钙化事件的表征在海洋Tubeworm使用实时光学和电子显微镜技术

该程序的总体目标是通过结合光学和电子显微镜方法确定钙化事件的位置和结构。这是通过在过程中监测活的幼虫管虫来实现的，是导致钙化的生命阶段，可以使用对细胞内 pH 值和钙信号敏感的荧光指示剂进行检测。细胞内 pH 成像使我们能够研究钙化过程中进出细胞质的质子浓度。

首先，在海洋管虫幼虫中进行细胞内 pH 成像，用细胞内 pH 指示剂染料 SNARF-1 AM 对有能力的游泳幼虫进行染色。然后将幼虫转移到装有海水的 IBMX 培养皿中，并带有薄玻璃观察窗，并放置在荧光显微镜上，在那里它们被波长为 488 纳米的光照射，被染料吸收。收集染料的 580 纳米和 640 纳米发射。细胞内 pH 值可以根据这些值的比率计算得出。

光学显微镜使我们能够识别与较高 pH 值相关的时间和组织区域。这是确定感兴趣时间点以进行进一步分析的第一步。在第二步中，在电子显微镜的相关时间点用固定剂保存管蠕虫。

使用 SEM-EDS 钙信号映射确定新的矿化生命阶段。然后使用 SEM/EBSD 筛选具有高钙信号的区域，识别结晶矿物的存在。最后，使用聚焦离子束切出矿物，制备薄片用于 TEM 观察。

此截面用于获得选择性区域衍射图样。该技术或体 X 射线衍射光谱等传统测试方法的主要优点是，它可以直接观察通过光学和电子显微镜方法观察到的特定结构，因此，可以在时间和空间水平上直接研究离散的钙化事件。当使用钙和细胞内 pH 指示剂研究钙化时，我们可以确定这些相关生理事件的时间尺度。

在正确的时间保存样品对于富有成效的 SEM 分析至关重要。当寻找生物钙化的第一个事件时，SEM/EDX 可用于筛选钙的元素分布。钙含量较高的位置可能表明存在碳酸钙，但是，只有 X 射线衍射图的存在才能确认存在晶体结构。

可以使用 EBSD 和 TEM 获得这些信息。电子背散射衍射是一种晶体学表征技术，用于识别晶体或多晶材料，只要微观结构和电子 REM 角满足布拉格衍射条件即可。通常，背散射电子以 70 度角的倾斜收集在带有晶粒或晶体取向图的抛光样品上。

对于未抛光的样品，从这些不平整的表面生成这样的面分布图是很困难的，因为并非所有的服务系列都满足 EBSD 角度要求。然而，只要满足 EBSD 角度要求，以点 IG 的形式，仍然可以从这些不平整的表面收集卡库奇衍射图。卡库奇衍射图可以明确确认结晶矿物的存在。

我们的方法直接而快速，可以暗示其他矿化组织。在这里，使用聚焦离子束制造微样品，这也是制备 TEM 切片的一种非常直接的方法。为了检查过程，将管虫在实验室中培养约五天。

有能力的幼虫会向前游泳，而不是圆周运动。这意味着他们已经准备好蜕变了。在海水中的荧光溶液中孵育有能力的幼虫，用箔纸覆盖容器以防止光漂白，并将动物孵育过夜。

管虫幼虫用尼龙网清洗，尼龙网将保留幼虫，但允许溶液通过。用过滤的海水洗涤幼虫两次，以去除多余的染料溶液。将过滤器压在培养皿上以形成紧密密封，然后松开密封以丢弃洗涤液。

注意不要使幼虫变干。然后将 10 到 20 只幼虫中的每一只放入装有 IBMX 的薄玻璃底培养皿中，并盖上培养皿直至成像。接下来，将合适的滤光片立方体与适当的二向色镜插入以检测荧光信号。

优化快门时间，使其足够快，以便为生物体捕获图像。接下来，在 Z-Stack 选项上选择光学切片参数，上下移动显微载物台以定义图像采集的开始和停止位置。设置图层之间的 1 微米距离。

成像后，将所有数据导出为灰度 TIF 文件。这可以通过选择 File （文件）、Export （导出） 来执行。确保文件类型显示为 TIF 图像，然后单击 Start 开始.

Z-Stack 的每一层中每个通道中的灰度图像将位于同一图像文件夹中，可用于图像分析。最后，使用 ImageJ 为每个荧光通道生成合成图像。以下 JoVE 视频演示了如何进行细胞内 pH 值的校准和测量。

使用 4% 多聚甲醛的海水溶液，使用交联固定剂保存正在的管虫。只需将一份 16% 多聚甲醛混合到三份海水中，然后过夜固定即可。处理初级固定剂，并在 1% 四氧化锇水溶液中重新固定标本 30 分钟，以进一步稳定组织结构。

确保在通风橱中工作，并有单独的废瓶，这些废液瓶有明确的标签，准备甲醛和四氧化锇。接下来，使用分级乙醇系列对样品进行脱水，两次更换之间间隔 5 分钟。下一步是用乙醇和 HMDS 的 1：1 溶液对样品进行脱水，刚好足以覆盖样品。

