利用活体光学与电子显微技术表征海洋管栖蠕虫中的钙化事件

本实验的总体目标是通过结合光学显微镜与电子显微镜方法，确定钙化事件的发生位置及其结构。该目标通过在变态阶段——即能够被检测到钙化的幼体管虫生命阶段——实时监测活体幼虫管虫来实现，其中使用对细胞内 pH 和钙信号敏感的荧光探针进行检测。细胞内 pH 成像使我们能够研究在钙化过程中质子进出细胞质的浓度变化。

首先，对海洋管状蠕虫的成熟游泳幼虫进行细胞内pH成像，将幼虫用细胞内pH指示染料SNARF-1 AM染色。随后，将幼虫转移至含有IBMX的人工海水培养皿中，该培养皿带有薄玻璃观察窗，并将其置于荧光显微镜下，用波长为488纳米的光照射，该波长的光可被染料吸收。收集染料在580纳米和640纳米处的发射光信号。通过这两个发射波长信号的比值，可计算出细胞内pH值。

光学显微镜使我们能够识别与较高pH水平相关的时间点和组织区域。这是确定进一步分析所需时间点的第一步。第二步是在相关时间点使用固定剂保存管栖蠕虫，以用于电子显微镜观察。

通过扫描电镜-能谱仪（SEM-EDS）钙信号图谱识别新矿化的生活阶段。随后利用扫描电镜/电子背散射衍射（SEM/EBSD）对钙信号较强的区域进行筛选，以确定结晶矿物的存在。最后，采用聚焦离子束切割出矿物，并制备透射电镜（TEM）观察用的薄片。

本部分用于获取选区电子衍射图样。与体相X射线衍射光谱等传统测试方法相比，该技术的主要优势在于能够直接观察到通过光学显微镜和电子显微镜方法所观察到的特定结构，因此可直接在时间和空间尺度上研究独立的钙化事件。当使用钙离子和细胞内pH指示剂研究钙化过程时，我们可以确定这些相关生理事件发生的时间尺度。

在正确的时间保存样本对于成功的扫描电镜（SEM）分析至关重要。当寻找生物矿化最初事件时，可使用扫描电镜/能量色散X射线光谱（SEM/EDX）来筛查钙元素的分布情况。钙含量较高的区域可能表明存在碳酸钙，但只有通过X射线衍射图谱才能确认其具有晶体结构。

此类信息可通过电子背散射衍射（EBSD）和透射电子显微镜（TEM）获得。电子背散射衍射是一种晶体学表征技术，只要显微结构和电子背散射角满足布拉格衍射条件，即可用于鉴定单晶或多晶材料。通常，在经过抛光的样品上以70度倾角收集背散射电子，并获得晶粒或晶体取向图。

对于未经抛光的样品，由于并非所有表面区域都满足EBSD角度要求，因此从这些不平整表面生成此类图谱较为困难。然而，只要满足EBSD角度要求，仍可通过点IG模式从这些不平整表面采集到Cacucci衍射图谱。该Cacucci衍射图谱可明确证实晶体矿物的存在。

我们的方法直接且快速，可推广应用于其他矿化组织。此处采用聚焦离子束制备微小样品，这也是制备透射电镜切片的一种非常直接的方法。为观察变态过程，管状蠕虫在实验室中培养了约五天。

有附着能力的幼虫会向前游动，而不是做环形运动。这表明它们已准备好进行变态。将有附着能力的幼虫置于含有荧光溶液的海水中，用铝箔覆盖容器以防止荧光淬灭，并将样品在室温下孵育过夜。

将管状蠕虫幼虫在尼龙网筛上冲洗，网筛可截留幼虫，同时允许溶液通过。用过滤海水洗涤幼虫两次，以去除多余的染料溶液。按压滤网至培养皿上，形成紧密密封，随后松开密封以弃去洗涤液。

注意避免幼虫干燥。将10至20只幼虫分别放入含IBMX的薄底玻璃培养皿中，盖上盖子直至成像。接着，插入合适的滤光片组及相应的二向色镜，以检测荧光信号。

优化快门时间，使其足够快以捕获活体生物的图像。接下来，在Z-栈选项中选择光学切片参数，上下移动显微镜载物台以确定图像采集的起始和终止位置。设定各层之间为1微米的距离。

成像后，将所有数据导出为灰度 TIF 文件。可通过选择“文件”菜单中的“导出”来完成此操作。确保文件类型显示为 TIF 图像，然后点击“开始”。

每个Z-Stack层中各通道的灰度图像将位于同一图像文件夹中，可供图像分析使用。最后，使用ImageJ为每个荧光通道生成一幅复合图像。以下JoVE视频演示了如何进行细胞内pH值的校准与测量。

使用交联固定剂固定正在经历变态的管状蠕虫，固定液为海水中含4%多聚甲醛的溶液。只需将一份16%多聚甲醛与三份海水混合，室温下固定过夜。弃去初次固定液，再将样本置于1%四氧化锇水溶液中复固定30分钟，以进一步稳定组织结构。

