基于海拉细胞自由表达系统中的表达疟原虫棒状体蛋白

以下实验的总体目标是使用基于 hela 的无细胞表达系统翻译疟原虫蛋白，并从微量翻译产物中纯化蛋白质。这是通过克隆疟原虫基因来制备重组质粒来实现的，用于疟疾重组 RT 树蛋白的两步和一步体外翻译、无细胞表达。为了翻译重组蛋白，将制备的质粒与转录混合物一起孵育。

当使用转录 mRNA 的两步表达系统时，将得到的 mRNA 添加到翻译混合物中以进行蛋白质翻译。在使用一步表达系统时，将重组质粒与 hela 细胞裂解物一起孵育，用于重组蛋白的转录和翻译。然后从微量翻译产物中纯化重组蛋白。

结果显示基于 western blotting 分析的成功表达和纯化。该技术相对于小麦胚芽表达系统和兔网织红细胞裂解物系统等其他技术的主要优点是该系统可以在三个小时内表达蛋白质。无需编码优化。

它价格实惠且易于使用。可以在微阵列上筛选多种抗原，从而可以检测用于治疗和诊断的抗原。通常，这种方法的新手会很挣扎，因为它是无细胞表达的，它以微量表达蛋白质，使蛋白质纯化变得极其困难。

我们首先有一个使用该系统的想法，因为我们无法使用大肠杆菌来爆炸表达蛋白质，并且发现其他表达系统过于昂贵且耗时。我们决定探索基于 hela 的无细胞表达系统作为替代系统。准备 20 微升含有重组质粒载体 DNA 的转录混合物，如文本方案中所述，用于两步人体外蛋白表达。

使用 DNA 模板。在微量离心管中混合组分，并在 30 摄氏度下在水浴中孵育 75 分钟。然后取 2 微升转录混合物，将其添加到 23 微升含有 hela 细胞裂解物的翻译混合物中。

将所得混合物在 30 摄氏度下孵育 90 分钟。将翻译后的产品储存在零下 20 摄氏度。接下来，制备 25 微升含有重组质粒载体、DNA 和 he 裂解物的转录和翻译混合物，如文本方案中所述，用于 DNA 模板的一步人偶联体外翻译蛋白表达。

将此反应混合物在 30 摄氏度下孵育 90 分钟至 6 小时，并将翻译产物储存在零下 20 摄氏度。为了纯化表达的重组蛋白，将 75 μL 的 1 X 纯化缓冲液添加到 25 μL 的翻译产物中，制成 100 μL 的纯化混合物。加入 300 μL 蒸馏水和 300 μL 结合缓冲液，洗涤镍树脂两次。

重悬填料，并以 14， 000 Gs 离心 1 分钟，以去除过量的乙醇。接下来，将 100 微升制备的纯化溶液加入 100 微升镍螯合树脂中，并将混合物一端孵育。在室温下结束摇床 60 分钟。

混合物以 14， 000 G 离心 1 分钟，然后将 supernat 收集到标记为流通的新试管中。用 100 μL 的 1 x 洗涤缓冲液洗涤树脂，然后在 14， 000 GS 下离心 1 分钟，并将 super named 收集在标有 wash 的新管中。洗涤后重复此步骤两次。

向填料中加入 100 μL 1 x 洗脱缓冲液，并在末端摇床上孵育 15 分钟。然后以 14， 000 Gs 离心 1 分钟。每次执行 Ellucian 步骤两次。

将上清液收集到新鲜的微量离心管中，并在 ellucian 后标记为洗脱液。像以前一样将树脂清洗两次，然后在 4 摄氏度下储存。将流式洗涤液和洗脱样品储存在零下 20 摄氏度或更低温度下，以进行蛋白质印迹。

首先，从假疟原虫 e 大肠杆菌中制备单独的 schon 提取物管，表达重组 R 三种蛋白质，制备的重组蛋白和使用亲和法纯化的蛋白质产物。接下来，向每管中加入含有巯基乙醇的电泳样品缓冲液，最终体积为 20 μL。要制备溶解的蛋白质样品，请将试管煮沸 2 分钟。

运行凝胶后，将溶解的蛋白质样品加载到 10% SDS 页面凝胶上以分离蛋白质。在用 2% 脱脂牛奶转移和封闭硝酸纤维素试纸后，在半干燥的蛋白质免疫印迹室中以每块凝胶 35 毫安的电流电泳，将分离的蛋白质从 SDS 页面凝胶转移到硝酸纤维素纸上 2 小时。将硝酸纤维素试纸与阴性对照文本方案中列出的多克隆抗体一起孵育。

还将硝酸纤维素纸在 1 至 100 稀释的正常小鼠和兔血清中孵育，并从 SB 两个骨髓瘤细胞中超级命名的废培养物中。将硝酸纤维素试纸在 4 °C 下孵育过夜，用印迹缓冲液洗涤四次，并与与辣根过氧化物酶偶联的物种特异性二抗一起孵育，在 2% 牛奶中稀释 1 至 1000。然后用印迹缓冲液再次洗涤硝酸纤维素纸四次。

最后，将洗涤的硝酸纤维素纸与显色溶液 A 加 B 在黑暗中孵育 30 分钟，使用 RT 树特异性兔抗病毒证实使用体外人无细胞表达系统成功表达疟原虫蛋白，如图所示，先前表达的重组蛋白未被抗血清识别，抗寄生虫病 vae 蛋白来自 p FALs parem 和 P Yoi Lee， 证明兔抗血清 6 76 对表达蛋白的特异性。正常兔血清不与重组蛋白反应。使用两步体外人无细胞表达系统和一步偶联体外翻译系统进行翻译。

此处显示了从 25 μL 翻译蛋白产物中成功纯化翻译蛋白的过程。具体而言，显示了 mara 裂跨膜蛋白的成功纯化。还显示了从疟原虫 RT 树蛋白编码基因中成功纯化假设蛋白质的结果。

最后，成功纯化了含有疟原虫 RT 树蛋白的犰狳重复序列。纯化后的蛋白质产量为显影后每 25 微升 3.5 微克。这项技术为寄生虫学领域的研究人员为寄生虫中的蛋白质表征、蛋白质-蛋白质相互作用、抗体抑制研究和寄生虫学领域的疫苗开发铺平了道路。

看完这个视频，您应该了解如何使用 healer 基于无细胞的细胞表达系统在三个小时内表达疟原虫蛋白。您还将了解如何从微量翻译产物中纯化蛋白质。