Name: 斑马鱼系统中水气单胞菌、分枝杆菌和Pseudocapillaria 毛白杨的环境筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 了解斑马鱼系统中环境病原体筛查方法，使用集水池拭子和污泥分析检测嗜水气单胞菌、分枝杆菌和Pseudocapillaria tomentosa。该技术可减少监测用鱼数量，优化成本与检测灵敏度，加强水生生物安全。

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作者感谢弗朗西斯·克里克研究所BRF水生团队提供的技术支持和宝贵意见。本工作由弗朗西斯·克里克研究所资助，该研究所的核心资金来自英国癌症研究组织（FC001999）、英国医学研究理事会（FC001999）和惠康基金会（FC001999）。

1. 将循环系统外的预过滤哨兵生物暴露
<ol>
	<li>将一个洁净的8 L水箱从循环系统中取出，用来自集水坑的水将其注满。从系统中取出2个陶瓷珠或海绵立方体形式的生物填料，用于筛选图1。加入1 - 2 D. rerio/L (即，12 条鱼）。使用本实验室内具有显性遗传背景的野生型鱼，例如 AB 品系。
	<ol>
		<li>选择至少6条鱼，具体如下：6个月以下的雌性和雄性各至少1条，6至18个月的雌性和雄性各至少1条，18个月以上的雌性和雄性各至少1条。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天饲喂一次。变换饮食（例如，干饲料，丰年虾）以确保哨兵鱼接触斑马鱼设施中使用的所有饲料类型。每周一、周三和周五换水。 即每周三次，持续4个月。
	<ol>
		<li>进行换水时，将哨兵鱼和生物滤材转移至临时水箱中。彻底排空哨兵鱼水箱并进行清洗。仅使用集水槽中的水重新注满哨兵鱼水箱。将哨兵鱼和生物滤材放回原位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将哨兵生物暴露于坑底水中4个月。采用批准的方法处死鱼类，例如将其浸入过量的2-苯氧乙醇溶液（3 mL/L）中。</li>
	<li>确认死亡时，需在鳃盖运动停止后等待10分钟。
	<ol>
		<li>用镊子夹取尸体，放入已标识的容器中，在 -80 °C 下完全冷冻。该样本将用于 PCR12,15.</li>
		<li>或者，在尾柄处剪断尾部，划破腹壁，然后置于4%甲醛溶液中固定。 
		警告：进行组织病理学操作时需佩戴手套并在通风柜中进行。对样本容器进行标记。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 集水坑拭子
<ol>
	<li>使用带有塑料杆的无菌干燥拭子。佩戴手套。确定采样表面位置（集水坑水面处的坑壁），移除妨碍接近该表面的任何物品。选择水流较缓的集水坑表面区域。</li>
	<li>拆开外层包装，取出拭子，使无菌棉头暴露于空气中。注意避免接触未经检测的表面，以防拭子交叉污染。
	<ol>
		<li>在集水坑壁上水面位置来回擦拭 5 - 10 cm，以吸收该处的水样和生物膜。</li>
		<li>将拭子重新套入保护鞘中，或将拭子头部折断放入无菌离心管中。标记样品信息，并送检进行 PCR 检测，或于 -80 °C 冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 检测水箱底部的P. tomentosa卵
<ol>
	<li>显微镜法污泥分析
	<ol>
		<li>使用一个60 mL注射器9 吸取集水坑或任何饲养鱼类（包括哨兵鱼）的水箱底部的淤泥。将样品分装至15 mL离心管中。用螺旋盖盖紧离心管，并对离心管进行标记。</li>
		<li>使用磁力搅拌器将227 g白砂糖溶于177 mL热水中，配制糖饱和溶液（比重 = 1.27）14.</li>
		<li>将15 mL离心管放入带摆桶转子的离心机中，以175 - 250 × g离心10分钟。倾去上清液，保留沉淀于原管中。</li>
		<li>将糖饱和溶液加至管子的一半高度，用螺旋盖盖紧管子，充分混匀沉淀物与溶液。</li>
		<li>将试管放入离心机摆桶中，并用饱和糖溶液注满至管口。轻轻将一片盖玻片置于每支试管顶部，使其与饱和糖溶液接触。</li>
		<li>在175 – 250 × g下离心10分钟。注意，某些盖玻片可能在离心过程中脱落并破裂，因此每个60 mL样品需使用4个离心管。取出盖玻片并放置于载玻片上。用铅笔或记号笔标记载玻片。
		<ol>
			<li>如果盖玻片破损过多，可先将大部分蔗糖饱和溶液加入离心管中，在175 - 250 × g条件下离心10分钟，随后用蔗糖饱和溶液加满至管口，再轻轻放置盖玻片，静置30分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>寻找 P. tomentosa 显微镜下的卵子13 (图2 和 视频 1）。在400倍放大倍数下识别双极塞6. 
