Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

该方案的总体目标是在三个维度上培养肠道 Caco-2 细胞，并展示 Ussing 室在血清素转运蛋白调节研究中的应用。这里显示的方法可以回答上皮转运领域的关键问题，例如肠道血清素转运蛋白 SERT 是如何调节的。3D Caco-2 的主要优点是它们比单层更准确地反映细胞间和细胞间细胞外基质的相互作用。

Ussing 腔室技术可以精确测量肠上皮的运输功能。3D Caco 培养物的含义延伸到治疗药物的发现，因为这些模型能够筛选与运输功能改变相关的疾病的药物。虽然这种方法提供了对 5-羟色胺转运蛋白调节的见解，但它也可以应用于其他电解质转运蛋白（如钠和氯化物）的研究。

这些技术的视觉演示至关重要，因为剥离浆膜肌肉层并将肠粘膜安装在 Ussing 腔室中很难学习。演示 3D Caco-2 细胞程序的讲师 Ishita Chatterjee 和我们小组的博士后研究员 Anoop Kumar 将负责演示。演示从小鼠回肠剥离血清肌层的是我实验室的高级研究专家 Sangeeta Tyagi。

我实验室的讲师 Shubha Priyamvada 和 Arivarasu Natarajan 也将演示剥离粘膜的安装并将其插入 Ussing 腔室。首先，将生长因子还原的凝胶状蛋白质溶液在 4 摄氏度的冰箱中在冰上解冻过夜。解冻后，准备 1 毫升或 500 微升等分试样。

在培养当天，将腔室载玻片在冰上预冷。然后，将 30 微升凝胶状蛋白质溶液加入 8 孔室载玻片的每个孔中，并均匀涂抹。在腔室载玻片或板中接种凝胶状混合物时，应注意避免形成气泡，因为细胞可能会分离。

将培养皿放入 37 摄氏度的细胞培养箱中 15 至 30 分钟，让溶液凝固。接下来，使用胰蛋白酶，从培养瓶中分离汇合的 Caco-2 细胞。然后，在血细胞计数器中计数细胞，并在 4 摄氏度下以 500 倍 g 离心 5 分钟。

所得细胞沉淀重悬于 3D Caco-2 培养基中，以获得所需密度的悬浮液。使用制备的细胞悬液，将每孔 4， 000 个细胞接种到玻璃室载玻片上，并让它们在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳加湿培养箱中生长 12 至 14 天。要对细胞进行染色，首先吸出培养基并用 400 μL 2% PFA 固定细胞。

在室温下继续固定细胞 20 分钟。在 PBS 中洗涤细胞两次后，用 PBS 中的 0.5% Triton 溶液透化细胞，渗透时间不超过 15 分钟。在 PBS 甘氨酸缓冲液中冲洗细胞两次，然后在室温下在 IF 缓冲液中洗涤透化细胞 10 分钟。

在 IF 缓冲液中使用 5% 正常山羊血清封闭细胞。然后，将细胞与 200 μL 一抗（在补充有 1% 山羊血清的 IF 缓冲液中稀释）在室温下孵育 1 至 2 小时。孵育后，用 IF 缓冲液洗涤细胞 3 次。

将洗涤后的细胞与 200 μL 二抗（在补充有 1% 山羊血清的 IF 缓冲液中稀释）在室温下孵育 1 小时。用 IF 缓冲液洗涤细胞 3 次，持续 10 分钟。要拆下载玻片的腔室，首先将载玻片放入载玻片底座支架中，然后将白色升降器滑过支架，直到它接触到孔的边缘。

轻轻拉动腔室，将其从载玻片上取下。使用带盖的黑匣子保护载玻片避光。用慢速抗褪色介质安装载玻片，并用盖玻片覆盖它们。

让载玻片在室温下干燥 10 分钟后，在成像前用指甲油密封。按照文本协议中描述的步骤分离小鼠回肠。然后，用剪刀纵向打开肠道。

将所得组织切片在含有 1 微摩尔吲哚美辛的冰冷放气 KBR 缓冲液中孵育 10 分钟。将大约 1 厘米长的肠切片（粘膜面朝下）固定在含有 0.5 厘米厚的 7% 琼脂糖或固化硅弹性体的板上。使用具有底部照明的解剖立体显微镜，剥离血清肌肉层。

