Name: 方法来研究上皮转运蛋白功能和表达在纯肠和Caco-2细胞生长在3D (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学习使用三维Caco-2细胞培养和Ussing室技术研究肠道上皮转运蛋白功能与表达的方法。该技术可精确测量SERT等转运蛋白调控机制，为开发治疗运输功能障碍相关疾病的新药提供重要筛选平台。

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我们感谢 RKG 实验室的医学博士/博士生 Christopher Manzella 先生，他协助我们编辑和校对了手稿。

1. 利用Caco-2细胞的三维培养系统研究肠道转运蛋白：在胶状蛋白质混合物上培养三维Caco-2细胞
<ol>
	<li>在冰上解冻生长因子减少的明胶状蛋白混合物，持续8小时（或过夜）于4 °C。解冻后，分装成1 mL或500 µL等份，用于实验或储存于-20 °C以备后续使用。</li>
	<li>在培养当天，将培养板（用于RNA和蛋白质提取）或带孔载玻片（用于免疫染色）预先置于冰上冷却。向八孔玻璃腔室载玻片的每个孔中加入30 µL明胶状蛋白混合物（若使用6孔板，则每孔加入120 µL），并均匀铺展。操作过程中注意避免产生气泡。</li>
	<li>将载玻片或培养板放入37 °C细胞培养箱中，静置15–30分钟，使明胶状蛋白混合物凝固。</li>
	<li>在明胶状蛋白混合物凝固的同时，用胰蛋白酶消化一个融合度达到100%的Caco-2细胞培养瓶。</li>
	<li>计数细胞数量，并在台式离心机中以500 × g离心5分钟。根据需要将细胞沉淀重悬于3D Caco-2培养基中。</li>
	<li>以每孔4,000个细胞的密度接种玻璃腔室载玻片（对于培养板，每孔接种20,000个细胞）。将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养，每3–4天更换一次培养基。</li>
</ol>
2. 三维 Caco-2 细胞中上皮转运蛋白的免疫荧光染色：第 1 天
<ol>
	<li>吸弃培养基，加入 400 µL 2% 多聚甲醛（PFA）（溶于 PBS 中，用 NaOH 调节 pH 至 8.5），室温固定细胞 30 分钟。 
	注意：PFA 溶液在 4 °C 下储存不应超过 1 周，建议使用新鲜配制的溶液。警告：PFA 具有高毒性，且可能为致癌物。务必在通风橱中操作，并佩戴个人防护装备，谨慎处理。</li>
	<li>用 1× PBS 洗涤孔板两次，将玻片置于含 PBS（400 µL/孔）的容器中，于 4 °C 保存。固定后样品可在 4 °C 下保存最多一周。</li>
	<li>将培养腔室玻片恢复至室温（此步骤可使凝胶状蛋白混合物硬化，便于后续洗涤过程中吸液操作）。</li>
	<li>用含 0.5% Triton 的 PBS 处理细胞，时间不超过 15 分钟。</li>
	<li>配制 PBS-甘氨酸缓冲液（130 mM NaCl，7 mM Na2HPO4，3.5 mM NaH2PO4，100 mM 甘氨酸）。于室温下用 1× PBS-甘氨酸缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>配制免疫荧光缓冲液（IF）：130 mM NaCl，7 mM Na2HPO4，3.5 mM NaH2PO4，100 mM 甘氨酸，7.7 mM NaN3，0.1% BSA，0.2% Triton X-100，0.05% Tween-20。</li>
	<li>用 IF 缓冲液于室温洗涤 3 次，每次 10 分钟。用含 5% 正常山羊血清（NGS）的 IF 缓冲液进行封闭。加入用 IF 缓冲液加 1% 山羊血清稀释的一抗，每孔 200 µL，室温孵育 1–2 小时。再用 IF 缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>加入用 IF 缓冲液加 1% NGS 稀释的二抗（1:200），每孔 200 µL，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 IF 缓冲液洗涤 3 次，每次 10 分钟。从本步骤起，需将玻片避光保存。通过将腔室玻片放入黑色支架中，并将白色剥离片沿支架滑动至其边缘接触孔边缘，从而将塑料腔室从玻璃玻片上轻轻揭下。缓慢提起腔室（支架和剥离片应随培养玻片配套提供）。</li>
	<li>用抗荧光淬灭封片剂封片，室温干燥 10 分钟。</li>
	<li>完全干燥后，用指甲油密封玻片，使用共聚焦显微镜成像。玻片可于 4 °C 保存两周，或于 -20 °C 保存数月。</li>