		注意：虫卵大小为 57 - 78 µm 长，27 - 39 µm 直径16,17请注意，只要有一个阳性玻片，即可判定60 mL样本为阳性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在隔离期间对进口动物进行筛查 P. tomentosa 卵
	<ol>
		<li>设置雄性和雌性 D. rerio 在水箱中。向水箱内添加一种通常用于收集和保存产出卵子的装置，但此处用于收集粪便（图3). 
		注意：例如，一个完整的1升繁殖缸（包括外缸和带格栅底的内缸）完全浸没在13升的水族箱中，使鱼类能够自由进出繁殖装置。</li>
		<li>一周后移除培养装置，并按照步骤3.1所述收集装置中富集的污泥。 &#34;显微镜法污泥分析&#34;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 污泥沉淀物的PCR
<ol>
	<li>使用60 mL注射器9吸取储罐或集水坑底部的污泥，并将样品转移至60 mL离心管中。用螺旋盖盖紧管子并标记管子。丢弃注射器。</li>
	<li>摇动60 mL离心管，将15 mL样品转移至15 mL离心管中。用螺旋盖盖紧管子并标记管子。</li>
	<li>将15 mL离心管放入带有摆动吊篮转子的离心机中，在175 - 250 ×g条件下离心10分钟。倾去上清液，保留管中的沉淀物。</li>
	<li>通过移除外包装打开拭子，使无菌棉头暴露于空气中。注意避免拭子接触未经检测的表面，以防交叉污染。
	<ol>
		<li>用拭子在管内的沉淀物中擦拭15秒。</li>
		<li>将拭子重新套上保护鞘，或将拭子头部折断放入无菌离心管中。标记样品，于-80 °C冷冻，并送检进行PCR检测。 
		注意：60 mL管中剩余45 mL样品，可用于通过显微镜检查污泥以检测P. tomentosa卵，如步骤3.1所述，例如用于确认PCR结果。也可按照步骤3.2对进口动物进行筛查时，尝试在污泥中进行PCR检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vital+Relationship+Between+Nutrition+and+Health+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

技术的局限性、关键步骤及故障排除：
哨兵鱼的年龄、性别、品系和暴露时间尚未标准化，如表1所示。目前对6个月以下或老年鱼类的筛查非常有限。某些病原体可能主要影响幼鱼，而另一些病原体则在老年群体中更为常见10,18,19,20。类似地，在选择部分哨兵群体时并未考虑性别因素，尽管已有报道称某些病原体存在性别易感性差异21。本方案所提出的技术试图解决上述问题，尽管品系的选择也可根据特定监测病原体进行调整。例如，TU品系可能有助于检测分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）12,22，但存在哨兵鱼成为病原储存宿主或表现出临床症状的风险。关于暴露时间，Zebrafish International Resource Center 的方法通过延长污染暴露期，提高了检出潜在病原体的可能性10。然而，长时间暴露意味着哨兵鱼无法随时可用。引入环境样本可增加灵活性，并实现多次筛查。例如，可每隔一个月进行一次采样，每种筛查方法之间间隔4个月，从而缩短新引入病原体被发现之前的时间间隔。
环境筛查技术依赖于对环境中病原体的检测。病原体由鱼类排出，因此在系统水体中被稀释。通过水过滤捕获病原体的可能性23尚未被探索。我们所描述的方法仅在病原体有足够时间在鱼类和生物膜中增殖并达到可检测的污染阈值时才有效。通过关键性地选择采样位点，可最大程度降低该技术的局限性：采集的是养殖箱内的污泥而非集水槽污泥，水体和生物膜样品则采集自集水槽表面，而非养殖箱内或过滤后的水体。尽管如此，同一系统中所有样品的检测结果仍不太可能完全一致。P. tomentosa的阳性结果可通过其他检测方法（如组织病理学、PCR或污泥分析）进行确认。分枝杆菌PCR的阳性结果可通过培养或另一家诊断实验室进行验证。然而，在确定健康状况时，建议进一步采样以确认任何环境筛查技术所得出的阴性结果。
该技术相对于现有/替代方法的重要性：
