Name: 利用有机体培养评价小鼠前列腺皮细胞的分化能力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 了解小鼠前列腺类器官培养技术，用于研究上皮细胞分化机制。该方法结合免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像，为发育生物学和细胞生物学研究提供可靠的体外模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PDC 和 JMG 获得露丝·L·柯什斯坦国家研究服务奖 GM007185 的支持。JAD 获得美国国立卫生研究院下属国家普通医学科学研究所（R25GM055052，授予 T. Hasson）以及 Saul Martinez 奖学金的支持。ASG 获得 Spitzer 家族基金会基金和 Gill 捐赠基金的支持。本研究获得美国癌症协会（RSG-17-068-01-TBG）、美国国防部（W81XWH-13-1-0470）、Margaret E. Early 医学研究信托基金、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（P50CA092131/UCLA 前列腺癌 SPORE 项目）、Rose Hills 基金会，以及加州大学洛杉矶分校（UCLA）Jonsson 综合癌症中心、Broad 干细胞研究中心、临床与转化科学研究所和泌尿肿瘤学研究所的支持。

本文所述所有方法均已获得加州大学洛杉矶分校机构审查委员会的批准。
注意： 本文所述方法的示意图见图1。
1. 使用荧光激活细胞分选（FACS）分离小鼠前列腺基底和腔内上皮细胞 — 耗时：30 分钟
注意： 步骤 1.3-1.5 需在避光条件下进行。
<ol>
	<li>按照 Lawson 等人所述方法从整只小鼠前列腺中解离细胞后16，将细胞转移至流式管中，并用 100 µL 解离培养基（表 1）重悬 0.1–5 × 106 个细胞。</li>
	<li>直接加入适量以下荧光标记的一抗：CD45、CD31、Ter-119、EpCAM 和 CD49f。</li>
	<li>冰上避光孵育 20 分钟。 
	注意：建议使用总解离细胞的 10% 作为未染色和单染对照。这些对照对于设置正确的补偿和分选电压是必需的。</li>
	<li>每份样品中加入 1 mL 解离培养基以淬灭抗体混合物，然后在室温下以 800 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀，并用移液器吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于适量解离培养基中（每 1 × 106 个细胞使用 250 µL），其中含 1 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。随后进行流式分选。分离小鼠前列腺基底细胞和腔内上皮细胞的流式细胞术图谱见 图 2。</li>
</ol>
2. 将分选的前列腺上皮细胞接种至原代小鼠类器官培养体系 — 耗时：2–3 小时（不包括聚羟基乙酸涂层培养板的制备）
注意：使用聚羟基乙酸（Poly-HEMA）包被培养板，以防止基质凝胶下方孔板表面形成二维菌落。在将分选后的基底或腔内前列腺上皮细胞接种至小鼠类器官培养前1天，预先制备Poly-HEMA包被的培养板。在步骤2.1开始前2小时，将1 mL减生长因子基质凝胶（下文简称基质凝胶）置于冰上解冻。在进行步骤2.1前，应立即将Y-27632（ROCK抑制剂）加入小鼠类器官培养基中。步骤2.1–2.8需在冰上操作。
<ol>
	<li>在4 °C条件下，以800 × g离心5分钟，使用5 mL圆底管沉淀细胞，并吸除上清液。</li>
	<li>用500 µL小鼠类器官培养基（表2）14洗涤细胞沉淀。</li>
	<li>在4 °C条件下，以800 × g离心5分钟沉淀细胞，并吸除上清液。</li>
	<li>用小鼠类器官培养基重悬细胞，细胞密度为1,000个细胞/µL。</li>
	<li>为配制主混合液，将悬浮于小鼠类器官培养基中的上皮细胞与基质胶混合，最终形成含25%细胞/培养基和75%基质胶的混合物。通常将基底细胞以每80 µL含100–2,000个细胞的浓度接种，而腔面细胞通常以每80 µL含2,000–10,000个细胞的浓度接种。接种细胞的密度取决于预期取材时间及后续应用需求。 
	注意：在配制主混合液前5分钟，将适合体积的离心管预冷。为确保操作过程中基质胶不凝固，转移前需用移液器吸取基质胶3–4次，以预冷移液枪头。</li>
	<li>每孔加入80 µL基质胶/细胞混合物至24孔板中。建议将液滴加至孔壁下半部分，避免直接接触Poly-HEMA涂层。加样后轻轻旋转培养板，使基质胶/细胞混合物在孔边缘形成环状结构。</li>
	<li>将24孔板正置放入37 °C、5% CO2培养箱中孵育10分钟，使基质胶部分凝固。 
	注意：将24孔板放入培养箱后，立即开始将小鼠类器官培养基预热至37 °C。</li>
	<li>孵育10分钟后，将24孔板倒置，继续孵育50分钟，使基质胶完全凝固。</li>
	<li>每孔中心区域逐滴加入350 µL预热的小鼠类器官培养基。 
	注意：为保持基质胶结构完整，加培养基时应避免触碰基质胶环。</li>
	<li>加完培养基后，将24孔板放回37 °C、5% CO2培养箱中继续培养。</li>
</ol>
3. 更换小鼠类器官培养基 — 耗时：每24孔板10-15分钟
注意：应每隔 48 小时将现有培养基更换为新鲜培养基。每次更换培养基前，需预先将小鼠类器官培养基预热。用于补充的培养基中无需添加 ROCK 抑制剂。
<ol>
	<li>将24孔板倾斜45°角，使用p1000移液器从每个孔的中心轻轻吸出原有培养基，注意避免触碰基质胶环。</li>
	<li>加入350 µL预热的小鼠类器官培养基（同步骤2.9）。建议对培养超过5天的类器官加入较大体积的培养基（最多1 mL），以防止关键营养物质和生长因子迅速耗尽。</li>
</ol>
4. 从前列腺类器官提取蛋白裂解液用于Western Blot分析 — 耗时：2.5–4 小时
注意：在收集类器官用于蛋白裂解液提取之前，应准备并预热含dispase的培养基（表 1）。
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 的方法移除每个孔中的培养基。</li>
	<li>为收集类器官，使用移液器将含有分散酶的培养基 1 mL 直接反复吹打基质胶环，直至整个环状结构脱离，然后转移至 1.5 mL 微量离心管中。 
