需要对电子束进行校准并优化图像。</li>
	<li>在SEM-EDS程序中打开EBSD模式。选择方解石（calcite）和文石（aragonite）作为目标物相。将EBSD相机推进至154 mm的距离。设置相机条件为1×1 binning模式，帧时间为100 ms。使用快速电子束扫描获取背景图像。 
	注意：根据电子探针的不同，可能需要调整帧率；请调节探针参数或相机帧率，以获得约90%的信号强度。</li>
	<li>在SEM-EDS程序中捕获一幅图像。使用点分析工具，在图像上某处点击以对该点进行电子束扫描。观察相机窗口，判断是否检测到菊池花样（Kikuchi patterns）。</li>
	<li>点击图像上的不同区域，扫描潜在的钙化位点，并在每个点观察相机窗口中是否存在菊池衍射带（Kikuchi bands）。如果出现衍射花样且与数据库中选定的任一物相匹配，则系统将自动完成标定。</li>
</ol>
7. 使用聚焦离子束-扫描电子显微镜制备透射电子显微镜样品
<ol>
	<li>使用铂或类似材料对制备好的 SEM 样品进行溅射镀膜，以形成导电层。
	<ol>
		<li>将先前固定、脱水并安装好的样品放入溅射镀膜仪的腔室内，打开电源开始抽真空。</li>
		<li>当腔室真空度达到 40 mTorr 或更低时，打开气体开关，增加氩气流量，使腔室压力升至 200 mTorr。调节气体流量，最终将腔室压力稳定在 80 mTorr。</li>
		<li>打开电压开关，升高电压至电流达到 15 mA。设定计时器，进行较长时间的镀膜（约 10 分钟），以形成较厚的镀层（约 60 nm），保护样品表面免受离子辐照损伤。调节电压以维持稳定的 15 mA 电流。</li>
		<li>完成后，关闭镀膜仪电源以释放真空，取出样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将已制备并完成溅射镀膜的样品基座旋紧到仪器样品台的 M4 螺纹柱上。用手拧紧后，松开锁紧螺母，然后旋转样品台支柱以调节组件高度。使用激光高度规，将高度调整至与仪器附带的标准件相差 1 mm 以内（视频中显示为 0.04 英寸）。</li>
	<li>关闭 FIB-SEM 中所有枪阀，然后向共心级空气锁中通入空气。待压力与环境平衡后，滑开空气锁，将样品台固定在换样杆的叉状端上。将换样杆末端的旋钮转至 &#34;lock&#34; 位置。关闭空气锁，并对空气锁腔室进行抽真空。</li>
	<li>当共心级空气锁被抽真空且压力与 FIB-SEM 腔室压力一致时，打开闸阀，通过推进换样杆插入样品。将换样杆完全推入，使样品台就位在仪器的共心级上，然后将换样杆旋转至 &#34;unlock&#34; 位置。将换样杆拉回并关闭闸阀。</li>
	<li>移动样品台，使样品位于离子束柱下方。打开闸阀，获取 FIB 的实时离子诱导二次电子图像。使用低倍率和快速扫描以最小化离子损伤。重置常规观察束的聚焦，并升高样品台 Z 高度，直至样品清晰对焦。此时样品处于交叉点位置，即离子束与电子束在同一位置聚焦。</li>
	<li>利用 SEM 的二次电子图像，通过轨迹球移动样品，定位样品中的感兴趣区域。感兴趣区域为先前 EDS 映射确定的富钙区域。必要时旋转样品台，使感兴趣特征与窗口框架对齐。</li>
	<li>在 FIB 窗口界面中，以 1,000X 放大倍数和额外 2X 数字变焦拍摄样品的快速快照，并在感兴趣区域上方绘制一个约 8 µm × 2 µm 的沉积模板。可根据不同尺寸特征调整沉积框的放大倍数。设置溅射条件：使用 40 kV、0.09 nA 的电子束，驻留时间为 0.5 µs，持续 5 分钟，进行碳沉积。</li>
	<li>完成碳沉积后，修改沉积条件，使用 40 kV、0.7 nA 的电子束进行钨沉积，持续 5 分钟，生成一个约 2–3 µm 的钨帽。</li>
	<li>使用观察束获取 FIB 快照，并使用微采样溅射工具在钨帽周围绘制四个方框的图案。上、下方框设为约 15 µm × 8 µm；右侧方框为 10 µm × 5 µm，左侧方框为 6 µm × 5 µm，或足够大以包围感兴趣区域。