</ol>
3. 从三维Caco-2细胞中提取RNA和蛋白质
<ol>
	<li>将培养在明胶蛋白混合物上的细胞用测试试剂（如 TGF-β1（10 ng/mL，1 h））处理 12–14 天&#160;。</li>
	<li>处理后，用 1× PBS 洗涤细胞，并将细胞置于冰上 30 分钟，以使明胶蛋白混合物液化。</li>
	<li>用预冷的 PBS 洗涤孔板，将细胞分别收集至离心管中。在 4 °C 条件下，以 500 × g 低速离心 10 分钟收集细胞。按照标准操作提取 RNA，并进行实时 RT-PCR 分析。</li>
	<li>进行蛋白提取时，使用含有 1× 蛋白酶抑制剂混合物的 1× 细胞裂解缓冲液裂解细胞。向细胞沉淀中加入裂解缓冲液后，通过超声处理裂解细胞，并在 4 °C 条件下以 7,500 × g 离心 10 分钟以去除细胞碎片。</li>
</ol>
4. 利用尤斯室测量小鼠回肠5-HT摄取：肠道制备与浆肌层剥离
<ol>
	<li>处死动物后，解剖小鼠并取出小肠（胃之后、盲肠之前）。将小肠分为三段，弃去中段，近端三分之一作为空肠使用，远端三分之一作为回肠使用。避免从肠系膜附着处牵拉肠道，以防损伤上皮。用预冷的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐（KBR）缓冲液覆盖组织，保持低温。</li>
	<li>用剪刀纵向剪开肠道。在进行浆肌层剥离前，将新鲜切除的肠段置于含 1 µM 吲哚美辛的冰浴、持续通气的 KBR 缓冲液中孵育 10 分钟。</li>
	<li>将肠段（长约 1 cm）黏膜面向下固定在含有 7% 琼脂糖或固化硅橡胶（厚度 0.5 cm）的培养板上。</li>
	<li>在配有底部照明的解剖体视显微镜下剥离浆肌层。使用羽毛刀片切割浆肌层，用精细镊子沿肠段长轴方向夹住该层边缘进行剥离。 
	注意：在剥离过程中，体视显微镜的底部照明有助于识别并避开派尔集合淋巴结区域。</li>
	<li>完成浆肌层剥离后，小心将黏膜组织固定于 Ussing 半室腔的固定针上。在整个操作过程中，应仅夹持剥离后黏膜组织的边缘，避免撕裂。</li>
</ol>
5. 平衡与组织处理
<ol>
	<li>配制 Krebs 溶液：115 mM NaCl、25 mM NaHCO3、2.4 mM K2HPO4、1.2 mM CaCl2、1.2 mM MgCl2 和 0.4 mM KH2PO4，pH 7.4，用 95% O2/5% CO2 混合气体饱和，37 °C 恒温。在浆膜侧浴液中加入 10 mM 葡萄糖作为能量底物，在黏膜侧浴液中加入 10 mM 甘露醇以维持渗透平衡。 
	注意：Krebs 溶液中需添加 L-抗坏血酸（100 µM）和反苯环丙胺（100 µM，单胺氧化酶抑制剂），以防止细胞内 5-HT 降解。</li>
	<li>将滑片插入腔室，使组织的顶端（管腔）侧和基底外侧（浆膜）侧均暴露于 Krebs 溶液中。</li>
	<li>经过 10 分钟的平衡期后，在顶端侧加入氟西汀（10 µM）预处理回肠组织 30 分钟，用于测定 Jm-s（黏膜至浆膜方向的转运通量）。</li>
	<li>在基底外侧加入 TGF-β1（10 ng/mL）处理 1 小时，随后在顶端侧加入 3[H]-5-HT（20 nM）孵育 30 分钟。</li>
</ol>
6. 黏膜至浆膜转运量（Jm-s）及组织中3[H]-5-HT蓄积的定量分析
<ol>
	<li>从浆膜侧储液池中收集0.75 mL等份样品（总量5 mL），用液体闪烁计数器测定放射性，以计算黏膜至浆膜（Jm-s）的转运速率；氟西汀敏感性转运代表SERT介导的3[H]-5-HT摄取。</li>
	<li>为避免在转运期间黏膜两侧产生静水压差，应从浆膜侧取样，并以相同体积的灌流液补充替换。 
	注意：转运速率计算时需校正终末样品的稀释因素（4.25 mL / 5 mL = 0.85）。</li>
	<li>为定量组织中积累的3[H]-5-HT，将黏膜从滑片上取下，用冰冻KRB缓冲液冲洗一次，然后置于玻璃培养管中。</li>
	<li>将黏膜在0.5 mL含10% KOH的溶液中37 °C过夜孵育。取150 µL裂解液等份样品（每样本设三个复孔），用液体闪烁计数器测定放射性。</li>
	<li>取裂解液等份样品（3–5 µL）采用Bradford法测定蛋白浓度。 
	注意：含放射性5-羟色胺的10 mL孵育液作为标准品。组织中保留的5-HT以pmol/mg蛋白/分钟表示。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