	注意：必须避免与 Poly-HEMA 涂层孔壁直接接触。直接接触可能导致收集的材料被 Poly-HEMA 污染，从而对细胞存活产生不利影响。</li>
	<li>将 1.5 mL 微量离心管放入 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 30 分钟至 1 小时，使分散酶充分消化基质胶。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 5 分钟，使类器官沉淀，并使用微量移液器移除上清液。</li>
	<li>向类器官沉淀中加入磷酸盐缓冲液（PBS），并通过轻轻弹击管壁使其重悬。 
	注意：若未能充分重悬类器官沉淀，可能导致类器官材料中残留分散酶或基质胶。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 5 分钟，使类器官再次沉淀，并使用微量移液器移除上清液。</li>
	<li>通过将每支试管浸入干冰与甲醇混合液中快速冷冻类器官沉淀。将试管储存于 -80 °C，待后续使用。或者，在完成步骤 4.6 后立即提取蛋白裂解物。</li>
	<li>根据每 10 µL 紧密堆积的细胞体积，加入 100 µL 蛋白裂解缓冲液（表 1）重悬类器官沉淀，轻轻弹击以混匀。 
	注意：若在快速冷冻后继续操作，需确保在将样品从 -80 °C 取出前蛋白裂解缓冲液已完全解冻，因为样品取出后必须立即加入裂解缓冲液，以防止磷酸酶和蛋白酶活性导致蛋白降解。</li>
	<li>将样品置于冰上，在蛋白裂解缓冲液中孵育至少 45 分钟。 
	注意：建议在冰上孵育前进行超声处理，以提高核蛋白回收效率；但超声处理并非必需步骤。若不进行超声处理，则直接进入步骤 4.10。
	<ol>
		<li>如需超声处理，请将试管置于湿冰中，将超声破碎仪探头轻轻接触微量离心管外壁，于 20 kHz 条件下超声处理 40 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照既定实验方案进行后续的 Western blot 检测。</li>
</ol>
5. 前列腺类器官的固定与染色用于全-mount 共聚焦显微镜免疫组织化学分析
<ol>
	<li>从24孔板中收集前列腺类器官 — 所需时间： 45–60 分钟 
	注意： 在收集用于共聚焦显微镜检测的前列腺类器官时，必须小心操作以维持其结构完整性。以下收集方案旨在减少类器官在分离过程中结构的破坏。
	<ol>
		<li>按照步骤3.1的方法，移除每个孔中的培养基。</li>
		<li>加入500 µL含dispase的培养基（表1），在37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，以消化基质胶。</li>
		<li>将消化后的类器官悬液收集至微量离心管中，于室温下以800 × g离心3分钟形成沉淀，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前列腺类器官的整体免疫荧光染色 — 所需时间：3–4天（每天1–5小时）
	<ol>
		<li>加入500 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下轻轻振荡孵育2小时。</li>
		<li>于室温下以800 × g离心3分钟使类器官沉淀，弃去上清液，加入1 mL PBS轻轻振荡洗涤15分钟。</li>
		<li>按照步骤5.2.2的方法再洗涤沉淀两次。</li>
		<li>于室温下以800 × g离心3分钟使类器官沉淀，弃去上清液。在封闭液（表1）中加入终浓度为1 µg/mL的DAPI，室温孵育2小时，或 alternatively 在4 °C过夜，轻轻振荡。</li>
		<li>于室温下以800 × g离心3分钟使类器官沉淀，弃去上清液。在封闭液中加入一抗（兔抗p63抗体、鼠抗细胞角蛋白8抗体），于4 °C轻轻振荡孵育过夜。</li>
		<li>于室温下以800 × g离心3分钟使类器官沉淀，弃去上清液。加入1 mL PBS轻轻振荡洗涤15分钟。</li>
		<li>按照步骤5.2.6的方法再洗涤沉淀两次。</li>
		<li>于室温下以800 × g离心3分钟使类器官沉淀，弃去上清液。在封闭液中加入二抗（Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记的山羊抗鼠IgG），于4 °C轻轻振荡孵育过夜。</li>
		<li>于室温下以800 × g离心3分钟使类器官沉淀，弃去上清液，加入1 mL PBS轻轻振荡洗涤15分钟。</li>
		<li>按照步骤5.2.9的方法再洗涤沉淀两次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 用于全-mount共聚焦显微镜观察的染色前列腺类器官的组织透明化与封片 — 耗时：7 小时
<ol>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，使类器官沉淀，并弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 mL 含 1% Triton X-100 的 PBS 配制的 30% 蔗糖溶液，在室温下轻轻振荡孵育 2 小时。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，使类器官沉淀，并弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 mL 含 1% Triton X-100 的 PBS 配制的 45% 蔗糖溶液，在室温下轻轻振荡孵育 2 小时。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，使类器官沉淀，并弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 mL 含 1% Triton X-100 的 PBS 配制的 60% 蔗糖溶液，在室温下轻轻振荡孵育 2 小时。</li>
	<li>在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，使类器官沉淀，并弃去 95% 的上清液。 
	注意：随着蔗糖浓度升高，沉淀物会变得更为松散。建议在紫外光下观察经 DAPI 染色的类器官，以确认其在弃去上清液过程中未发生丢失。</li>
	<li>将剩余悬液中的 10–20 µL 液滴转移至带腔室的盖玻片中，随后进行共聚焦显微镜观察。 
	注意：可在液滴两侧放置盖玻片碎片作为间隔物（图 4C），以防止加盖盖玻片时类器官被压扁。</li>
</ol>