Mycobacterium spp. 在环境中很常见，其在集水坑中的存在并不能预测其致病性12。Mocho9 指出，监测死亡率是调查健康问题发展情况的关键。动物样本的使用对于任何兽医调查仍然至关重要。健康监测意味着需要检测设施中所有流行病原体，而仅依靠环境筛查技术无法实现这一目标。然而，诊断工具的敏感性不足可能会延迟甚至阻碍对健康状况的准确评估。尽管使用哨兵动物可减少检测种群中流行微生物所需的鱼类数量，但鉴于敏感性不足，仍有必要结合多种方法，包括环境筛查5,23。事实上，无特定病原体（Specific Pathogen Free）状态通常定义为设施中不存在某类病原物种，因此环境样本和动物样本均需检测为阴性24,25。
用于鉴定分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）的集水槽拭子检测结果表明，仅依赖鱼类样本可能导致错误的阴性健康状态判断。所检测的6种分枝杆菌均被描述为在斑马鱼中具有致病性或潜在致病性15，其中一些菌种无法通过常规检疫中使用的氯化物对鱼卵表面进行消毒而被清除26。因此，这种假阴性结果可能对引进品系的合作单位造成一定影响。例如，M. fortuitum 在鱼类样本的PCR检测中未被检出，但在超过一半的集水槽拭子PCR检测中被发现。考虑到这些分枝杆菌对氯的抗性较强，并且能够在水系统中生长27，这对未受污染的引进机构构成了潜在风险。为了允许品系引进，管理人员需要信任并对比输出机构与其自身的健康报告。国际实验动物科学理事会（ICLAS）性能评估项目28在啮齿类动物管理中对此过程至关重要。RESAMA网络报告了在法国的D. rerio中检测到M. gordonae和M. mucogenicum11。然而，这些分枝杆菌并未包含在我们所使用的商业实验室检测面板中。因此，扩展ICLAS项目，并统一诊断检测方法以及致病菌种清单将具有重要意义29。
A. hydrophila 也是一种可能在引进动物时被带入的病原体，尽管其对氯敏感30，因此在常规鱼卵表面消毒过程中更易被消除。集水井、拭子和污泥样本的检测结果表明，环境筛查可用于检测该病原体。其他细菌如 Mycobacterium spp. 已通过 PCR 在污泥中被检出23。这类样本尤为重要，因为它能够检测到排出的病原体。例如，另一项新应用是利用污泥分析对检疫期间引进的鱼类进行 P. tomentosa 的筛查。该寄生虫对动物健康13 和肿瘤模型16 构成威胁。此外，常规斑马鱼卵表面消毒所使用的氯浓度对其无效31。因此，能够在一周内完成检测且无需实施鱼类安乐死的筛查方法显得极具吸引力。该技术可通过实现对引进动物的分级管理，影响检疫和生物安全规则。随后的决策流程将根据出口机构中流行的主要病原体、进口鱼类样本中检出的病原体，以及对引进机构健康状况造成威胁的风险来制定10。
掌握这些技术后的未来应用或发展方向：
即使选择常规检疫处理作为方案，也可通过繁殖装置污泥分析来评估此类药物治疗的效果32,33,34,35,36。更广泛而言，环境筛查可用于测试化合物在清除细菌和寄生虫方面的效果，包括在鱼类生物群落中的应用。环境筛查的另一细分应用是监测活体饵料中的病原体种群37,38。尽管这些技术的主要应用是作为斑马鱼设施健康监测诊断工具箱中的重要补充手段。由于能够更准确、高效地评估健康状况并节省成本和时间，集水槽拭子和污泥分析可与哨兵动物监测及常规检疫措施互为补充。事实上，这些技术未来将成为任何水生实验室健康报告中的常规组成部分。

为了保护科研工作与动物福利1,2在动物设施中监测病原体的存在。对于斑马鱼，健康监测3,4,5,6,7,8,9,10,11 通常依赖于对动物的分析 死后 通过组织病理学、细菌培养或分子方法进行检测。仅对群体中的动物进行检测并非推荐方法，因为要检出低流行率的病原体需耗费大量鱼类及相关费用。因此，首选方法是让少量动物暴露于较高浓度的污染物中，这些鱼类被称为过滤前哨动物（pre-filtration sentinels）。该暴露过程持续数月，会增加动物饲养人员的工作负担，或需要专门设计的工程解决方案。另一项挑战是在检疫期间对引进品系进行筛查，其中可育动物需保持存活，而这与常规的尸体检测方法不相容。
我们在此介绍一些用于检测特定斑马鱼病原体的方法（A. hydrophila，分枝杆菌 种，以及 P. tomentosa通过监测水生系统的环境来实现。其目的是减少用于健康监测的鱼类数量，并优化检测的周转时间、成本和灵敏度。这些方法可作为动物使用的替代方案，部分技术还可应用于检疫期间进口物品的筛查。例如，Mocho9 通过采集集水坑拭子进行PCR检测，而非对斑马鱼（包括哨兵鱼）进行检测，能够鉴定出更多的致病性分枝杆菌种类，且所需样本量更少。在同一项研究中， P. tomentosa 通过浮选法和显微镜检查水箱污泥，比使用PCR和组织病理学检测鱼类，能更灵敏地检测到虫卵。
