利用有机体培养评价小鼠前列腺皮细胞的分化能力
2019年11月22日
小鼠前列腺器官代表一个有前途的环境来评估调节分化的机制。本文介绍了一种建立前列腺有机体的改进方法，并介绍了（1）从有机体中收集蛋白质易脂物的方法，以及（2）全贴联显显微镜的修复和染色有机体。
3D器官系统被认为比2D测定在生理上更相关，它可以提供有关生物学的宝贵信息，否则将难以获得。这是一个适应性强的系统，我们可以用更少的时间和更低的成本来测试药理学和基因操作，比使用体内的方法要低得多。矩阵试验是很难处理，因为它凝固时，它达到室温。
它只能通过移液器在液体时绘制，并且必须在冰上维护。环的完整性很重要。如果结构被破坏，可能会对器官生长产生负面影响，在更换介质时很容易丢失材料。
从编写小鼠基础和发光前列腺上皮细胞开始此过程，如文本协议中所述。在500微升小鼠器官介质中清洗细胞颗粒，然后以每微升1000个细胞的细胞密度重新悬浮颗粒。为了准备主混合物，将悬浮在小鼠器官介质中的上皮细胞与基质凝胶混合，以生成含有25%介质细胞和75%基质凝胶的最终混合物。
根据下游应用的不同，基底细胞通常镀在每80微升100至2000个细胞的浓度，而发光细胞的镀金浓度为每80微升2000至10000个细胞。对于每个细胞混合物，每24井板的井中加入80微升的基质凝胶。将水滴滴滴到井壁的下半部分，同时避免与多血球涂层直接接触。
添加基质凝胶后，旋转板，使基体凝胶细胞混合物在井边缘周围形成环。将 24 井板放入 37 摄氏度、5%C02 培养箱右侧 10 分钟，让基质凝胶部分硬化。孵育10分钟后，将24井板倒置，再孵育50分钟，使基质凝胶完全硬化。
然后，在每一个井的中心添加350微升预热小鼠风琴介质滴。添加介质后，将 24 井板返回孵化器。要补充小鼠管风介质，请以 45 度角倾斜 24 井板，并使用 P1000 移液器从每个井的中心轻轻去除现有介质，同时避开矩阵凝胶环。
添加350微升预热小鼠器官介质，如上前。建议在培养超过五天的器官中加入大量培养的介质，以防止关键营养素和生长因子的快速耗竭。与之前一样，从每个介质中卸下介质。
为了收集器官，通过将一毫升预加热的不含酶介质直接移液到基质凝胶环上，反复爆破基体凝胶，直到整个环脱落。将脱落的基质凝胶有机体混合物转移到1.5毫升微离心管中。在文本协议中描述的完全消化后，将磷酸盐缓冲盐水添加到有机体颗粒中，然后轻轻轻拂重新悬浮。
在室温下，在800次G下离心，将器官中去除5分钟，然后使用微移液器去除上流液。每10微升包装细胞体积将有机体颗粒重新悬浮在100微升蛋白质解解缓冲液中。轻拂以重新挂起。
现在，通过将管子淹没在湿冰中，将声波分离器的尖端轻轻应用到微离心管的外方，对器官进行声波化。声波 40 秒在 20 千赫， 然后继续西方印迹与既定的协议。要从 24 孔板中收集前列腺器官，请从每个孔板和之前一样去除介质。
在37摄氏度、5%CO2培养箱中，用500微升含糖的介质孵育30分钟，消化基质凝胶。在微离心管中收集消化的器官悬浮液。然后，在室温下以800倍G的离心对器官进行颗粒状，三分钟，然后去除上经剂。
为了对前列腺器官进行全安装免疫荧光染色，首先在PBS中加入500微升4%的甲状甲醛。在室温下用温和的摇动孵育器官两小时。如文本协议所述，洗涤颗粒后，在阻尼溶液中每毫升 DAPI 污渍中加入一微克，并在室温下孵育两小时。
保护样品在孵育过程中免受光线的光，从这一步前进。与以前一样，在器官离心后，在阻断溶液中加入原抗体，并在四摄氏度下孵育，轻轻摇晃。再次将器官取出，用一毫升 PBS 清洗颗粒 15 分钟，轻轻摇动。
重复此洗涤程序两次。然后在阻断溶液中加入二次抗体，在四摄氏度下孵育，轻轻摇晃。孵育后，对器官进行颗粒，再洗两次颗粒。
在PBS中加入一毫升30%蔗糖，在颗粒状有机体中加入1%Triton X-100。然后在室温下孵育两小时，轻轻摇晃。再次对器官进行造粒后，在PBS中加入1%Triton X-100的1毫米45%蔗糖，并在室温下轻轻摇动两小时。
然后，重复该过程，除了在 PBS 中加入 1%Triton X-100 的 60% 蔗糖一毫升。在室温下，在800次G下离心，将器官中除，三分钟，去除95%的上经剂。在紫外线下观察颗粒，确认在去除上清液时颗粒未丢失。
当蔗糖浓度增加时，颗粒变得更松。将剩余悬架的 10 至 20 微升转移到室盖玻片中，然后进行共合显微镜。基础细胞和发光细胞形成具有不同形态的器官。
虽然大多数基底衍生器官在培养七天后大小相似，但发光衍生的器官表现出显著的异质性。此外，大多数基底衍生器官包含被多层上皮包围的流明，而发光衍生的器官在形态学上范围从空心与单层上皮到固体与多层细胞线不通化。西方的印迹分析显示，基底和发光衍生的器官保留了与基底和发光原细胞相关的特征。
基底衍生器官表达基底标记细胞蛋白5的较高水平，而发光衍生器官表达较高水平的发光标记细胞蛋白8。在大量种群的基底和发光衍生器官中检测到基底标记和发光标记，这或许暗示了分化。基底衍生器官包含多层上皮，外层表示基底标记p63的高水平，内层具有不可检测的水平。
外层还表示中度亮度标记细胞素8，内层具有高水平。虽然单层发光衍生器官中的所有细胞对细胞蛋白8呈正染色，但只有部分细胞含有核p63。处理基质凝胶时必须小心，以确保在将细胞电镀到器官培养体之前，它不会硬化。
用于显微镜的 DAPI 可引起皮肤刺激。紫外线也可能有害。充足的个人防护装备是必不可少的。
我们可以从器官中收集RNA来执行RNA测序，这将告诉我们基因表达特征在器官形成过程中或对操纵的反应中是如何变化的。该模型使前列腺场具有可重复的体外检测，以研究上皮生物学的基本方面，并确定发育和分化中的调节器。
概述
本研究提出了一种改进的小鼠前列腺类器官建立方法，该方法是研究分化机制的有价值模型。文章详细介绍了蛋白质裂解液收集和类器官全挂式共聚焦显微镜染色的技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 类器官技术
背景
- 3D类器官系统比传统的2D测定更具生理相关性。
- 它们为难以研究的生物过程提供了见解。
- 类器官可用于药理学和遗传测试。
- 维持基质的完整性对于成功的类器官生长至关重要。
研究目的
- 建立一种可靠的前列腺类器官创建方法。
- 促进蛋白质裂解液的收集以供分析。
- 实现全挂式共聚焦显微镜以进行详细成像。
使用的方法
- 小鼠基底层和腔内前列腺上皮细胞的制备。
- 将细胞与基质凝胶混合以形成类器官。
- 类器官培养的孵育和培养基补充协议。
- 免疫荧光染色和共聚焦显微镜技术。
主要结果
- 成功建立具有不同形态的前列腺类器官。
- 有效收集蛋白质裂解液以供下游应用。
- 全挂式染色和成像的详细协议。
- 对前列腺细胞分化机制的见解。
结论
- 改进的方法增强了前列腺生物学的研究。
- 类器官为测试各种操作提供了相关模型。
- 这种方法可以适用于其他类器官系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
Establishing reproducible ex vivo models of prostate epithelial differentiation enables mechanistic de-risking of therapeutic targets in early discovery. The organoid assay supports target validation by allowing rapid, cost-effective evaluation of genetic and pharmacological manipulations on basal and luminal cell fate decisions. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, morphology- and marker-based readouts of differentiation capacity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by assessing how genetic or pharmacological perturbations alter basal-to-luminal differentiation capacity in a genetically tractable system.