<ol><li>Kwon, O. J., Xin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+epithelial+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Prostate epithelial stem and progenitor cells.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 2 (3), 209-218 (2014).</li>
<li>Choi, N., Zhang, B., Zhang, L., Ittmann, M., Xin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Murine+Prostate+Basal+and+Luminal+Cells+Are+Self-Sustained+Lineages+that+Can+Both+Serve+as+Targets+for+Prostate+Cancer+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult Murine Prostate Basal and Luminal Cells Are Self-Sustained Lineages that Can Both Serve as Targets for Prostate Cancer Initiation.</a> Cancer Cell. 21 (2), 253-265 (2012).</li>
<li>Ousset, M., Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+and+unipotent+progenitors+contribute+to+prostate+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multipotent and unipotent progenitors contribute to prostate postnatal development.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1131-1138 (2012).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 1-13 (2014).</li>
<li>Wang, Z. A., Mitrofanova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+basal+epithelial+cells+reveals+their+unexpected+plasticity+and+supports+a+cell-of-origin+model+for+prostate+cancer+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of basal epithelial cells reveals their unexpected plasticity and supports a cell-of-origin model for prostate cancer heterogeneity.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 274-283 (2013).</li>
<li>Kwon, O. J., Zhang, B., Zhang, L., Xin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+promotes+prostatic+basal-to-luminal+differentiation+and+accelerates+initiation+of+prostate+epithelial+hyperplasia+originated+from+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">High fat diet promotes prostatic basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate epithelial hyperplasia originated from basal cells.</a> Stem Cell Research. 16 (3), 682-691 (2016).</li>
<li>Kwon, O. J., Zhang, L., Ittmann, M. M., Xin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostatic+inflammation+enhances+basal-to-luminal+differentiation+and+accelerates+initiation+of+prostate+cancer+with+a+basal+cell+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prostatic inflammation enhances basal-to-luminal differentiation and accelerates initiation of prostate cancer with a basal cell origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 192 (3), 997-999 (2014).</li>
<li>Stoyanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+originating+in+basal+cells+progresses+to+adenocarcinoma+propagated+by+luminal-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer originating in basal cells progresses to adenocarcinoma propagated by luminal-like cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (50), 20111-20116 (2013).</li>
<li>Agarwal, S., Hynes, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Different+Classes+of+Luminal+Progenitor+Cells+within+Prostate+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors.</a> Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Mu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+promotes+lineage+plasticity+and+antiandrogen+resistance+in+TP53-+and+RB1-deficient+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer.</a> Science. 355 (6320), 84-88 (2017).</li>
<li>Bishop, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Master+Neural+Transcription+Factor+BRN2+Is+an+Androgen+Receptor-Suppressed+Driver+of+Neuroendocrine+Differentiation+in+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The Master Neural Transcription Factor BRN2 Is an Androgen Receptor-Suppressed Driver of Neuroendocrine Differentiation in Prostate Cancer.</a> Cancer Discovery. 7 (1), 54-71 (2016).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Drost, J., Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
<li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e59051(2019).</li>
<li>Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+characterization+of+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 181-186 (2007).</li>
<li>Chen, H. Y., Kaya, K. D., Dong, L., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+retinal+organoids+from+mouse+pluripotent+stem+cells+mimic+in+vivo+development+with+enhanced+stratification+and+rod+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+vision%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional retinal organoids from mouse pluripotent stem cells mimic in vivo development with enhanced stratification and rod photoreceptor differentiation.</a> Molecular vision. 22, 1077-1094 (2016).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+CD38+Identifies+Progenitor-like+Inflammation-Associated+Luminal+Cells+that+Can+Initiate+Human+Prostate+Cancer+and+Predict+Poor+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Low CD38 Identifies Progenitor-like Inflammation-Associated Luminal Cells that Can Initiate Human Prostate Cancer and Predict Poor Outcome.</a> Cell Reports. 17 (10), 2596-2606 (2016).</li>
<li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nature protocols. 5 (4), 702-713 (2010).</li>
<li>Chua, C. W., Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