完全分化的Caco-2细胞单层已被广泛用作极化上皮单层模型，以研究肠道转运过程10,11,12,13,14,15。然而，为了更好地模拟肠道上皮细胞的生理结构，近年来对建立三维（3D）培养条件下的Caco-2细胞模型产生了浓厚兴趣。目前已开发出多种用于肠道上皮细胞的三维细胞培养模型，这些模型相较于二维（2D）系统，能更真实地模拟细胞间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，具有更高的生理相关性16。因此，含有常见组分（如层粘连蛋白、IV型胶原和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）的基于ECM的天然水凝胶被广泛用于构建三维细胞培养体系16。
<p clas...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.

Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

肠上皮具有多种转运蛋白（通道蛋白、ATP酶、共转运蛋白和交换蛋白），可执行多种功能，从吸收营养物质、电解质和药物，到向肠腔分泌液体和离子。转运蛋白可产生电化学梯度，从而介导离子或分子的定向移动。这一过程通过转运系统在极化上皮细胞的顶膜和基底外侧膜上的不对称分布而实现。此外，连接相邻上皮细胞的紧密连接在此过程中也发挥重要作用，其作为屏障可阻止组分在顶膜与基底外侧膜区域之间的膜内扩散。为了研究上皮转运系统的功能，建立能够恰当模拟天然肠道特征（即&#160;极性、分化状态以及紧密连接完整性）的模型系统至关重要。
在模型方面，目前肠道上皮转运研究中常用的典型细胞系包括Caco-2，该细胞系作为完全分化的吸收性小肠上皮细胞模型；以及T84细胞或HT-29亚克隆，二者为来源于隐窝的大肠上皮细胞模型1通常，这些细胞系在塑料表面或包被的Transwell小室中以单层形式培养。Transwell细胞培养小室在一定程度上模拟了 体内 环境，使极化细胞能够从基底侧进行营养摄取。然而，传统的二维培养方法存在局限性&#160;培养系统的一个局限在于，细胞被迫适应一种人工的、平坦且刚性的表面，因此二维系统无法准确反映天然上皮组织的生理复杂性。这一局限已通过三维细胞培养技术得到克服&#160;在特定的微环境（如含有多种细胞外基质成分的明胶状蛋白质混合物）中2,3然而， 体外 培养物无法模拟肠道上皮的复杂性，后者在肠道中具有多种细胞类型和区域特异性的结构。因此，利用细胞培养模型开展的研究需要在天然肠道中进一步验证。使用 体外 3D细胞培养与小鼠肠道黏膜，本文介绍了研究肠道5-羟色胺转运体（SLC6A4，SERT）调控的简单方法。
SERT 转运蛋白通过一种依赖 Na+/Cl- 的快速转运过程，调控一种重要激素和神经递质——5-羟色胺（5-HT）——在细胞外的可利用性。SERT 是已知的抗抑郁药物作用靶点，近年来也被认为是腹泻和肠道炎症等胃肠道疾病的一种新型治疗靶点。先前已有方法用于研究肠上皮细胞中 5-HT 的摄取。例如，已有研究表明，在塑料支持物或可渗透插件上培养的 Caco-2 细胞，在顶膜和基底侧膜区域均表现出对氟西汀敏感的 3H-5-HT 摄取4。我们此前也描述了从人类器官捐献者小肠组织制备的分离刷状缘膜囊泡（BBMVs）中检测 SERT 功能的方法5。在人源 BBMVs 中，3H-5-HT 的摄取表现为对氟西汀敏感、依赖 Na+/Cl-，并呈现饱和动力学特征，其 Km 值为 300 nM5。采用类似方法，我们此前还测量了小鼠肠道 BBMVs 中以 3H-5-HT 摄取为指标的 SERT 功能6。然而，纯质膜囊泡的制备需要大量组织黏膜。其他方法，如通过放射自显影技术可视化 3H-5-HT 摄取位点，也已在豚鼠和大鼠小肠中得到应用7。
Ussing室提供了一种更为生理性的系统，用于测量离子、营养物质和药物通过各种上皮组织的转运。Ussing室技术的主要优势在于能够精确测定完整、极化肠上皮的电学和转运参数。此外，为了最大限度减少内在神经肌肉系统的影响，可对肠黏膜进行浆膜肌层剥离，以研究上皮中转运蛋白的调控机制8。
我们证明，在明胶蛋白基质上以三维方式培养的Caco-2细胞可形成具有中空管腔的结构，并表达不同的顶端和基底外侧标志物。这些细胞中SERT的表达水平高于二维培养的Caco-2细胞。本文描述了三维细胞培养、免疫染色以及RNA和蛋白质提取的方法。此外，我们还介绍了利用Ussing室技术研究转化生长因子-β1（TGF-β1，一种多效性细胞因子）在小肠黏膜中对SERT功能与调控作用的方法。