	<ol>
		<li>修改加工条件，使用 40 kV、19 nA 的电子束，驻留时间为 50 µs，每个方框扫描 3–4 帧，然后加工该图案。加工完成后，感兴趣区域连同保护性的 C 和 W 层将呈现为“岛”状结构，其顶部、底部和右侧相邻材料均已被去除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品台倾斜 58°，使样品表面垂直于电子束柱，同时相对于离子束柱呈陡峭角度。使用 FIB 定位样品背面的 &#34;island&#34;，并在 1,000X 放大倍数和 2–4X 数字变焦下拍摄快照。</li>
	<li>在样品 &#34;island&#34; 背面底部末端可见处，绘制一个约 15 µm × 2 µm 的溅射图案。使用 4 nA 的电子束加工 3 分钟，或直至电子束完全切穿样品 &#34;island&#34; 的底部。</li>
	<li>将共心级样品台从当前位置倾斜 -58°（恢复至零位）。在 FIB 界面中点击 &#34;Probe In&#34; 插入钨微采样探针。在样品台控制面板上选择 &#34;MS&#34;，并使用轨迹球将探针移至样品上方。</li>
	<li>以 1 kx 放大倍数获取 FIB 的实时图像，调整探针位置，使其尖端正对微样品钨帽的右侧上方。在观察 SEM 的实时二次电子图像的同时，使用样品台面板上的 Z 控制旋钮降低探针，直至其接触钨帽。接触完成后蜂鸣器将响起。</li>
	<li>使用 FIB 以 40 kV、0.01 nA 的电子束，在 1,000X 放大倍数和 2X 数字变焦下拍摄快照。使用沉积工具在探针尖端与微样品钨帽接触处绘制一个 2 µm × 2 µm 的方框。
	<ol>
		<li>设置条件：使用 40 kV、0.09 nA 的电子束进行钨沉积，持续 2 分钟，驻留时间为 0.5 µs，然后加工该图案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在微样品 &#34;arm&#34; 的左端（仍与主体样品相连处）绘制一个约 2 µm × 5 µm 的溅射图案。使用 40 kV、0.7 nA 的电子束加工 2 分钟，或直至蜂鸣声提示微样品已从主体样品上分离。</li>
	<li>使用 Z 控制旋钮提升带有微样品的探针，直至其完全脱离主体样品，然后收回探针。将共心级样品台移至“Home”或“Exchange”位置。</li>
	<li>将铜半网格放入侧向插入 holder 中，并将 holder 装入侧向插入样品台吹扫室。抽真空后插入侧向插入 holder，并将其设置为 FIB 位置。</li>
	<li>在样品台控制面板上按下“Side”，使用轨迹球在 FIB 监视器上显示半网格。移动至半网格的洁净区域，并使用 Z 旋钮将表面调至对焦清晰。</li>
	<li>按下“Probe In”插入探针，在样品台控制面板上按下“MS”，并使用轨迹球和 Z 旋钮将微样品定位在半网格上方。降低探针，直至微样品接触网格。</li>
	<li>在 FIB 上以 1,000X 放大倍数（2X 变焦）拍摄图像。使用沉积工具在微样品下侧绘制一个约 10 µm × 3 µm 的图案。使用 40 kV、0.7 nA 的电子束进行钨沉积，驻留时间为 0.5 µs，持续 3 分钟。</li>
	<li>使用溅射工具在探针尖端绘制一个 1 µm × 3 µm 的小图案。使用 40 kV、0.7 nA 的电子束，驻留时间为 3 ms，加工该图案，以切断探针与微样品的连接。探针自由后将其收回。</li>
	<li>在 5,000X 放大倍数下获取 FIB 图像，并在微样品顶部和底部各绘制两个 7 µm × 4 µm 的溅射图案，图案之间保留约 1 µm 的间隙。将图案居中，避免切割微样品的左右两侧。使用 40 kV、4 nA 的电子束，驻留时间为 3 µs，加工 2 分钟，设置扫描方向朝向微样品中心。</li>
	<li>使用 FIB 观察束在 5,000X 下再拍摄一张图像。将之前的溅射框调整为约 6.5 µm × 1 µm，使其更靠近，保留约 0.5 µm 的间隙，并使用 40 kV、0.7 nA 的电子束进行加工。</li>