前列腺上皮细胞分化在正常前列腺生物学2,3,4,5,6,7以及疾病生物学8,10,11,12中均具有重要作用；然而，该过程的主调控因子仍不明确。鉴定前列腺上皮细胞分化的关键调控因子一直存在困难，部分原因在于缺乏明确可靠的模型体系来模拟这一过程。尽管二维单层培养可用于模拟分化过程11,12，但该体系无法重现前列腺复杂的微环境。此外，体内分化模型难以进行机制性研究，因其操作难度较大。因此，建立一种易于操作且具有生理相关性的模型体系，对研究细胞分化至关重要。
前列腺类器官模型是一种优雅的体外体系，据报道可在其中发生基底细胞向管腔细胞的分化。建立前列腺类器官的方法已有较为成熟的方案14；然而，这些方法仍需进一步优化。此外，目前尚缺乏对前列腺类器官收获与分析前处理的清晰描述。本文介绍了一种将从小鼠前列腺中分离的前列腺上皮细胞接种至类器官培养体系的方法。该方法可帮助研究人员：（1）防止类器官形成过程中出现二维集落；（2）降低培养基更换时对基质胶结构的破坏风险；（3）更有效地对类器官进行计数。此外，本文还概述了将类器官收获并制备用于蛋白质印迹（Western blot）分析或全组织共聚焦显微镜观察的方法。尤为重要的是，用于共聚焦显微镜观察的类器官制备方法在整个过程中保持了类器官结构的完整性，从而减少了成像前的类器官损伤。总体而言，本文所述方法拓展了前列腺类器官检测技术的应用能力。
值得注意的是，基底细胞和腔细胞的类器官形成能力会受到细胞分离方法以及培养条件的影响。本实验所采用的类器官培养条件最初由 Karthaus 等人报道13。Karthaus 等人报告称，基底细胞的类器官形成能力（15%）高于腔细胞（1%）13；而 Chua 等人使用不同的分离方法和培养条件，却发现腔细胞（0.2–0.3%）的类器官形成能力高于基底细胞（0.03%）20。总体而言，Karthaus 等人所描述的方法可使基底细胞和腔细胞均获得更高的类器官形成率，这可能反映了其在分离基底细胞和腔细胞时所采用的技术差异13，而非培养条件对腔细胞类器官形成的抑制作用。目前尚不清楚本文所述方案是否更有利于来自多能性腔前体细胞或定向腔前体细胞的腔类器官形成9。尽管体内谱系示踪研究耗时且成本较高，但可用于验证类器官实验中所揭示的不同前列腺上皮谱系相关前体细胞的特性。
发育、分化和转化等过程不仅与前列腺生物学相关，也与其他组织的生物学相关，包括脑、肺、肠、胰腺和肝脏。所描述的方法有助于利用类器官模型来研究这些过程，不仅可用于前列腺，还可广泛应用于多种组织。

基底细胞和腔细胞构成了前列腺上皮的大部分1。谱系示踪研究表明，在成年小鼠中，这些细胞类型主要由各自不同的前体细胞自我维持2；然而，在多种情况下也观察到基底前体细胞向腔细胞分化，包括发育过程3,4、组织再生5、炎症6,7以及前列腺癌的起始阶段2,8。此外，越来越多的数据支持存在多能性腔前体细胞以及定向分化的腔系前体细胞9。在转移性前列腺癌中，细胞从依赖雄激素受体（AR）的腔细胞系分化为具有基底样和神经内分泌特征的AR非依赖性细胞系，这一现象被认为是抵抗雄激素通路抑制剂治疗的重要机制，且日益受到关注10,11,12。因此，鉴于细胞分化在正常生理、癌症发生及治疗耐药中的重要作用，阐明调控前列腺上皮细胞分化的关键分子机制至关重要。
小鼠前列腺类器官模型已成为研究前列腺上皮细胞分化的优雅的体外实验体系9,13,14。在该实验中，单个上皮细胞被接种于三维基质中，一周内即可形成包含基底细胞和腔面细胞的腺样结构。尽管现有的类器官培养细胞接种方法能够高效生成类器官，但这些方法仍需进一步优化14。前列腺类器官培养中的显著挑战包括：（1）在分析时排除在基质胶（Matrigel）下方形成的二维（2D）克隆；（2）在更换培养基过程中维持基质胶的完整性；（3）准确计数类器官。本文介绍了一种从小鼠前列腺分离的上皮细胞生成类器官的方法。该方法包括使用多聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（Poly-HEMA）包被培养板，以防止二维克隆的产生。此外，细胞被接种于基质胶环形区域而非基质胶圆盘中，从而简化了培养基更换和类器官计数的操作。这些技术使研究人员能够更便捷地探究在类器官形成前或形成过程中引入的基因改变或小分子化合物如何影响分化等关键生物学过程。
收获前列腺类器官用于蛋白质印迹或全 mount 共聚焦显微镜免疫组织化学分析，可为研究分化机制提供重要信息13，但目前尚缺乏成熟的标准方案来制备适用于这些技术的类器官样本。本文描述了两种类器官收获方法：(1) 收集蛋白裂解液，或 (2) 固定并染色以用于共聚焦显微镜观察。重要的是，本文所述的前列腺类器官固定与染色方法相较于现有技术有显著改进。现有方法依赖于对类器官进行切片15，而本文所述方法采用完整类器官，有助于在样本制备过程中避免类器官损伤。联合使用蛋白质印迹和共聚焦显微镜技术，可深入揭示调控分化的分子机制。此外，这些方法也可用于模拟其他生物学过程，如发育与转化。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;-培养皿 35 mm，高</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F-12培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7标记抗小鼠CD326（Ep-CAM）抗体，100 &amp;mu;g</td><td>BioLegend</td><td>118218</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩，无血清）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>双氢睾酮（5&amp;alpha;-雄烷-17&amp;beta;-醇-3-酮）</td><td>Sigma</td><td>A-8380</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II，粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-041</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F8667</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记抗小鼠CD31抗体（0.5 mg/mL，50 &amp;mu;g）</td><td>BioLegend</td><td>102405</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记抗小鼠CD45抗体（0.5 mg/mL，50 &amp;mu;g）</td><td>BioLegend</td><td>103107</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记抗小鼠TER-119/红系细胞抗体（0.5 mg/mL，50 &amp;mu;g）</td><td>BioLegend</td><td>116205</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A28175</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG-Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Halt磷酸酶抑制剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR基底膜基质</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗细胞角蛋白8抗体</td><td>BioLegend</td><td>904804</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>PE标记抗人/小鼠CD49f抗体</td><td>BioLegend</td><td>313612</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（Poly-HEMA）</td><td>Sigma</td><td>P3932-25G</td><td></td></tr><tr><td>兔抗p63抗体</td><td>BioLegend</td><td>619002</td><td></td></tr><tr><td>放射免疫沉淀分析法（RIPA）裂解液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI89901</td><td></td></tr><tr><td>重组人EGF，无动物成分</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组人Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基，含HEPES（浓度为10）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB120</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二盐酸盐（ROCK抑制剂）</td><td>Selleck Chemical</td><td>S1049-50MG</td><td></td></tr></tbody></table>