等待样品在通风橱中蒸发干，然后用纯 HMDS 重复该过程。为了使样品形成受控的断裂，将金刚石刀片靠在培养皿上，将几个个体包围起来，进行三角形切割。盖上培养皿，将培养皿靠在铝桩上，轻轻按压以形成受控断裂。

使用解剖显微镜观察，小心地拾取包含一些完整管虫的骨折块。使用银漆，将样品粘在 SEM 样品架上，在边缘涂上银漆以减少充电。样品现在已准备好进行成像以进行 SEM-EDS 分析。

将样品架中的样品插入显微镜。定位样品并将样品放在电子柱下方。在 VP SEM 模式下分析样品。

根据需要优化焦点和散光。选择放大倍率，使单个生物体充满整个视野。通过获取整个视野图来分析样品上钙的元素分布，运行图谱 15 分钟或更长时间，或者直到数据显示钙在生物体内的明显定位。

要获取感兴趣区域的点量化，请使用"单点"工具选择"点 ID"选项。单击感兴趣的区域以执行扫描。通过以递减的放大倍数捕获一系列图像来仔细记录位置。

要制备用于 EBSD 的样品，请从扁平的 SEM 支架中取出样品，并使用银漆将其粘贴到 45 度预倾斜的存根上。使用参考 SEM 图像定位感兴趣的动物和要检查的动物的确切区域。将载物台倾斜 25 度，使样品表面现在与电子束成大约 70 度角。

抬高舞台。在 AZtec 软件中选择 EBSD 模式。选择 Aragonite 作为感兴趣的相。

插入 EBSD 相机，设置相机条件以获得约 90% 的信号使用快速光束光栅，获取背景，然后在 Aztec 中捕获图像。使用"点分析工具"，单击显示较高钙信号的样品位置。扫描以查看是否检测到 Cacucci 模式。

如果存在模式并且与数据库中的任何选定阶段匹配，则将自动为它们编制索引。在使用聚焦离子束进行微量样品制备之前，通过溅射涂层用铂层保护制备的 SEM 样品。将样品插入 FIB SEM 室，定位样品并获取实时的离子诱导二次电子图像。

从参考图像中找到感兴趣的区域，如之前在 EBSD 中通过 EDS 面分布验证确定的那样。根据需要旋转载物台，使感兴趣的特征与窗口的框架对齐，调整放大倍率以显示区域以适应感兴趣的特征，然后定义一个框来沉积碳和钨。捕获 FIB 快照，然后在钨帽周围绘制四个框的图案，以定义微采样的位置。

然后将载物台倾斜 58 度并切开微量样品的底部。将载物台向后倾斜至零，插入钨微量采样探针，然后将其降低直至接触样品。通过在探针尖端和钨涂层之间沉积钨来连接钨探针和样品，然后进行最后切割，将微样品与岛的其余部分分离，并用附着的微样品抬起探针。

将 TEM 铜半网格放入侧入支架中，降低钨探针，直到微量样品接触 TEM 网格。微样品进一步研磨，直到它变成电子透明。在 TEM 分析之前，用液氮填充两个杜瓦瓶，并将加速电压设置为 300 kV。

将带有连接薄片的半网格放入标准 TEM 支架中。将光束置于荧光屏上的中心，收缩和扩展光束，并确保所有光束运动同心。使用载物台移动旋钮导航和定位样品，增加样品的放大倍率并调整 Z 高度，直到样品聚焦。

根据需要使用光学目镜。插入相机并取下荧光屏。根据需要扩展光束，以避免相机过度饱和。

调整焦距和相机参数以捕获图像。要获得衍射图样，请将感兴趣的特征居中，移除物镜孔径并插入衍射孔径。更改为 Diffraction Lens 模式。

插入消光剂以防止衍射图案的中心烧毁相机或荧光屏。捕获花样图像以进行晶体学分析。以下是对管虫过程中钙化过程的一些观察。

在 IBMX 刺激后，管虫的 pH 值增加，细胞内 pH 值在 31 小时开始升高超过 8。与钙化相关的组织是衣领区域。SEM-EDS 信号上的地图显示，第一天管虫的钙分布均匀，表明钙化过程尚未开始。

刺激两天后，一些管虫已经钙化过多，不再适合观察新钙化的物质。在管虫标本中，例如本例中使用的标本，钙化仍处于早期阶段，因此钙定量有助于确定表征矿物存在的感兴趣位置。当使用 SEM-EBSD 检查时，具有强钙信号的局部区域也具有文石的晶体结构。

使用聚焦离子束制备用于 TEM 的样品，并以更详细的晶体学细节分析了文石矿物的衍射图样。观看此视频后，您应该对如何在多细胞生物体中定位矿化事件有很好的了解。当光学和电子显微镜一起使用时，我们可以获得对钙化过程的生理和材料高度理解。