	<li>将侧向插入样品台倾斜 0.5°，再获取一张 FIB 图像。将溅射框宽度调整为 6 µm。将上方图案置于微样品上侧并进行加工，使用 40 kV、0.7 nA 的电子束。倾斜 -0.5°，对下方溅射图案和微样品下侧重复操作。</li>
	<li>进一步将图案宽度减小约 0.5 µm。倾斜 0.5°，使用 40 kV、0.09 nA 的电子束溅射微样品上侧。在 -0.5° 倾斜下对下侧重复操作。</li>
	<li>将样品台倾斜 2.2°，在 10,000X 下获取 FIB 图像。将溅射图案调整为 5 µm 宽，并将电子束条件改为 5 kV、0.03 nA。将上方图案置于微样品上侧边缘处并进行加工。倾斜 -2.2°，对下侧和底部图案重复操作。</li>
	<li>重复 5 kV 研磨步骤，直至微样品达到电子透明状态（厚度约 100 nm）。完成后，关闭枪阀并取出侧向插入 holder。</li>
</ol>
8. 在透射电子显微镜上获取选区电子衍射图样
<ol>
	<li>为准备仪器进行分析，将两个杜瓦瓶中充满液氮，并将加速电压设置为 300 kV。</li>
	<li>使用聚焦离子束（FIB）完成样品制备后，从FIB-SEM中取出侧插式样品杆，调整销钉位置，使样品杆长度与300 kV透射电子显微镜（TEM）匹配。旋转样品杆尖端至正确的观察位置，并再次与标准TEM样品杆进行比对，以确保样品取向正确。
	<ol>
		<li>或者，将带有薄片样品的半网格从FIB-SEM样品杆上取下，并装入标准TEM样品杆中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品杆装入TEM的样品交换室并抽真空。每当向交换室通入空气时，务必确保仪器的电子枪阀门处于关闭状态。当交换室完成抽真空后，会发出可听见的警报声。顺时针旋转样品杆，并让真空将样品杆拉至第一个停止位置。</li>
	<li>等待仪器真空恢复后，打开电子枪阀门。重置聚焦和放大倍数，将放大倍数调至约10,000倍。</li>
	<li>使用对中旋钮将电子束移至荧光屏中心。收缩和扩展电子束，确保所有束流移动均为同心。根据需要调节聚光镜消像散器。</li>
	<li>逆时针旋转样品杆，让真空将样品杆完全拉入镜筒。使用样品台移动旋钮进行导航并定位样品。</li>
	<li>提高样品放大倍数，并调节Z轴高度，直至样品处于焦点位置。必要时使用光学目镜进行观察。</li>
	<li>插入相机并移除荧光屏。根据需要扩展电子束，以避免相机过饱和。调节聚焦和相机参数，然后开始采集以获取图像。</li>
	<li>如需获取衍射图样，首先将感兴趣区域置于中心。移除物镜光阑，插入衍射光阑。</li>
	<li>通过按下控制面板上的DIFF按钮切换至衍射透镜模式，并使用DIFF控制旋钮缩小电子束。</li>
	<li>必要时插入束流挡板，以防止衍射图样中心烧损相机或荧光屏。启动相机采集，以获取图样图像。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

活体光学成像是一种用于观察多细胞生物体内细胞事件的有效方法。本研究中，使用了细胞内pH和钙离子指示剂来检测矿化位点的离子流。在这些区域，需要主动的离子泵活动以提高pH值和Ca2+浓度，从而促进钙化过程2,3。当应用荧光分子研究生物体时，关键是要确保所使用的浓度具有可忽略的毒性，并能使生物体以符合生理状态的方式正常活动。较低的染色浓度毒性更小，但通常需要更长的染色时间10。在孵育期间应保持幼虫密度较低，以尽量减少染色过程中缺氧和代谢废物积累的影响。
在采用聚焦离子束/透射电子显微镜（FIB/TEM）方法研究特定局部区域之前，至关重要的是先利用分辨率较低的方法（如扫描电镜-能谱分析（SEM-EDS）和扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD））对目标生命阶段和组织进行初步筛选。在背散射电子模式下观察样品，可实现对相对元素组成的可视化，其中较亮的对比度对应于较重的原子量<sup class="xref...