利用类器官培养评估小鼠前列腺上皮细胞的分化能力

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

前列腺上皮主要由基底细胞和腔内细胞组成。体内谱系示踪技术已被用于定义小鼠前列腺基底细胞和腔内细胞在发育、组织再生及转化过程中的分化潜能。然而，利用谱系示踪方法评估细胞内在和外在因素对前列腺上皮分化潜能的调控作用，通常需要大量繁育工作，且成本较高。在前列腺类器官实验中，基底细胞和腔内细胞可在体外生成前列腺上皮组织。重要的是，在接种至三维（3D）培养体系之前或之后，可从小鼠任意遗传背景或经任意小分子处理的小鼠中分离获得原代上皮细胞。接种后7–10天即可获得足够量的材料用于分化潜能评估。收集由基底细胞来源和腔内细胞来源的类器官，用于（1）通过蛋白质印迹法进行蛋白分析，以及（2）通过整体共聚焦显微镜对完整类器官进行免疫组织化学分析，使研究人员能够评估前列腺上皮细胞在体外的分化能力。当联合使用时，这两种方法可提供互补信息，揭示遗传或药物干预下前列腺基底细胞和腔内细胞分化潜能的变化情况。

前列腺上皮细胞被接种至小鼠类器官培养体系中，形成类器官，在进行下游分析前收获这些类器官（图1）。
采用FACS分离基底细胞和腔内上皮细胞。首先排除DAPI+细胞，并去除Lin+细胞（CD45、CD31、Ter119），然后根据EpCAM和CD49f的差异表达区分基底细胞和腔内细胞（图2）。将前列腺基底细胞和腔内细胞接种至类器官培养体系的方法包括：（1）将细胞接种于基质胶环状结构中，（2）用Poly-HEMA包被培养孔。接种至环状结构的方法此前已在Agarwal等9中描述。采用该方法（图3A）可使研究人员在更换培养基（步骤3）时更易避开基质胶，并通过追踪培养孔周长更方便地计数类器官。已有研究表明，用Poly-HEMA包被培养孔可防止视网膜类器官中二维菌落的形成17；然而，该方法此前尚未应用于前列腺类器官模型。重要的是，使用Poly-HEMA包被培养孔（表3）可消除二维菌落的出现，且不影响类器官的形成（图3B）。这些改进拓展了前列腺类器官检测技术的应用能力。
基底细胞和腔面细胞形成的类器官具有不同的形态结构（图4A）。培养7天后，大多数由基底细胞来源的类器官大小相似（直径100–300 µm），而由腔面细胞来源的类器官则表现出显著的异质性（直径30–450 µm）。此外，大多数基底细胞来源的类器官含有被多层上皮包围的腔（图4A，上），而腔面细胞来源的类器官在形态上则呈现多样性，从具有单层上皮的空心结构，到无管腔形成的实心结构，后者由多层细胞索组成（图4A，下）。采用上述方法对类器官进行后续分析准备（步骤4、5），以探究这些表型差异是否反映了谱系标志物表达的差异。Western blot分析显示，基底细胞和腔面细胞来源的类器官分别保留了与原代基底细胞和腔面细胞相关的特征。基底细胞来源的类器官表达更高水平的基底标志物细胞角蛋白5（K5），而腔面细胞来源的类器官则表达更高水平的腔面标志物细胞角蛋白8（K8）（图4B）。在群体总体中，基底细胞和腔面细胞来源的类器官均检测到基底和腔面标志物的表达，可能提示存在分化现象（图4B）。
我们旨在表征基底细胞来源类器官中谱系标志物的表达情况，并通过染色完整类器官并进行共聚焦显微镜分析，确定在形态上 distinct 的管腔细胞来源类器官是否存在标志物表达的差异（图4D）。基底细胞来源的类器官包含多层上皮结构，其外层细胞高表达基底标志物 p63，中等表达管腔标志物 K8（p63hi, K8mid），而内层细胞则无明显 p63 表达，但 K8 表达水平较高（p63lo, K8hi）（图4D，上图）。在单层管腔细胞来源的类器官中，所有细胞均对 K8 呈阳性染色，但仅有部分细胞的细胞核中可检测到 p63（图4D，下图）。这些数据验证了类器官收获与制备用于 Western blot 或共聚焦显微镜分析的方法，从而拓展了类器官检测技术在研究分化等关键细胞过程中的应用能力。
<img alt="小鼠前列腺类器官培养与分析示意图：显示细胞分离、培养及显微镜观察过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60223/60223fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：生成前列腺类器官用于收集与分析的工作流程示意图。 将整只小鼠前列腺组织解离后，通过已建立的方案18,19，利用荧光激活细胞分选技术分离基底细胞和腔内前列腺上皮细胞。将基底细胞或腔内细胞悬浮于小鼠类器官培养基与基质胶的混合物中，接种至基质胶环内。培养5至7天后，收集类器官用于蛋白质印迹或共聚焦显微镜分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60223/60223fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术流程；含DAPI、Lin FITC、CD49f PE标记的散点图；细胞群体设门。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60223/60223fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：利用荧光激活细胞分选（FACS）分离小鼠前列腺基底细胞和腔内细胞。 来自小鼠前列腺的解离细胞在FACS前用DAPI染色以区分活细胞与死细胞，并使用表面抗体以区分基底细胞与腔内细胞。左侧 = 设门于DAPI-细胞。FSC-A = 前向散射。中图 = 设门于Lin-细胞（CD45lo、CD31lo、Ter119lo）。SSC-A = 侧向散射。右侧 = 基底细胞（Bas）（EpCAMhi、CD49fhi），腔内细胞（Lum）（EpCAMhi、CD49fmid）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60223/60223fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="24孔板中Matrigel液滴的涡旋形态；含Poly-HEMA效应的3D/2D细胞生长对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60223/60223fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：小鼠前列腺类器官的建立。（A）示意图，展示在24孔板的孔中形成基质胶环的方法。