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg; HTB&amp;shy;37&amp;trade;</td><td>细胞</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>共聚焦成像显微镜</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;[H]-5-HT&amp;nbsp;</td><td>LabtekII</td><td>152453</td><td>用于显微镜观察的细胞培养</td></tr><tr><td>5-HT&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td>非危险物质</td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;- 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气瓶</td><td>KPL</td><td>71-00-27</td><td>非危险物质</td></tr><tr><td>琼脂（用于琼脂平板）</td><td>Fischer</td><td>BP151-100</td><td>急性毒性，经口</td></tr><tr><td>琼脂（用于电极）</td><td>Sigma</td><td>G7126-1KG</td><td>非危险物质</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 鬼笔环肽</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td>非危险物质</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>吞咽或吸入有害</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>LifeTechnologies</td><td>A12380</td><td>非危险物质</td></tr><tr><td>Caco-2 细胞</td><td>Sigma</td><td>A8806-5G</td><td>非危险物质</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液</td><td>Fischer</td><td>BP337-100</td><td>非危险物质</td></tr><tr><td>载玻片（Chabered slides）</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td>非危险物质</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原溶液</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>电极</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>用作细胞外基质</td></tr><tr><td>氟西汀</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Cell Signaling, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸&amp;nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁计数器&amp;nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>70013--032</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Meta</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>EM-CSYS-8</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>P2304</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>VCC MC8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>DM MC6</td><td></td></tr><tr><td>多通道电压/电流钳</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>P2300</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&amp;nbsp;</td><td>P2023-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS, 10%）</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen-Strp）</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>蛋白检测试剂</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>10420</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>MEDOX, Chicago, IL&amp;nbsp;</td><td>style G- 12300</td><td></td></tr><tr><td>RNA easy Mini 试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>单通道电极输入模块&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Snapwell 小室用载玻片</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>F132</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>T7039</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>Perkin-Elmer,Waltham, MA</td><td>NFT1167250UC</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td><td>B1600</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>尤斯室（仅室体）</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>尤斯室系统</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr></tbody></table>