表1 总结了哨点监测项目的各种特征3,4,5,6,7,8,9,10 被多家斑马鱼养殖设施采用。过滤后哨兵鱼接收水的方式与任何种群鱼相同，而过滤前哨兵鱼则是在水先流经种群鱼水族箱之后再接收该水。例如，可通过持续接收集水槽中的水，在循环系统中设置过滤前哨兵鱼。但当一个房间内存在多个独立系统时，此方法可能不可行。在此情况下，可使用一个过滤前哨兵鱼水族箱来筛查整个房间。这些哨兵鱼置于一个静态水族箱中，不接入循环系统，其换水操作定期进行，且仅使用过滤前的水。 即，来自房间内所有系统的集水。该技术在下文中作为与环境筛选效果进行比较的基线进行描述。所建议的设置旨在控制水质问题，例如pH值下降或氮污染。
细菌环境筛查的概念基于以下假设：细菌可在生物膜中被检测到，例如存在于集水坑水面处池壁上的生物膜或水箱底部污泥中的生物膜。在循环水产养殖系统中，集水坑似乎是一个理想的采样点，因为它在过滤前收集了来自所有水箱的废弃物（水、粪便、饲料及其他有机物质）。集水坑表面通常易于接触，拭子采样快速，并且可以无菌操作，以避免样本受到交叉污染（例如来自手套的污染）。该方法已被用于鉴定斑马鱼系统中流行的机会致病性Mycobacterium spp.9,12。下文描述了该技术，我们还报告了在斑马鱼集水坑表面拭子和污泥中检测到A. hydrophila的结果。
对环境中寄生虫卵的筛查基于Murray et al.13 的检测方法，浮选法已常规用于寄生虫学及粪便中寄生虫卵的显微镜筛查14。Mocho9 提出了一种采样过程的替代方法，并证明该技术可用于检测鱼类生物群落中的其他物种。感染的D. rerio会随粪便排出P. tomentosa的卵，这些寄生虫卵因密度大于水而沉积于水族箱底部的污泥中，因此可在该处收集。环境样本的处理同样利用了虫卵的密度特性：首次经离心浮选可将水和轻质碎屑与较重物质分离；第二次离心则利用饱和蔗糖溶液（其密度高于P. tomentosa卵的密度），使寄生虫卵上浮至试管表面。
通过在初次离心后获得的污泥样本沉淀物上对生物膜中的细菌以及罐底的P. tomentosa进行多重PCR检测，可将两者的病原筛查合并进行，从而优化采样时间。该方法如下所述。我们还建议在检疫环境中应用这些技术。对于需要保持存活状态的进口成年斑马鱼，可将其置于检疫罐中的繁殖装置内。一周后，收集繁殖装置内的粪便及其他排泄物，通过显微镜检查或PCR进行检测。该技术如下所述，在此过程中已通过显微镜检测到一些P. tomentosa卵。

<table><tbody><tr><td>Aqua-Sed 250 mL</td><td>Vetark</td><td></td><td>2-苯氧乙醇</td></tr><tr><td>无菌干式采样拭子管</td><td>mwe</td><td>MW100</td><td>集水坑表面</td></tr><tr><td>BD Plastipak 一次性注射器 50 mL 偏心式</td><td>贝克顿&lt;br/&gt; Dickinson</td><td>300866</td><td>它们实际上是&lt;br/&gt; 渐增至 60 ml</td></tr><tr><td>15 mL 离心管 Corning</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Centaur 2 台式离心机，配备 4 × 200 mL 摇摆转子&amp;ndash;外转子（未密封）</td><td>Sanyo</td><td>MSB020.CX1.5</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 22 mm × 22 mm</td><td>Menzel-Glaser</td><td>MNJ-350-020H</td><td></td></tr><tr><td>无菌塑料拭子 棉签头 白色帽</td><td>Sterilin有限公司 Thermo Fisher Scientific</td><td>F155CA</td><td>从污泥中采集沉积物拭子</td></tr><tr><td>50 mL 自立式离心管 CentriStar 盖</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>缸内产卵托盘装置</td><td>MBK Installations Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