然后，用羽毛手术刀刀片切开浆膜肌肉层。使用细镊子沿肠纵轴提起层的边缘。最后，小心地将粘膜安装在滑块的销钉上。

握住剥离的粘膜组织的边缘，以避免撕裂。将剥离的髂粘膜安装在滑块的销钉上时，应采取预防措施以防止撕裂针头处的组织，并尽量减少对组织边缘的损坏。在组织处理之前，准备用 95% 氧气、5% 二氧化碳气化的 Krebs 溶液。

然后，将溶液倒入 Ussing 腔室中。将 10 微摩尔葡萄糖作为能量底物添加到浆膜浴中，加入 10 微摩尔甘露醇以维持粘膜浴的渗透平衡。随后，将带有安装粘膜的滑块插入腔室，以将组织的顶端和基底外侧暴露于 Krebs 溶液中。

在浴中平衡回肠组织 10 分钟。然后，用 10 μmol 氟西汀预处理根尖侧 30 分钟，以测量粘膜到浆膜通量。最后，用 10 ng/ml TGF β 1 处理组织的基底外侧 1 小时，然后用 20 纳摩尔氚化 5-HT 孵育顶端 30 分钟。

要计算粘膜到浆膜通量率，请从浆膜储液器中收集 0.75 毫升等分试样，用相同体积的浴介质代替它们，以防止粘膜上的静水压力差。为了量化组织中积累的氚化 5-HT，请从滑块上去除粘膜。用冰冷的 KRB 缓冲液洗涤一次，然后将其放入玻璃培养管中。

将粘膜在 0.5 毫升 10% KOH 中于 37 摄氏度孵育过夜以裂解组织。然后，使用液体闪烁计数器测量 150 微升等分试样裂解物的放射性，一式三份。使用 Bradford 方法，测量 3 至 5 微升裂解物等分试样中的蛋白质浓度。

此处显示的是在 3D 培养物中生长的肌动蛋白染色的 Caco-2 包囊，以及同时对肌动蛋白、细胞核和 SERT 蛋白进行染色的 Caco-2 3D 包囊。SERT 在管腔膜和根尖下隔室中可见。为了进一步证实 Caco-2 3D 球体优于 2D Caco-2 单层，对 SERT 蛋白表达进行了蛋白质印迹分析。

结果显示，与 2D Caco-2 细胞相比，Caco-2 3D 球体中 SERT 蛋白的表达增强。最后，使用 Ussing 腔室系统显示 TGF β 增加粘膜到浆膜通量，反映出管腔膜对 5-HT 摄取的增加和回肠粘膜中观察到的 5-HT 积累增强。观察到的 5-HT 摄取对氟西汀治疗的敏感性支持了这些发现，这与管腔膜上的 SERT 表达相对应。

一旦掌握，这种剥离和固定回肠粘膜的技术可以在 15 分钟内完成。在采用此程序时，重要的是要记住，从动物中取出后，extravio 肠道准备物的活力有限，可能会持续长达三个小时。3D Caco-2 囊肿可用于各种研究，例如膜运输事件、基因表达或上皮转运蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。

3D Caco-2 技术开发后，为肠道运输领域的研究人员探索液体运动和研究达里亚尔病的病理生理学铺平了道路。不要忘记，与放射性一起工作可能非常危险，应始终采取预防措施，例如使用 PPE 和适当的去污程序。观看此视频后，您将能够在 3D 培养物中培养 Caco-2 细胞，并利用这些培养物来研究上皮转运蛋白表达。

您还可以利用 Ussing 室来研究天然小鼠肠道中的血清素转运功能。