（B）将前列腺上皮细胞接种至未包被（Poly-HEMA (–)）或包被（Poly-HEMA (+)）的24孔板后第7天，所形成的类器官（三维生长平面）和二维菌落（二维生长平面）的代表性相差显微图像。二维生长平面中标注框选区域在右侧放大显示。比例尺 = 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60223/60223fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="原代类器官研究；显微镜检查、Western印迹、成像设置、蛋白质表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60223/60223fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过Western印迹和全-mount共聚焦显微镜分析前列腺类器官中谱系标志物的表达。 （A）培养7天后，基底细胞来源（上图）和腔面细胞来源（下图）类器官的代表性相差显微图像。比例尺 = 100 µm。（B）培养5天后，基底细胞来源（Bas）和腔面细胞来源（Lum）类器官的Western印迹分析。检测基底细胞标志物细胞角蛋白5（K5）、腔面细胞标志物细胞角蛋白8（K8）以及上样对照组组蛋白H3（HH3）。（C）带隔片的腔室盖玻片示意图。（D）培养7天后，基底细胞来源（上图）和腔面细胞来源（下图）类器官的代表性微分干涉差（DIC）图像及免疫荧光图像。分别和合并显示p63（红色）、K8（绿色）和DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60223/60223fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">配方</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>含 Dispase 的培养基</td>
			<td>1 mg/mL dispase + 10 µM ROCK 抑制剂，溶于高级 DMEM F12 培养基中。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>解离培养基</td>
			<td>10% FBS + 1× 青霉素-链霉素，溶于 RPMI 1640 培养基中。使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白裂解缓冲液</td>
			<td>RIPA 缓冲液 + 磷酸酶抑制剂 + 蛋白酶抑制剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>封闭液</td>
			<td>含 0.2% Triton X-100 的 PBS 中加入 10% FBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：关键溶液配制说明。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>1x（从50x浓缩液稀释）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>1x（从100x浓缩液稀释）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组人EGF（无动物成分）</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重组人Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1-条件培养基</td>
			<td>10% 条件培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 二盐酸盐（ROCK抑制剂）</td>
			<td>10 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>基础培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">R-spondin 1-条件培养基的制备方法见Drost等人的文献13。加入所有组分后，使用0.22 µm滤器过滤除菌小鼠类器官培养基。ROCK抑制剂仅在类器官培养建立及传代过程中添加。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：小鼠类器官培养基制备说明。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">制备聚HEMA包被板的实验方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>将0.25 g聚HEMA加入50 mL 98% EtOH中。在37 °C摇床上溶解聚HEMA。此过程至少需要4 h。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>使用0.22 µm滤器对聚HEMA溶液进行过滤除菌。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>每孔24孔板加入200 µL聚HEMA溶液。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>加入聚HEMA后，取下24孔板盖子，使溶液过夜蒸发。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>用PBS每孔洗涤两次，并在最终洗涤后确保各孔完全干燥后再进行储存。注意：洗涤过程中破坏聚HEMA包被可能导致上皮细胞接种至类器官培养时出现二维生长。为防止损伤聚HEMA包被的孔，洗涤时应避免移液枪头直接接触孔底表面。除非移液枪头刮除，聚HEMA包被的完整性将保持不变。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>聚HEMA包被板可在4 °C保存最多两周。注意：储存前用Parafilm封口膜包裹可降低污染风险。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：聚羟基乙酸酯-HEMA包被板的制备方案。