环境筛选 aeromonas hydrophila, 分枝杆菌 种，以及 pseudocapillaria tomentosa 在斑马鱼系统中

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

健康监测系统的开发和使用在斑马鱼研究机构中至关重要，因为病原体的 Danio rerio 例如 Aeromonas hydrophila, 分枝杆菌 种，以及 Pseudocapillaria tomentosa 可能损害动物福利和研究结果。通常对鱼类进行分析 死后 用于检测微生物。使用哨兵动物是提高监测敏感性并减少采样动物数量的推荐方法。本文描述了在循环水系统外设置预过滤哨兵水箱的方法。该技术通过精心选择鱼类的年龄、性别和品系，旨在防止水体污染并代表整个鱼群状况。为了最大限度减少使用动物数量，还详细介绍了用于筛查环境的技术。通过对表面集水槽拭子进行聚合酶链式反应（PCR）检测，可显著提高对某些常见且具有致病性的分枝杆菌物种的检出率，例如 Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilum，以及 Mycobacterium chelonae另一种环境方法包括处理储存罐或集水坑底部的污泥，以寻找 P. tomentosa 卵。这是一种经济快速的技术，可应用于检疫环节，将繁殖装置浸入进口动物的暂养池中。最后，对污泥样本进行PCR检测。 A. hydrophila 在集水坑的底部和表面均检测到该病原体。通常，将这些环境筛查技术应用于特定病原体时，相较于过滤前哨动物的检测，其灵敏度有所提高。

与鱼类样本相比，集水槽拭子在鉴定常见分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）方面的优势得到了图4结果的支持。在检测的115条鱼类中，分别有5%和3%的样本检出M. chelonae和M. haemophilum。未发现其他致病性分枝杆菌种类。来自相同系统的49份集水槽拭子样本中，检出了5种分枝杆菌。根据假设，即通过PCR方法在表面集水槽拭子中比在鱼类样本中更频繁地检测到M. chelonae和M. fortuitum，计算其比值比。该假设具有统计学显著性，相应的比值比分别为11（95% CI：4至29；p &lt;0.0001）和306（95% CI：18至5208；p = 0.0001）。结果表明，表面集水槽拭子技术是替代仅依赖哨兵鱼对斑马鱼设施进行分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）筛查的有效方法。环境样本还被用于检测A. hydrophila。这些细菌在鱼类、污泥和表面样本中均有检出（图4）。这进一步支持了所提出技术在筛查鱼类生物群落方面的能力。
关于污泥分析以检测P. tomentosa虫卵，Mocho9通过PCR和组织病理学方法在27%的鱼类样本中检出该寄生虫，而在同一系统中分析的污泥样本中有93%检出虫卵。本研究尝试将该技术应用于检疫筛查。在此背景下，进口动物无法直接采样，因此及时评估其健康状况有助于生物安全管理工作。将来自P. tomentosa阳性设施、健康状况未知的斑马鱼置于8个配备繁殖装置的水族箱中：每13 L水体最多饲养16条鱼，包含7个转基因品系和1个野生型品系，性别混合，鱼龄为4至24个月。一周后从繁殖装置中收集污泥，并通过显微镜检查。在7个（88%）样本中观察到P. tomentosa虫卵。最后，尝试对集水坑拭子和污泥沉淀物进行PCR检测寄生虫。6份污泥样本中有4份PCR结果为阳性，而所有表面拭子样本结果均为阴性。这一结果并不意外，因为污泥筛查依赖于虫卵沉降至水族箱底部的能力。该结果表明，污泥分析技术可用于筛查D. rerio水族系统的P. tomentosa感染情况，并且该方法可被调整用于进口动物的筛查。