研究天然肠道和三维培养的caco-2细胞中上皮转运蛋白功能与表达的方法

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

肠上皮具有重要的转运和屏障功能，在维持机体正常生理功能的同时，可对外来颗粒提供屏障作用。上皮转运功能（离子、营养物质或药物）受损与多种疾病相关，并可能产生超出转运蛋白正常生理功能的影响，例如影响上皮完整性及肠道微生物组。理解转运蛋白的功能及其调控机制，对于开发更有效的治疗干预手段至关重要。上皮转运研究中最大的挑战在于建立一个能够重现原代肠上皮细胞重要特征的合适模型系统。目前上皮转运研究中通常采用多种体外（in vitro）细胞培养模型，如Caco-2、T-84和HT-29-Cl.19A细胞。这些细胞系代表了对上皮建模的简化方法，已被广泛应用于多种机制研究，包括上皮-微生物相互作用的探讨。然而，单层细胞培养无法准确反映细胞间的相互作用以及体内（in vivo）微环境。三维（3D）培养的细胞已被证明是药物通透性研究中颇具前景的模型。我们展示Caco-2细胞在三维条件下可用于研究上皮转运蛋白。此外，对Caco-2细胞的研究应结合其他模型，以排除细胞特异性效应，并充分考虑原代肠道的复杂性。此前已有多种方法用于评估转运蛋白的功能，例如外翻肠囊法、分离的上皮细胞或分离的质膜小泡中的摄取实验。鉴于当前在模型构建和转运功能检测方面所面临的挑战，本文展示了一种在三维条件下培养Caco-2细胞的实验方案，并描述了使用尤斯灌流室（Ussing chamber）作为有效手段，用于测量完整极化肠上皮中5-羟色胺（serotonin）的转运过程。

三维Caco-2囊状结构中的免疫染色如图所示 图1一张显示用鬼笔环肽-肌动蛋白染色的三维囊肿中界限清晰管腔的XY平面代表性图像如图所示 图1A腔面朝向的一侧为顶膜侧。在三维环境中培养的上皮细胞可形成稳定的上皮表型。第12天共染肌动蛋白与SERT的不同Caco-2囊状结构如图所示。 图1B. 在此XY平面的示意图中（不同于图中所示的平面） 图1A），可见SERT染色主要位于管腔膜，并伴有顶下区域的染色。 图2 表明，与在12孔板上以单层培养的Caco-2细胞相比，3D囊肿中的SERT蛋白水平更高th 接种后第几天。这些数据表明，Caco-2 细胞的三维培养可能触发模拟天然上皮组织的信号事件，从而导致 SERT 表达增加。 图3A 展示了Ussing腔室系统的总体概览和操作过程，并显示小肠组织固定在孔隙插针上的状态。该技术可用于评估天然肠道中上皮转运蛋白...

我们介绍了一些简单的方法，用于研究肠内5-羟色胺转运体（SERT）功能及其表达的调控，使用一种 体外 Caco-2细胞的三维细胞培养模型&#160;和一个 离体 小鼠肠道模型。这些方法适用于其他上皮转运蛋白的研究。