生物矿化是一系列复杂的过程，连接着多种细胞活动，最终形成高度有序的矿物1。挑战在于结合光学显微镜和电子显微镜技术，对动态的细胞过程和复杂的矿物结构进行表征。细胞内pH值升高有利于CaCO3晶体的形成，因此，确定pH值升高的生命阶段，可揭示钙化最可能发生的时间2,3。
龙介虫科（Serpulidae）的管虫是海洋中常见的钙化生物4。它也是海洋研究中常用的无脊椎动物模型，尤其在生物污损研究中应用广泛5,6。本研究观察了生物矿化过程中矿化区室内钙化的过程。这一快速的变态过程包括碳酸钙结构的形成7,8。
我们展示了如何对管栖蠕虫进行体内pH值测量，以及如何筛选与钙化相关的生命阶段和组织。在确定了感兴趣的生命阶段后，可利用电子显微镜方法对负责钙化的组织进行更高分辨率的表征。通过荧光显微镜，我们确定了变态诱导后碳酸钙出现所需的时间。随后，利用扫描电镜-能谱仪（SEM-EDS）对相似的生命阶段进行观察，以分析元素组成的分布情况，并采用两种不同的电子显微镜方法——即扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD）和聚焦离子束-透射电子显微镜（FIB-TEM）——对沉积的矿物进行分析。

<table><tbody><tr><td>六甲基二硅氮烷&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16700(EM)</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 2% 水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19192</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHZ1124</td><td></td></tr><tr><td>尼日尔菌素，游离酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 直径培养皿，孔径 27 mm，玻璃 0 号，未包被</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D110400</td><td></td></tr><tr><td>5-(和-6)-羧基 SNARF-1 乙酰氧甲基酯，乙酸盐</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-1271</td><td></td></tr><tr><td>BDH 氯化钾，ACS 级</td><td>VWR</td><td>BDH0258-500G</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&lt;br/&gt; 试剂级，结晶状</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>1 M 盐酸溶液，用于容量分析</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>083-01095</td><td></td></tr><tr><td>0.05 M 氢氧化钠溶液，用于容量分析</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>199-02185</td><td></td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>FASW</td><td>Iwaki Co. Ltd.