<img alt="用于生物学实验的水族箱中的斑马鱼；行为学研究装置，水生生物研究方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：脱离循环系统的预过滤哨兵水族箱。 一个 8 L 的水族箱中装入来自待检系统集水槽的水和生物填料。两个白色的陶瓷生物填料珠位于水族箱底部（图中中部）。根据年龄、品系和性别选择 12 条鱼，并将其加入哨兵水族箱中。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛔虫卵的显微镜图像；突出显示寄生虫的解剖结构和形态特征。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：P. tomentosa 卵在污泥显微分析过程中被检出。 放大倍数为400倍。箭头指示双极塞结构。比例尺 = 50 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于基因研究、药物筛选和发育研究的实验室鱼缸中的斑马鱼。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：浸没在鱼类饲养缸中的繁殖装置，用于收集污泥进行分析。 此鱼缸为拍照目的放置于实验台上；实际使用时则置于循环水系统中。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同细菌表面和样本PCR结果阳性百分比的条形图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：通过PCR在鱼类、表面集水坑拭子及集水坑污泥样本中检测Mycobacterium spp.、A. hydrophila和P. tomentosa的阳性率百分比。 百分比通过将每种病原菌的阳性结果数量除以检测样本总数计算得出。阳性结果百分比按样本类型分为FISH（鱼类）、SURFACE（表面）或SLUDGE（污泥），并在细菌名称后标明。共对115条鱼类和49份表面集水坑拭子样本进行PCR检测以鉴定Mycobacterium spp.。这些数据整合了Mocho的研究9结果，因为本研究是该研究的延伸。所检测鱼类主要为按第1节方案采集的过滤前哨鱼。仅在哨兵鱼不可获得时，偶尔采集逃逸鱼和老 colony 鱼（>18个月）样本。所有针对Mycobacterium spp.的系统均同时检测了鱼类和集水坑拭子样本。计算比值比（odds ratio）时假设M. chelonae和M. fortuitum通过PCR在表面集水坑拭子中的检出频率高于鱼类样本。该假设具有统计学显著性，其比值比分别为11（95% CI：4至29；p < 0.0001）和306（95% CI：18至5208；p = 0.0001）。所有样本中Mycobacterium marinum的PCR检测结果均为阴性，因此认为这些设施中不存在该菌株，未纳入分析。共对12条鱼、14份表面集水坑拭子和6份集水坑污泥样本进行A. hydrophila的PCR检测。共对6个集水坑的表面和污泥样本检测P. tomentosa的存在。PCR = 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）。CI = 置信区间（Confidence Interval）。* 和 ** 表示具有统计学显著性；其余比较无统计学显著性。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像，静态平衡；微生物，细胞分析，生物学研究。" src="/files/ftp_upload/55306/55306vid1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="视频 1"> 
视频 1：使用显微镜扫描 P. tomentosa 的卵。 载玻片来自步骤 3.1 中所述的污泥分析。通过扫描视野以检测 P. tomentosa 的卵。一旦识别到特定结构，即放大以更高分辨率确认其鉴定结果。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/video_scan_for_egg.avi" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>作者</td>
			<td>暴露开始时的年龄</td>
			<td>暴露时长</td>
			<td>采样年龄</td>
			<td>过滤前或 
			过滤后</td>
			<td>性别</td>
			<td>品系</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barton et al.3</td>
			<td>4 个月</td>
			<td>6 个月</td>
			<td>10 个月</td>
			<td>过滤前</td>