务必在通风橱中操作，并准备分别贴有清晰标签的废液瓶，用于收集甲醛和四氧化锇。接下来，使用梯度乙醇系列对样品进行脱水处理，每次更换乙醇后静置五分钟。随后一步是用乙醇与六甲基二硅胺烷（HMDS）按1:1比例配制的溶液对样品进行脱水，用量以恰好覆盖样本为宜。

在通风橱中等待样品完全蒸发干燥，然后使用纯HMDS重复上述步骤。为获得样品的可控断裂，用金刚石刀片在培养皿上划动，划出包含若干个体的三角形切口。盖上培养皿后，将其紧贴铝质样品台，轻轻按压以实现可控断裂。

在解剖显微镜下观察，小心挑取含有几条完整管状蠕虫的断裂碎片。用银漆将样品固定在扫描电镜样品台上，并用银漆沿边缘涂覆以减少电荷积累。样品现已准备好进行扫描电镜-能谱分析（SEM-EDS）成像。

将装有样品的样品台插入显微镜中。调整样品方向，将其置于电子柱下方。在可变压力扫描电镜（VP SEM）模式下分析样品。

根据需要优化焦距和像散。选择合适的放大倍数，使单个生物体充满整个视野。通过采集整个视野范围的元素分布图，分析样品中钙的分布情况；采集时间至少15分钟或更长，直至数据清晰显示钙在生物体内的定位。

为了获得感兴趣区域的点定量结果，请使用单点工具选择“点识别”选项。点击感兴趣区域以执行扫描。通过以递减的放大倍数拍摄一系列图像，仔细记录位置信息。

为进行EBSD分析准备样品时，将样品从平整的SEM载物台取下，并使用银漆将其粘附到一个预先倾斜45度的样品 stub 上。利用参考的SEM图像定位目标动物及需要检测的具体区域。将样品台倾斜25度，使样品表面与电子束的夹角约为70度。

升高样品台。在 AZtec 软件中选择 EBSD 模式。选择文石作为目标相。

插入EBSD相机，设置相机条件以获得约90%的信号强度。使用快速束斑扫描获取背景图像，然后在Aztec中采集一幅图像。利用点分析（Spot Analysis）工具点击样品中显示较高钙信号的位置，进行扫描以检测是否存在Cacucci衍射花样。

如果存在衍射花样，并且与数据库中任一选定物相匹配，则系统将自动进行标定。在进行聚焦离子束微区样品制备之前，需通过溅射镀膜法在制备好的SEM样品表面覆盖一层铂以加以保护。将样品插入FIB-SEM样品室，调整样品位置，并获取实时的离子束诱导二次电子图像。

根据之前通过EDS映射在EBSD中确定的参考图像，定位目标区域。必要时旋转样品台，使感兴趣特征与窗口框架对齐，调整放大倍数以显示足够容纳目标特征的区域，然后定义一个用于沉积碳和钨的方框区域。拍摄一张FIB快照，随后在钨帽周围绘制四个方框的图案，以定义微采样的位置。

然后将样品台倾斜至58度，从微样品底部进行切割。将样品台回正至0度，插入钨制微采样探针，再将其下降至与样品接触。通过在探针尖端与钨涂层之间沉积钨，将钨探针与样品连接，然后进行最终切割，使微样品与其余部分分离，并将附着微样品的探针抬起。

将透射电镜铜半网格放入侧插式样品杆中， lowering 钨探针直至微样品接触透射电镜网格。进一步铣削微样品，直至其达到电子透明。在进行透射电镜分析前，将两个杜瓦瓶充满液氮，并将加速电压设为 300 千伏。

将带有载网的半网格放入标准透射电镜样品 holder 中。使电子束在荧光屏中心对准，收缩并扩展电子束，确保所有电子束移动均为同心。使用载物台移动旋钮进行导航并定位样品，提高样品的放大倍数，并调节 Z 轴高度，直至样品聚焦清晰。

根据需要使用光学目镜。插入相机并移除磷屏。必要时扩展电子束，以避免相机过饱和。

调整焦距和相机参数以采集图像。要获取衍射图样，需将感兴趣特征置于中心，移除物镜光阑并插入衍射光阑。切换至衍射透镜模式。

插入挡板以防止衍射图样中心烧毁相机或荧光屏。拍摄图样图像用于晶体学分析。以下是管状蠕虫变态过程中钙化过程的一些观察结果。

在IBMX诱导变态后，管虫的pH值升高，细胞内pH在31小时时开始超过8。与钙化相关的组织是领部区域。扫描电镜-能谱（SEM-EDS）信号图显示，第一天的管虫体内钙呈均匀分布，表明钙化过程尚未开始。

变态诱导两天后，一些管虫已经过度钙化，不再适合观察新形成的钙化物质。在本示例所用的管虫样本中，钙化仍处于早期阶段，因此钙含量测定有助于确定用于表征矿物质存在的目标区域。使用扫描电镜-电子背散射衍射（SEM-EBSD）观察时，钙信号较强的局部区域也显示出文石的晶体结构。

利用聚焦离子束技术对样品进行透射电子显微镜（TEM）制样，并对文石矿物的衍射图样进行了更详细的晶体学分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在多细胞生物体中定位矿化事件。当光学显微镜与电子显微镜结合使用时，我们能够深入理解钙化过程中的生理与材料特性。