</td><td>Rei-sea Marine</td><td></td></tr><tr><td>混合纤维素酯膜；直径 47 mm，孔径 0.45 &amp;micro;m</td><td>ADVANTEC</td><td>A045A047A</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>051-00476</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液用人工海水</td><td></td><td></td><td>依据 DOE (1994) 的 SOP06，cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>197-03345</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>089-08415</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基吡啶</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>011-02775</td><td></td></tr><tr><td>Orion 5-star Plus pH 计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrpHecT ROSS 微型复合 pH 电极 8220BNWP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision，版本 4.6，Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRTEM H500</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU6600 VPSEM</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB5000 聚焦离子束与电子束（FIB-SEM）系统</td><td>Hitachi&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用活体光学与电子显微技术表征海洋管栖蠕虫中的钙化事件

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

表征生物碳酸钙生成的首个事件需要结合多种显微技术。首先，可通过活细胞显微镜随时间观察细胞内pH分布和钙离子情况。这有助于确定具有研究特征的生命阶段和组织，以便进一步开展电子显微镜研究。通常，目标生命阶段和组织的pH值和钙信号较高。
本文以 H. elegans 为例，介绍一种利用扫描电子显微镜（SEM）检测生物样本中碳酸钙结构存在的实验方案，结合能量色散X射线光谱（EDS）可视化元素组成，利用电子背散射衍射（EBSD）确定晶体结构的存在，并通过透射电子显微镜（TEM）分析材料的组成与结构。在本方案中，采用聚焦离子束（FIB）技术制备适合TEM分析的样品。由于FIB是一种具有位点特异性的技术，我们展示了如何利用前述技术获得的信息来定位感兴趣区域，即钙信号最强的区域。

以下是关于管虫变态过程中钙化现象的一些观察结果。图1显示，变态后，领部区域附近的pH值高于其他组织。图2i显示一只钙（Ca）分布均匀的管虫，表明尚未开始显著的钙化事件；图2ii显示一只经历了较长时间钙化的管虫，表明钙化过程已超过本研究关注的时间点；图2iii显示一只处于本研究关注钙化阶段的管虫，被选中用于进一步分析，以明确负责矿化的组织。图3显示，较高的pH值与钙黄显色染色和扫描电镜-能量色散X射线谱（SEM-EDX）图谱中更强的钙离子信号相关联。基于这些观察结果，针对所关注生活阶段的组织，采用空间分辨率更高、定位更精确的技术——扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD）进行了进一步观察。在确定矿物相后，图4展示了利用聚焦离子束（focused ion beam）将目标材料切割并提取出来，用于透射电子显微镜（TEM）及选区电子衍射分析，以确认该矿物的晶体结构。
...

我们展示了多种显微技术的应用，这些技术可用于观察管虫Hydroides elegans的钙化过程，并定位及表征其最初形成的钙化物质。活体显微观察与电子显微技术结合使用，以提供研究生物矿化过程中重要的功能与材料信息。

表征碳酸钙生物形成的首个事件需要结合多种显微技术。首先，细胞内pH……