			<td>不适用</td>
			<td>不适用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borges et al.4</td>
			<td>6 个月</td>
			<td>6 个月</td>
			<td>12 个月</td>
			<td>过滤前</td>
			<td>不适用</td>
			<td>AB 野生型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collymore et al.5</td>
			<td>尽可能年轻</td>
			<td>3 个月</td>
			<td>&lt;6 个月</td>
			<td>过滤前</td>
			<td>不适用</td>
			<td>不适用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geisler et al.6</td>
			<td>4 个月</td>
			<td>4 个月</td>
			<td>8 个月</td>
			<td>过滤前和 
			过滤后</td>
			<td>不适用</td>
			<td>AB 野生型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liu et al.7</td>
			<td>3 个月</td>
			<td>1–6 个月</td>
			<td>4–9 个月</td>
			<td>过滤前和 
			过滤后</td>
			<td>不适用</td>
			<td>野生型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Martins et al.8</td>
			<td>3 个月</td>
			<td>3 个月</td>
			<td>6 个月</td>
			<td>过滤前</td>
			<td>不适用</td>
			<td>野生型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mocho9</td>
			<td>&lt;6 个月， 
			6–12 个月， 
			&gt;18 个月</td>
			<td>4 个月</td>
			<td>7–24 个月</td>
			<td>过滤前</td>
			<td>每个年龄组 
			1 只雌性和 
			1 只雄性</td>
			<td>AB 野生型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murray et al.10</td>
			<td>3–4 个月</td>
			<td>3 个月、6 个月、1 年</td>
			<td>7、10 和 16 
			个月</td>
			<td>过滤前和 
			过滤后</td>
			<td>不适用</td>
			<td>AB 野生型</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：斑马鱼设施中哨兵鱼设置的比较。 哨兵鱼可根据其年龄、性别或品系进行选择。它们在特定时间段内暴露于经过预过滤或后过滤系统的水体中。数据来源于《斑马鱼》期刊2016年关于健康的特刊3,4,5,6,7,8,9,10。

本方案描述了斑马鱼系统中集水槽拭子和淤泥分析的使用方法，与仅使用哨兵鱼检测病原体（如）相比，可提高检出率 Aeromonas hydrophila, 分枝杆菌属 种，以及 Pseudocapillaria tomentosa一种用于监测的系统 P. tomentosa 建议对检疫中的卵进行处理。

环境筛选 Aeromonas hydrophila, 分枝杆菌 种，以及 Pseudocapillaria tomentosa 在斑马鱼系统中

斑马鱼研究机构开发并使用健康监测系统，因为诸如嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等斑马鱼（Danio rerio）病原体……