- Operational Value: Enable functional target validation using primary epithelial cells from any genetic background without extensive breeding.
- Predictive Value: Support portfolio triage by identifying modulators that promote or inhibit lineage-specific epithelial maturation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated biological systems for downstream screening by generating sufficient organoid material for Western blot and confocal analysis within 7-10 days.
- Operational Value: Standardize assay readiness through reproducible organoid formation and defined plating densities for basal (100-2,000 cells/80µL) and luminal (2,000-10,000 cells/80µL) progenitors.
- Screening Readiness: Facilitate reliable compound evaluation via distinct organoid morphologies and marker expression patterns (e.g., cytokeratin 5 in basal-derived, cytokeratin 8 in luminal-derived organoids).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintain disease-relevant system fidelity by preserving basal and luminal epithelial features ex vivo, enabling biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarify pathway regulation by linking molecular manipulations to differentiation outcomes via complementary protein and imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Inform go/no-go decisions by quantifying differentiation capacity shifts that predict in vivo epithelial behavior.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic insights that support preclinical continuity and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of epithelial differentiation in response to perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through standardized organoid culture and recovery protocols compatible with Western blot and imaging workflows.
- Analytics: Generates measurable readouts including organoid morphology, cytokeratin layering, and marker expression levels that allow comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining epithelial identity and differentiation capacity ex vivo, supporting biomarker-relevant model systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple genetic or pharmacological variables across projects due to its adaptability and low material cost.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epithelial lineage regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of organoid generation and analysis across laboratories.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency via reduced reliance on in vivo models, and decreased late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on prostate epithelial differentiation capacity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, 3D culture techniques, and confocal microscopy.
- Dependent on proper matrix gel handling and temperature control to prevent premature hardening.
- Necessitates standardized media replenishment and organoid recovery protocols to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations when extending to other epithelial systems or genetic backgrounds.
- Limited by the technical challenge of matrix manipulation and the need for careful media removal to avoid disrupting organoid rings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Plating Sorted Prostate Epithelial Cells into Primary Mouse Organoid Culture
3:29
Extracting Protein Lysate from Prostate Organoids for Western Blot Analysis
4:50
Fixing and Staining Prostate Organoids for Immunohistochemical Analysis by Whole-Mount Confocal Microscopy
6:44
Tissue Clearing and Mounting of the Stained Prostate Organoids for Whole-mount Confocal Microscopy
7:57
Results: Analysis of Lineage Marker Expression in Prostate Organoids by Western Blot and Whole-Mount Confocal Microscopy
9:44
Conclusion