本实验的总体目标是通过结合光学显微镜和电子显微镜方法，确定钙化事件的发生位置及其结构。该目标通过在变态过程中监测活体幼体管状蠕虫来实现，因为变态阶段是可发生钙化的生命阶段，可利用对细胞内pH值和钙信号敏感的荧光指示剂进行检测。细胞内pH成像使我们能够研究在钙化过程中质子进入和离开细胞质的浓度变化。首先，对海洋管状蠕虫的成熟游泳幼虫进行细胞内 pH 成像，将幼虫用细胞内 pH 指示染料 SNARF-1 AM 染色。随后，将幼虫转移至含有 IBMX 的海水培养皿中，该培养皿带有薄玻璃观察窗，并将其置于荧光显微镜下，用波长为 488 纳米的光照射，该波长被染料吸收。收集染料在 580 纳米和 640 纳米处的发射光信号。通过这两个发射波长信号的比值，可计算出细胞内 pH 值。光学显微镜可帮助我们识别与较高pH水平相关的时间点和组织区域，这是确定后续分析所需时间点的第一步。第二步是在相关时间点使用固定剂保存管栖蠕虫，以用于电子显微镜观察。利用扫描电镜-能谱仪（SEM-EDS）映射钙信号，确定新矿化的生活阶段。随后，使用扫描电镜/电子背散射衍射（SEM/EBSD）对钙信号较强的区域进行筛选，以确认结晶矿物的存在。最后，采用聚焦离子束切割出矿物，并制备透射电镜（TEM）观察用的薄片。 本部分用于获取选区电子衍射图样。与体相X射线衍射光谱等传统测试方法相比，该技术的主要优势在于能够直接观察到通过光学显微镜和电子显微镜方法所观察到的特定结构，因此可直接在时间和空间尺度上研究独立的钙化事件。当使用钙离子和细胞内pH指示剂研究钙化过程时，我们能够确定这些相关生理事件发生的时间尺度。在正确的时间保存样本对于成功的扫描电镜（SEM）分析至关重要。当寻找生物矿化最初事件时，可使用扫描电镜/能量色散X射线光谱（SEM/EDX）来筛查钙元素的分布情况。钙含量较高的区域可能表明存在碳酸钙，但只有通过X射线衍射图谱才能确认其具有晶体结构。此类信息可通过电子背散射衍射（EBSD）和透射电子显微镜（TEM）获得。电子背散射衍射是一种晶体学表征技术，只要显微组织和电子反向散射角满足布拉格衍射条件，即可用于鉴定单晶或多晶材料。通常，在样品倾斜70度角的情况下，收集抛光样品上产生的背散射电子，并获得晶粒或晶体取向图谱。对于未经抛光的样品，由于并非所有表面区域都满足EBSD角度要求，因此从这些不平整表面生成此类图谱十分困难。然而，只要满足EBSD角度要求，即使在这些不平整表面上，仍可以以点扫描模式采集Cacucci衍射图样。该衍射图样能够明确证实结晶矿物的存在。我们的方法直接且快速，可推广应用于其他矿化组织。此处采用聚焦离子束制备微小样品，这也是制备透射电镜切片的一种非常直接的方法。为观察变态过程，实验室中培养管状蠕虫约五天。有附着能力的幼虫将向前游动，而非做环形运动，这表明它们已准备好进行变态。将有附着能力的幼虫置于含有荧光染料的海水中，用铝箔覆盖容器以防止荧光淬灭，并将样品在室温下避光孵育过夜。将管状蠕虫幼虫在尼龙筛网上进行冲洗，筛网可截留幼虫而允许溶液通过。用过滤的海水洗涤幼虫两次，以去除多余的染料溶液。按压过滤器使其紧贴培养皿，形成严密密封，然后松开密封以弃去洗涤液。注意避免幼虫干燥。然后将10至20只幼虫分别放入含IBMX的薄底玻璃培养皿中，并在成像前盖好培养皿。接着，插入合适的滤光立方体及相应的二向色镜，以检测荧光信号。优化快门时间，使其足够快以捕获活体生物的图像。接下来，在Z-栈选项中选择光学切片参数，上下移动显微镜载物台以确定图像采集的起始和终止位置。设置层与层之间为1微米的距离。成像完成后，将所有数据导出为灰度TIF文件。可通过选择“文件”菜单中的“导出”功能实现。确保文件类型显示为TIF图像，然后点击“开始”。每个Z-Stack层中各通道的灰度图像将位于同一图像文件夹中，可供图像分析使用。最后，使用ImageJ为每个荧光通道生成一幅复合图像。以下JoVE视频演示了如何进行细胞内pH值的校准与测量。使用交联固定剂保存正在经历变态的管状蠕虫，固定液为海水中含4%多聚甲醛的溶液。只需将一份16%多聚甲醛与三份海水混合，室温下固定过夜。弃去初次固定液，再将样本置于1%四氧化锇水溶液中复固定30分钟，以进一步稳定组织结构。务必在通风橱中操作，并准备分别贴有清晰标签的废液瓶，用于收集甲醛和四氧化锇。接着，使用梯度乙醇系列对样品进行脱水处理，每次更换乙醇后静置五分钟。下一步是用乙醇与六甲基二硅胺烷（HMDS）按1:1比例配制的溶液对样品进行脱水，用量以刚好覆盖样品为宜。在通风橱中等待样品完全蒸发干燥，然后使用纯HMDS重复上述步骤。