研究天然肠道和三维培养的Caco-2细胞中上皮转运蛋白功能与表达的方法

肠上皮具有重要的转运和屏障功能，在维持机体正常生理功能的同时，还提供……

本实验方案的总体目标是在三维条件下培养肠道Caco-2细胞，并演示在5-羟色胺转运体调控研究中使用尤辛室（Ussing chamber）的方法。此处展示的方法可解答上皮转运领域中的关键问题，例如肠道5-羟色胺转运体（SERT）是如何被调控的。三维培养Caco-2细胞的主要优势在于，与单层细胞相比，其能更准确地反映细胞间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。Ussing chamber 技术能够对肠上皮的转运功能进行精确测量。3D Caco 培养模型的应用拓展至治疗药物的发现，因为这些模型可用于筛选针对转运功能异常相关疾病的干预药物。尽管该方法可用于研究五羟色胺转运体的调控机制，也可应用于其他电解质转运体（如钠离子和氯离子转运体）的研究。这些技术的可视化演示至关重要，因为剥离血清肌层以及将肠黏膜安装到尤西 chamber 中均难以掌握。3D Caco-2 细胞实验操作将由本课程指导教师 Ishita Chatterjee 和我团队的博士后研究员 Anoop Kumar 演示。从小鼠回肠剥离血清肌层的操作将由我实验室的高级研究专家 Sangeeta Tyagi 演示。此外，来自我实验室的指导教师 Shubha Priyamvada 和 Arivarasu Natarajan 将演示剥离黏膜的安装以及将其放入尤辛室的过程。首先，在4°C冰箱中将去除了生长因子的凝胶状蛋白溶液置于冰上过夜解冻。解冻后，准备1毫升或500微升的等分试样。在培养当天，将八孔载玻片置于冰上预冷。随后，向八孔载玻片的每个孔中加入30 µL凝胶状蛋白溶液，并均匀铺展。在将凝胶状混合物接种至载玻片或培养板时，应小心避免产生气泡，以免细胞脱落。将培养皿放入37摄氏度的细胞培养箱中孵育15至30分钟，使溶液凝固。接着，使用胰蛋白酶将融合生长的Caco-2细胞从培养瓶中消化下来。然后，在血细胞计数板中对细胞进行计数，并在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。将所得的细胞沉淀重悬于3D Caco-2培养基中，以获得所需密度的细胞悬液。使用制备好的细胞悬液，每孔接种4,000个细胞至玻璃腔室载玻片上，并在37°C、5%二氧化碳的湿润培养箱中培养12至14天。对细胞进行染色时，首先吸除培养基，然后用400 µL的2% PFA固定细胞。室温下继续固定细胞20分钟。用PBS洗涤细胞两次后，使用含0.5% Triton的PBS溶液对细胞进行通透处理，时间不超过15分钟。随后用PBS甘氨酸缓冲液冲洗细胞两次，再将通透后的细胞置于免疫荧光缓冲液（IF buffer）中，室温下洗涤10分钟。使用含5%正常山羊血清的IF缓冲液封闭细胞。然后，在室温下用200 µL含1%山羊血清的IF缓冲液稀释的一抗抗体孵育细胞，孵育时间为1至2小时。孵育后，用IF缓冲液洗涤细胞3次。将洗涤后的细胞与200微升用IF缓冲液稀释的二抗（含1%山羊血清）在室温下孵育一小时。用IF缓冲液洗涤细胞三次，每次十分钟。为从载玻片上拆卸腔室，先将载玻片放入载玻片底座架中，然后将白色起子插入架中，滑动至接触孔边缘。轻轻拉动腔室，将其从载玻片上取下。使用带盖的黑色盒子保护载玻片免受光照。用抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片。将载玻片在室温下干燥十分钟后，成像前用指甲油封固。按照文本方案中描述的步骤分离小鼠回肠。然后，用剪刀沿纵轴切开肠道。将所得组织切片置于含1 μM吲哚美辛的冰冻通气KBR缓冲液中孵育10分钟。将长约1厘米的肠段（黏膜面朝下）固定于含有0.5厘米厚7%琼脂糖或固化硅胶弹性体的培养板上。在底部透射照明的解剖体视显微镜下，剥离浆膜肌层。然后，用羽毛状手术刀片切开浆肌层。使用精细镊子沿肠管纵轴提起该层边缘。最后，小心地将黏膜固定在切片滑动器的针上。用镊子夹住剥离的黏膜组织边缘，以避免撕裂。将剥离的回肠黏膜固定在载片的针钉上时，应注意防止组织在针头处撕裂，并尽量减少对组织边缘的损伤。在处理组织前，预先准备好用95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和的Krebs溶液。然后将溶液倒入Ussing chamber中。在浆膜侧浴槽中加入10 µM葡萄糖作为能量底物，在黏膜侧浴槽中加入10 µM甘露醇以维持渗透平衡。随后，将固定有黏膜的滑片插入 chamber 中，使组织的顶膜侧和基底外侧均暴露于Krebs溶液中。将回肠组织在浴液中平衡10分钟。然后，用10微摩尔氟西汀预处理组织的顶端侧30分钟，以测定黏膜至浆膜侧的转运通量。最后，用10纳克/毫升TGF-β1处理组织的基底外侧1小时，随后在顶端侧加入20纳摩尔氚标记的5-羟色胺孵育30分钟。为计算黏膜至浆膜的转运速率，从浆膜侧储液器中收集 0.75 毫升等分试样，并以相同体积的灌流液替代，以防止黏膜两侧产生静水压差。为定量组织中积累的氚标记 5-HT，从载片上取下黏膜组织，用冰冻的 KRB 缓冲液洗涤一次，然后置于玻璃培养管中。将黏膜组织置于 0.5 毫升 10% KOH 中，在 37 摄氏度下孵育过夜以裂解组织。然后，取裂解液 150 微升等分试样，每份测定三次，使用液体闪烁计数器测量放射活性。采用 Bradford 法，测定裂解液中三至五微升等分试样的蛋白质浓度。图中所示为在三维培养条件下生长的Caco-2囊泡，经肌动蛋白染色，以及同时染色肌动蛋白、细胞核和SERT蛋白的Caco-2三维囊泡。SERT在管腔膜及近顶端区室中可见。为进一步证实Caco-2三维球体相较于二维Caco-2单层细胞的优势，进行了SERT蛋白表达的蛋白质印迹分析。结果显示，与2D培养的Caco-2细胞相比，Caco-2 3D球体中SERT蛋白的表达增强。最后，采用Ussing腔室系统证明TGF-β可增加黏膜到浆膜的转运通量，反映出5-HT从管腔膜的摄取增加，并与回肠黏膜中观察到的5-HT积累增强一致。这些发现得到了氟西汀处理对5-HT摄取的敏感性实验的支持，该敏感性与管腔膜上SERT的表达相对应。一旦掌握，剥离和安装回肠黏膜的这一技术可在15分钟内完成。采用该操作步骤时，需注意从动物体内取出后，肠外肠组织样本的活性有限，通常最多维持三小时。三维Caco-2囊状细胞可用于多种研究，例如膜转运过程、基因表达或上皮转运蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。该3D Caco-2技术建立后，为肠道转运领域的研究人员探索液体运动以及研究肠道疾病的病理生理学机制提供了新的途径。请务必注意，操作放射性物质可能具有极高危险性，必须采取相应防护措施，例如使用个人防护装备（PPE）并严格执行去污程序。观看本视频后，您将能够培养3D培养体系中的Caco-2细胞，并利用这些培养体系研究上皮转运蛋白的表达。您还将能够利用尤斯灌流室研究天然小鼠肠道中五羟色胺的转运功能。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