小鼠前列腺类器官是研究调控分化机制的有力模型。本文介绍了一种改进的前列腺类器官建立方法，并提供了两种技术：（1）从类器官中收集蛋白裂解液；（2）对类器官进行固定和染色，用于整体封片共聚焦显微镜观察。

前列腺上皮主要由基底细胞和腔面细胞组成。体内谱系示踪技术已被用于界定其分化过程……

与二维检测相比，三维类器官系统被认为更接近生理状态，能够提供有关生物学特性的宝贵信息，而这些信息通常难以获得。该系统具有良好的适应性，相较于体内方法，可更快速且以显著更低的成本进行药理学和遗传学操作测试。基质胶在室温下会凝固，因此操作起来非常困难。只有在呈液态时才能用移液器吸取，并且必须保持在冰上。保持环的完整性至关重要。如果结构被破坏，可能对类器官的生长产生负面影响，并且在更换培养基时容易损失材料。按照文本方案所述，首先制备小鼠前列腺基底细胞和腔面细胞。用500微升小鼠类器官培养基洗涤细胞沉淀，然后将沉淀重悬，细胞密度为每微升1,000个细胞。配制主混合液时，将悬浮于小鼠类器官培养基中的上皮细胞与基质凝胶混合，制备终浓度为25%细胞悬液和75%基质凝胶的混合物。根据下游应用的不同，基底细胞通常以每80微升100至2,000个细胞的浓度接种，而腔面细胞则以每80微升2,000至10,000个细胞的浓度接种。对于每种细胞混合物，向24孔板的每个孔中加入80微升基质凝胶。用移液器将一滴液体加至孔壁的下半部分，避免直接接触聚HEMA涂层。加入基质胶后，轻轻摇晃培养板，使基质胶-细胞混合物在孔的边缘形成环状。将24孔板正置于37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育10分钟，使基质胶部分凝固。孵育10分钟后，将24孔板倒置，继续孵育50分钟，使基质胶完全凝固。然后，将350 µL预热的小鼠类器官培养基逐滴加入每个孔的中央。添加培养基后，将24孔板放回培养箱。为补充小鼠类器官培养基，将24孔板倾斜至45度角，使用P1000移液器轻轻从每个孔的中央吸出原有培养基，注意避免触碰基质胶环。加入 350 微升预热的小鼠类器官培养基，操作同前。建议对培养超过五天的类器官加入更大体积的培养基，以防止关键营养物质和生长因子迅速耗尽。按之前方法吸出每孔中的培养基。收集类器官时，使用移液器将一毫升预热的含dispase培养基反复吹打基质胶，直接喷射至基质胶环上，直至整个胶环完全脱落。将脱落的基质胶与类器官混合物转移至1.5毫升微量离心管中。按照文本方案中所述完成彻底消化后，向类器官沉淀中加入磷酸盐缓冲液，并通过轻弹管壁重新悬浮。将类器官在室温下以800 × g离心5分钟，沉淀类器官，并使用微量移液器移除上清液。根据每10 µL紧实细胞体积加入100 µL蛋白质裂解缓冲液重悬类器官沉淀。轻弹管壁以充分重悬。现在，将装有类器官的离心管浸入湿冰中，将超声破碎仪的探头轻轻接触微型离心管外壁进行超声处理。在继续按照既定方案进行 Western 印迹分析之前，以 20 千赫兹超声处理 40 秒。收集 24 孔板中的前列腺类器官时，按前述方法吸去每孔中的培养基。在37°C、5% CO2培养箱中，用含有500微升dispase的培养基孵育30分钟，以消化基质凝胶。将消化后的类器官悬液收集至微量离心管中。随后，在室温下以800 × g离心3分钟，使类器官沉淀，并弃去上清液。为了对前列腺类器官进行整体免疫荧光染色，首先加入500微升含4%多聚甲醛的PBS溶液。在室温下轻轻振荡孵育类器官2小时。按照文本方案中所述清洗沉淀物后，将1微克/毫升的DAPI染料溶于封闭液中并加入，室温孵育2小时。从这一步开始，在孵育过程中需避光保护样本。将类器官按前述方法离心后，加入含有初级抗体的封闭液，于4°C轻轻振荡孵育过夜。再次离心收集类器官沉淀，并用1 mL PBS轻轻振荡洗涤15分钟。重复此洗涤步骤两次。然后在封闭液中加入二抗，于4°C轻轻振荡孵育过夜。孵育结束后，离心收集类器官，再对沉淀物额外洗涤两次。向沉淀的类器官中加入1 mL含1% Triton X-100的PBS配制的30%蔗糖溶液，然后在室温下轻轻振荡孵育2小时。再次离心收集类器官后，加入1 mL含1% Triton X-100的PBS配制的45%蔗糖溶液，在室温下轻轻振荡2小时。然后重复上述操作，但加入1毫升含1%Triton X-100的60%蔗糖PBS溶液。在室温下以800 × g离心3分钟，使类器官形成沉淀，并移除95%的上清液。在紫外光下观察沉淀物，以确认其在去除上清液过程中未丢失。随着蔗糖浓度的升高，沉淀物会变得更为松散。取10至20微升剩余的悬浮液转移至带腔盖玻片中，随后进行共聚焦显微镜观察。基底细胞和腔面细胞会形成具有不同形态的类器官。尽管大多数基底细胞来源类器官在培养7天后大小相似，但腔面细胞来源类器官表现出显著的异质性。此外，大多数基底细胞来源类器官含有由多层上皮包围的管腔，而腔面细胞来源类器官在形态上则呈现多样性，从具有单层上皮的中空结构到由无法形成管腔的多层细胞索组成的实心结构均有存在。Western印迹分析显示，基底细胞和腔面细胞来源类器官均保留了与其对应的原代基底细胞和腔面细胞相关的特征。基底来源类器官表达更高水平的基底标志物细胞角蛋白5，而管腔来源类器官则表达更高水平的管腔标志物细胞角蛋白8。在总体细胞群体中，基底和管腔来源的类器官均检测到基底和管腔标志物，可能提示存在分化现象。基底来源类器官包含多层上皮结构，外层表达高水平的基底标志物p63，内层则无法检测到该标志物的表达。外层还表达中等水平的腔面标志物细胞角蛋白8，而内层则表达高水平。在单层腔面来源的类器官中，所有细胞均对细胞角蛋白8呈阳性染色，但仅有部分细胞含有核内p63。在处理基质胶时需格外小心，以确保在将细胞接种到类器官培养物之前，基质胶不会过早硬化。用于显微镜检查的DAPI可能引起皮肤刺激。紫外线也可能有害。必须配备适当的个人防护装备。我们可以从类器官中收集RNA，以进行RNA测序，从而了解基因表达谱在类器官形成过程中或对干预处理的响应中如何变化。该模型使前列腺研究领域获得了一种可重复的体外实验体系，可用于研究上皮生物学的基本特征，并鉴定发育和分化过程中的调控因子。

