斑马鱼系统中水气单胞菌、分枝杆菌和Pseudocapillaria 毛白杨的环境筛选

这种采样技术的总体目标是减少用于健康监测的鱼类数量，并优化病原体检测的周转率、成本和灵敏度，包括在检疫中筛查进口时。这种技术有助于定义避难所的健康法规。在读取或评估治疗效率时，这种方法是一个有用的工具。

该技术的一个主要优点是对检疫中的进口商品进行筛查和分类。它加强了水上设施的生物安全计划。要开始该方案，请从再循环系统中放置一个干净的 8 升水箱。

用来自集水坑的大约 8 升水填充水箱。从系统中加入两个陶瓷珠或生物培养基海绵块进行筛选。接下来，添加一个每升做 Danio rerio，使用设施中显性遗传背景的野生型鱼，例如 A B.选择至少六条鱼。

每天喂鱼一次。改变饮食以确保哨兵接触到斑马鱼设施中使用的所有饮食。要进行换水，请将生物介质中的哨兵转移到临时水箱中。

完全清空哨兵水箱并进行清洁。仅用污水池重新填充哨兵水箱，然后将哨兵和生物培养基放回原处。将哨兵暴露在污水坑水中四个月后，通过批准的方法对鱼实施安乐死，例如浸入过量的 2-苯氧乙醇溶液中。

要确认死亡，请在鳃盖停止运动后等待 10 分钟。用镊子抓住尸体，将其在零下 80 摄氏度下完全冷冻在确定的容器中。准备带有塑料轴和手套的无菌干拭子。

找到要拭子的表面。选择低流量的集水坑表面，即水面的集水坑壁，并移除任何妨碍轻松进入表面的物品。接下来，通过取下外包装来解开棉签，并将无菌棉签尖端暴露在空气中。

将集水坑壁擦拭超过 5 到 10 厘米，以吸收集水坑水面的水和生物膜。然后将拭子收套或将尖端放入无菌离心管中。标记样品并将其送去进行 PCR 检测或在零下 80 摄氏度下冷冻。

要通过显微镜进行污泥分析，请使用 60 毫升注射器吸出集水坑底部的污泥。将样品分成 15 毫升试管。拧上盖子并标记试管。

15 毫升试管在带水平吊篮的离心机中以 175 至 250 倍比重离心 10 分钟。倒出试管。倾析后，保留沉淀物。

接下来，将 227 克砂糖和 177 毫升热水与磁力搅拌器混合，制备糖饱和溶液。将糖饱和溶液填充管子的一半。拧上盖子，将沉淀物与溶液充分混合。

将试管放入离心机水平桶中，用糖饱和溶液填充至顶部。将一个盖玻片轻轻放在每根试管的顶部，使其与糖饱和溶液接触。请注意，每个 60 mL 样品有四根试管，以防在离心过程中一些盖玻片掉落和破裂。

旋转完成后，提起盖玻片并将其放在载玻片上，然后用铅笔或记号笔标记载玻片。如果盖玻片破裂次数过多，请用糖饱和溶液填充试管的大部分，然后离心试管。用饱和糖溶液填充到顶部，然后轻轻放置盖玻片并等待 30 分钟。

用显微镜寻找毛白毛状假毛细管卵。在放大倍率 400 倍处识别双极插头。为了筛选隔离中的进口动物的毛白孢子虫卵，将雄性和雌性 Danio rerio 放在一个水箱中，并添加水箱内的产卵盘，但在这里使用它来收集粪便。

一周后，移除繁殖装置，并如前所述在繁殖装置中收集污泥。用 60 毫升注射器吸出水箱或集水槽底部的污泥，并将样品转移到 60 毫升试管中。用螺口盖住试管并贴上试管标签。

丢弃注射器。摇动 60 mL 试管，将 15 mL 试管转移到 15 mL 试管中。用螺口盖住试管并贴上试管标签。

15 毫升试管在带水平吊篮的离心机中以 175 至 250 倍比重离心 10 分钟。倒出试管并将沉淀物保留在试管中。取下外包装，将棉签出套，将无菌棉签尖端暴露在空气中。

将管中的沉淀物擦拭 15 秒。将拭子收回鞘或将尖端浸入无菌离心管中。标记样本。

零下 80 摄氏度下冷冻并送去进行 PCR 检测。使用对 115 条测试的鱼的污水坑拭子方法，在 5% 的样本中检测到龟分枝杆菌，在 3% 的样本中检测到嗜血分枝杆菌，并且是唯一确定的致病物种。来自同一系统的 49 个污水槽拭子揭示了 5 种分枝杆菌属的存在。

比值比表明，表面集水坑拭子技术是单独使用哨兵筛查斑马鱼设施中分枝杆菌的有价值的替代方案。环境样本还用于筛选在鱼类、污泥和表面样本中检测到的嗜水气单胞菌，这支持了拟议的技术筛选鱼类群落生境的能力。通过 PCR 在表面污水槽拭子中检测到龟分枝杆菌和偶发分枝杆菌的频率高于在鱼类样本中检测到的次数。

一旦掌握了采样，只需几分钟，并且可以在一小时内完成对毛白毛状假毛细管卵的检测。这项技术使环境筛查成为常规健康监测计划的关键部分。这些方法可以帮助回答鱼类病理学领域的关键问题，例如细菌生物膜与细菌感染之间的关系。