方法来研究上皮转运蛋白功能和表达在纯肠和Caco-2细胞生长在3D

许多治疗应用需要将药物载体及其携带的药物安全高效地转运通过体内的细胞屏障。本文介绍了一种对已有方法的改进，用于评估药物纳米载体（NCs）通过细胞屏障（如胃肠道（GI）上皮）的转运速率和机制。...

评估药物递送系统跨细胞屏障转运的模型与方法

利用Caco-2细胞研究肠道脂质转运

我们介绍了从肠道中分离三维结构的实验方案 体内 组织和 体外...

Ex Vivo 肠组织和 3D In Vitro 肠类器官中微管和中心体蛋白的免疫荧光标记

本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。...

人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

本文介绍了两种评估肠道屏障功能的方法。使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）直接在组织培养板孔中测量培养上皮细胞的跨上皮电阻，以评估其屏障完整性。在小鼠中，采用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）灌胃法测定肠道通透性。 体内.

体外 与 体内 评估肠上皮细胞通透性的方法

本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。...

用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

本文介绍一种用于量化小肠类器官屏障完整性的技术。该方法基于活体类器官，能够以时间分辨的方式连续检测不同屏障完整性调节物质或其组合的影响。...

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本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。...

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

学习使用三维Caco-2细胞培养和Ussing室技术研究肠道上皮转运蛋白功能与表达的方法。该技术可精确测量SERT等转运蛋白调控机制，为开发治疗运输功能障碍相关疾病的新药提供重要筛选平台。

研究天然肠道和三维培养的Caco-2细胞中上皮转运蛋白功能与表达的方法

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