evaluating-differentiation-capacity-mouse-prostate-epithelial-cells

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

利用有机体培养评价小鼠前列腺皮细胞的分化能力

在本视频中，我们演示了使用基质凝胶环培养技术对分离的小鼠前列腺上皮细胞进行培养。该方法可为研究遗传或药物干预下前列腺上皮细胞分化形成三维腺样结构的能力提供补充信息。...

前列腺类器官检测：一种基于基质凝胶环的体外培养技术用于研究前列腺上皮细胞的分化能力

在本视频中，我们演示了从培养于基底膜基质环中的前列腺类器官提取蛋白裂解液的方法。对提取的蛋白组分进行分析，有助于研究类器官中谱系标志物的表达情况。...

蛋白裂解物提取：一种裂解类器官以收集细胞蛋白的技术

基因工程小鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。本文介绍了一种从小鼠泌尿生殖系统中识别并分离前列腺叶的方案，基于组织学特征对其进行区分，并分离和培养原代前列腺细胞 体外...

小鼠前列腺叶的鉴定、组织学表征及用于体外三维球体培养模型的分离

本文介绍了一种用于指导人原代前列腺类器官操作的实验方案，并提出了用于评估表型的检测终点。内容包括类器官的接种、培养维持、从基质胶中回收、形态学定量分析、包埋与切片、石蜡包埋切片（FFPE）、整体染色以及商用检测试剂盒的应用。...

人原代前列腺类器官培养的处理与评估

我们展示了一种用于小鼠前列腺癌模型的尸检及解剖方法，重点介绍前列腺肿瘤的分离。同时提供了一步一步建立小鼠前列腺肿瘤类器官的实验方案。...

利用前列腺癌基因工程小鼠模型生成肿瘤类器官

本文介绍了一种用于研究前列腺上皮类器官药理学反应的实验方案。类器官在生物学特性上高度模拟体内环境，并能重现患者的遗传特征，因此成为具有吸引力的模型系统。前列腺类器官可来源于野生型前列腺、基因工程小鼠模型、良性人前列腺组织以及晚期前列腺癌组织。...

前列腺类器官培养作为将基因型和突变谱转化为药理学反应的工具

患者骨髓来源的前列腺癌骨转移样本及其异种移植瘤的三维培养物可维持原始肿瘤的功能异质性，从而形成囊状结构、球状体以及复杂的类肿瘤类器官。本文提供了一种针对异质性患者来源样本进行三维培养的优化策略及实验方案，并介绍了利用成像流式细胞术（IFC）对其进行分析的方法。...

建立与分析源自前列腺癌骨转移患者样本及其异种移植瘤的三维（3D）类器官

前列腺癌的异质性和治疗耐药性仍是当前面临的挑战。本文介绍一种用于建立患者来源类器官（PDOs）的实验方案，该类器官可保留亲本肿瘤的关键特征。这一标准化模型有助于药物筛选及精准医学的发展。...

建立和维持患者来源的前列腺癌类器官：一份详细的实验方案

本方案描述了一种基于小鼠前列腺类器官的二维培养模型的建立方法。内容包括类器官解离、细胞接种、分化、上皮完整性评估以及 体外 感染尿路致病性...

建立基于小鼠前列腺类器官的宿主-病原体相互作用研究模型

本方案介绍了一种优化的小鼠成年雌性尿道上皮层分离方法，可用于后续分析，包括流式细胞术、免疫染色和类器官培养。实验结果表明，该方法可获得富集且具有活性的尿道上皮细胞，流式细胞术分析、整体组织成像以及高效的类器官形成均证实了这一点。...

一种优化的小鼠女性尿道上皮分离方法用于单细胞及免疫荧光分析

了解小鼠前列腺类器官培养技术，用于研究上皮细胞分化机制。该方法结合免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像，为发育生物学和细胞生物学研究提供可靠的体外模型。

利用类器官培养评估小鼠前列腺上皮细胞的分化能力

探索更多视频