为获得样品的可控断裂，用钻石刀片在培养皿上划动，划出包含若干个体的三角形切口。盖上培养皿后，将其紧贴铝质样品台，轻轻按压以实现可控断裂。使用解剖显微镜观察，仔细挑取含有几条完整管状蠕虫的断裂碎片。用银漆将样品固定在扫描电镜样品台上，并用银漆沿边缘涂覆以减少电荷积累。样品现已准备好用于扫描电镜-能谱分析成像。将样品连同样品台插入显微镜中。调整样品方向，将其置于电子柱下方。在VP SEM模式下分析样品。根据需要优化焦距和像散。选择合适的放大倍数，使单个生物体充满整个视野。通过采集整个视野范围的元素分布图，分析样品中钙的分布情况，持续扫描15分钟或更长时间，直至数据清晰显示钙在生物体内的定位。为了获得感兴趣区域的点定量结果，请使用单点工具选择“点识别”选项。点击感兴趣区域以执行扫描。通过以递减的放大倍数拍摄一系列图像，仔细记录位置信息。为进行EBSD样品制备，将样品从平整的SEM样品台取下，并使用银漆将其粘附至一个预先倾斜45度的样品 stub 上。利用参考的SEM图像定位目标动物及需要检测的具体区域。将样品台倾斜25度，使样品表面与电子束的夹角约为70度。升高样品台。在 AZtec 软件中选择 EBSD 模式。选择文石作为目标相。插入EBSD相机，设置相机条件以获得约90%的信号强度。使用快速束斑扫描获取背景图像，然后在Aztec软件中采集一幅图像。利用点分析（Spot Analysis）工具，点击样品中显示较高钙信号的位置，进行扫描以检测是否出现Cacucci衍射花样。如果存在衍射花样，并且与数据库中任一选定物相匹配，则系统将自动进行标定。在进行聚焦离子束微区样品制备之前，需通过溅射镀膜在制备好的SEM样品表面覆盖一层铂以加以保护。将样品插入FIB-SEM腔室，调整样品位置，并获取实时的离子束诱导二次电子图像。根据之前通过EDS映射在EBSD中确定的参考图像，定位目标区域。必要时旋转样品台，使目标特征与窗口框架对齐，调整放大倍数以显示包含目标特征的区域，然后定义一个用于沉积碳和钨的方框区域。拍摄一张FIB快照，随后在钨帽周围绘制四个方框的图案，以界定微采样的位置。然后将样品台倾斜至58度，从微样品底部进行切割。将样品台回正至0度，插入钨制微采样探针，并将其下降至与样品接触。通过在探针尖端与钨涂层之间沉积钨，将钨探针与样品连接，然后进行最终切割，使微样品与其余部分分离，并将附着微样品的探针抬起。将透射电镜铜半网格放入侧插式样品杆中，降低钨探针直至微样品接触透射电镜网格。继续对微样品进行铣削，直至其达到电子透明。在进行透射电镜分析前，将两个杜瓦瓶中充满液氮，并将加速电压设为 300 千伏。将带有载网的半网格放入标准透射电镜样品 holder 中。使电子束在荧光屏上居中，收缩并扩展电子束，确保所有束流移动均为同心。使用载物台移动旋钮导航并定位样品，增加样品放大倍数，并调节 Z 轴高度直至样品聚焦清晰。根据需要使用光学目镜。插入相机并移除磷光屏。必要时扩展电子束，以避免相机过饱和。调节焦距和相机参数以获取图像。为获得衍射花样，需将感兴趣区域移至中心，移除物镜光阑并插入衍射光阑，然后切换至衍射透镜模式。插入挡板以防止衍射图样中心烧毁相机或磷屏。采集图样图像用于晶体学分析。以下是管状蠕虫变态过程中钙化过程的一些观察结果。在IBMX诱导变态后，管虫的pH值升高，且在31小时时细胞内pH开始超过8。与钙化相关的组织是领部区域。扫描电镜-能谱（SEM-EDS）信号图显示，第一天的管虫体内钙呈均匀分布，表明钙化过程尚未开始。变态诱导两天后，一些管虫已过度钙化，不再适合用于观察新形成的钙化物质。在本示例所用的管虫样本中，钙化仍处于早期阶段，因此钙含量测定有助于确定用于表征矿物质存在的目标区域。通过扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD）检测发现，具有强钙信号的局部区域同时呈现出文石的晶体结构。利用聚焦离子束技术制备样品用于透射电子显微镜观察，并对文石矿物的衍射图样进行了更详细的晶体学分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在多细胞生物体中定位矿化事件。当光学显微镜与电子显微镜结合使用时，我们可以深入理解钙化过程中的生理与材料特性。

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