该采样技术的总体目标是减少用于健康监测的鱼类数量，并优化病原体检测的周转时间、成本和灵敏度，包括在检疫期间对进口鱼类进行筛查时的应用。该技术有助于确定庇护种群的健康状况。在评估或分析治疗效果时，该方法是一种有效的工具。该技术的一个主要优势在于能够对检疫期间的引进生物进行筛选和分类管理，从而加强水生设施的生物安全计划。开始实验前，从循环水系统中准备一个洁净的8升水箱。用集水坑中抽取的大约八升水注满水箱。加入两个陶瓷珠或来自系统的生物滤材海绵块用于筛选。然后，按每升加入一尾斑马鱼（Danio rerio）的比例放入鱼类，使用本实验室内占主导遗传背景的野生型鱼，例如 AB 品系。至少选择六尾鱼。每天喂鱼一次。轮换使用不同的饲料，以确保哨兵鱼暴露于斑马鱼设施中所用的全部饲料类型。进行换水时，将含有生物介质的哨兵鱼转移至临时水箱中。彻底排空哨兵鱼水箱并进行清洗。仅使用集水坑水重新注满哨兵鱼水箱，并将哨兵鱼和生物介质放回。哨兵鱼暴露于集水坑水中四个月后，采用批准的方法处死鱼类，例如将其浸入过量的2-苯氧乙醇溶液中。为确认死亡，需在鳃盖运动停止后等待十分钟。用镊子夹取尸体，并将其完整置于标识好的容器中，在负80摄氏度下冷冻保存。准备一支带有塑料杆的无菌干燥拭子，并戴上手套。确定采样表面。选择水流较缓的集水坑表面，即集水坑壁位于水面处的区域，并移除任何妨碍接近该表面的物体。接着，通过拆除外部包装取出拭子，使无菌棉签头暴露于空气中。用拭子擦拭集水井壁水面位置，范围上下延伸5至10厘米，以吸收水面处的水样及生物膜。随后将拭子套回鞘内，或将拭子头折断放入无菌离心管中。标记样本信息，送检进行PCR检测，或于-80摄氏度冷冻保存。通过显微镜进行污泥分析时，使用60毫升注射器从集水坑底部吸取污泥。将样品分装至15毫升离心管中。拧紧管盖并标记试管。将15毫升离心管置于水平转子离心机中，在175至250 ×g条件下离心10分钟。倾去上清液。倾倒后，保留沉淀物。接下来，使用磁力搅拌器将227克砂糖与177毫升热水混合，配制糖饱和溶液。将糖饱和溶液加入试管至管体一半高度。拧紧管盖，并充分混匀沉淀物与溶液。将试管放入离心机的 swinging bucket（摆动桶）中，并用饱和蔗糖溶液加满至管口。轻轻将一片盖玻片置于每根试管顶部，使其与饱和蔗糖溶液接触。注意：每个60毫升样品需准备四根试管，以防在离心过程中有盖玻片滑落或破碎。离心结束后，取下盖玻片并将其放置在载玻片上，然后用铅笔或记号笔标记载玻片。若发生较多盖玻片破裂的情况，可将蔗糖饱和溶液加至离心管大部分体积，进行离心。随后用蔗糖饱和溶液加至管口顶部，轻轻放置盖玻片，并静置30分钟。使用显微镜寻找毛细线虫（Pseudocapillaria tomentosa）的虫卵。在400倍放大倍数下识别两端的极塞结构。为筛查隔离期间输入动物是否携带毛细线虫虫卵，将雄性和雌性斑马鱼（Danio rerio）放入水族箱中，并放置箱内产卵托盘，但此处用于收集粪便。一周后，移除繁殖装置，并按照前述方法收集装置中积聚的污泥。使用 60 毫升注射器从水箱或集水坑底部吸取污泥，将样品转移至 60 毫升离心管中。用螺旋盖盖紧离心管，并对离心管进行标记。丢弃注射器。振荡60毫升离心管，并将15毫升转移至15毫升离心管中。用螺旋盖盖紧离心管，并标记该离心管。将15毫升离心管置于水平转子离心机中，以175至250 ×g离心10分钟。倒出上清液，保留管内沉淀物。打开拭子外包装，取出拭子，使无菌棉头暴露于空气中。用拭子在管内沉积物中擦拭15秒。将拭子重新套上保护鞘，或将拭子尖端折断至无菌离心管中。标记样本。在负80摄氏度下冷冻并送检进行PCR检测。采用集水井拭子法检测了115条鱼，其中5%检出海分枝杆菌（Mycobacterium chelonae），3%检出嗜血分枝杆菌（Mycobacterium haemophilum），均为唯一鉴定出的致病性分枝杆菌物种。从相同系统中采集的49份集水井拭子样本中，共检出5种分枝杆菌。比值比显示，表面集水坑拭子技术是作为哨兵鱼单一使用来筛查斑马鱼设施中分枝杆菌的有价值替代方法。环境样本还用于筛查嗜水气单胞菌，在鱼类、污泥和表面样本中均检测到该菌，支持所提出技术对鱼类生物栖息环境的筛查能力。通过PCR检测，表面集水坑拭子中检出偶发分枝杆菌（Mycobacterium chelonae）和龟分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）的频率高于鱼类样本。一旦掌握，取样仅需几分钟，而毛细线虫（Pseudocapillaria tomentosa）卵的检测可在一小时内完成。该技术使环境筛查成为常规健康监测项目的关键组成部分。这些方法有助于回答鱼类病理学领域的一些关键问题，例如细菌生物膜与细菌感染之间的关系。

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