Name: 基于海拉细胞自由表达系统中的表达疟原虫棒状体蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学习利用海拉细胞无细胞表达系统表达疟原虫棒状体蛋白的方法，通过一步法和两步法体外翻译技术实现高效蛋白合成，并结合镍树脂亲和层析法从微量翻译产物中纯化目标蛋白，为疟疾疫苗开发和蛋白质功能研究提供可靠技术平台。

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本研究得到了克利夫兰州立大学教师发展基金的支持。

1. 寄生虫细胞培养物的制备及寄生虫沉淀的收集
<ol>
	<li>将10 g RPMI-1640粉末、66 mg硫酸庆大霉素、2 g碳酸氢钠、5.9 g HEPES缓冲液、50 mg次黄嘌呤和3.8 g葡萄糖加入1 L无菌去离子水中，配制RPMI-1640-HEPES培养基2O. 使用磁力搅拌器搅拌，直至粉末完全溶解于1 L蒸馏水中。使用0.22 µm滤膜对培养基进行微孔过滤。将培养基储存于无菌瓶中。</li>
	<li>用RPMI洗涤未感染（新鲜）的A+型红细胞。制备5%红细胞压积的红细胞悬液（将0.5 ml洗涤后的新鲜红细胞加入9.5 ml含10%人血清的RPMI培养基中）。</li>
	<li>配制15%人血清RPMI培养基（15 ml人血清与85 ml RPMI），用于启动寄生虫培养。配制10%人血清RPMI培养基（10 ml人血清与90 ml RPMI），用于继续在红细胞中培养寄生虫。</li>
	<li>培养 P. falciparum （3D7 和 FCR-3 菌株）在培养皿或 75 cm² 培养瓶中，以 5% 血细胞比容和 20% 寄生率感染 A+ 型人红细胞3 培养瓶。维持培养 体外 根据Trager和Jensen烛缸法26. 或者，将培养物置于37 °C、含9.5% CO₂的培养箱中维持培养2 和 3.4% N2 气体。培养 P. falciparum 在添加了10%人血清的RPMI 1640-HEPES培养基中。</li>
	<li>同步 P. falciparum 通过向培养浓缩物中加入65% Percoll（65 ml Percoll + 35 ml不含人血清的RPMI-1640）进行培养27.</li>
	<li>以2500 × g离心含Percoll的培养浓缩液5分钟，形成3层。在无菌条件下，使用移液管小心地从中间层分离裂殖体，并转移至另一离心管中27.</li>
	<li>用含10%人血清的RPMI-1640培养基洗涤分离的细胞培养物两次，每次以7500 × g离心5分钟以去除过量的Percoll。每次操作后均在无菌条件下弃去上清液。27.</li>
	<li>继续培养同步化的 P. falciparum 10% 人血清 + RPMI-1640 中的裂殖体27.</li>
	<li>通过处理收集裂殖体 疟原虫用10 mM Tris（pH 8.8）重悬感染的红细胞，并在15,000 × g离心15分钟23将蛋白酶抑制剂（抑肽酶）5 µl加入寄生虫沉淀后，于-70 °C保存。使用寄生虫沉淀进行蛋白质提取、基因组DNA提取和RNA提取。</li>
</ol>
2. 准备质粒载体
<ol>
	<li>从寄生率约为 20% 的培养物中制备的 P. falciparum 裂殖体沉淀中提取基因组 DNA。</li>
	<li>向微量离心管中的沉淀加入 600 µl pH 7.6 的 10 mM Tris-HCl、pH 8.0 的 50 mM EDTA、0.1% SDS 和 1 mg/ml 蛋白酶 K，使用连接 26 G 针头的 1 ml 注射器混匀沉淀。将沉淀混合液反复吸入和推出注射器 20 次。将含有匀浆的离心管置于 50 °C 水浴中过夜孵育。</li>
	<li>通过向匀浆后的沉淀中加入 600 µl 酚-氯仿混合液（P+C）（300 µl 酚和 300 µl 氯仿）进行酚-氯仿（P+C）抽提。盖紧管盖，通过反复倒置剧烈振荡混合。在 14,000 × g 条件下离心 2 分钟，用移液器收集上层水相至新的微量离心管中。重复此步骤两次。</li>
	<li>向步骤 2.1.2 所得新管中的水相层加入 600 µl 氯仿。涡旋振荡 10 秒，在 14,000 × g 条件下离心 2 分钟。用移液器测量上层水相体积，并转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>向步骤 2.1.3 所得水相层中加入 0.1 体积的 5 M pH 5.5 醋酸钠和 1 体积的异丙醇（若水相体积为 300 µl，则加入 30 µl 5 M pH 5.5 醋酸钠 + 330 µl 异丙醇）。室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 14,000 × g 条件下离心 10 分钟以沉淀 DNA 沉淀。弃去上清液，用 100 µl 70% 乙醇（70 µl 乙醇 + 30 µl dH2O）洗涤沉淀，以去除 DNA 中过量的盐。将 DNA 溶于 50 µl dH2O 中，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>使用软件或手动设计正向和反向引物，用于扩增蛋白组学研究中先前已鉴定的 P. falciparum 基因 PF3D7_1361800、PF3D7_0925900、PF3D7_1436300 和 PF3D7_011410016,18，引物应包含适当的限制性酶切位点，以便将基因序列克隆至表达质粒 pT7CFE1-CHis 的多克隆位点，如 表 2 所示。</li>
	<li>配制 50 µl 反应体系：加入 5 µl 提取的 P. falciparum 基因组 DNA、5 µl 10× 缓冲液、5 µl MgCl2、1.5 µl 正向引物、1.5 µl 反向引物、0.5 µl T7 DNA 聚合酶和 31.5 µl dH2O，并进行聚合酶链式反应（PCR），条件为：94 °C 变性 8 分钟，50 °C 延伸 1 分 30 秒，72 °C 退火与复性 9 分钟，用于扩增 表 1 所示的基因。</li>
	<li>在 1% 琼脂糖凝胶（1 g 琼脂糖 + 100 ml Tris 醋酸 EDTA（TAE）缓冲液）上分离 PCR 产物32。</li>
	<li>从琼脂糖凝胶中切下 PCR 扩增的 DNA 条带，将含 DNA 的凝胶片放入 DNA 凝胶提取离心柱中，于 -20 °C 冷冻 5 分钟。向冷冻的凝胶片中加入 100 µl 异丙醇，在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用移液器测量步骤 2.5 所得收集管中滤过的水相体积，并转移至新管。加入 0.1 体积的 5 M 醋酸钠，在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，向 DNA 沉淀中加入 10 µl dH2O。</li>
	<li>在两个独立的离心管中分别消化 pT7CFE1-CHis 表达载体和纯化的 DNA 片段（来自步骤 2.6）：每管加入 3 µl 质粒和 5 µl PCR 基因产物。每管再加入 1 µl 特异性限制性内切酶、2 µl 反应缓冲液和 14 µl dH2O。</li>
	<li>在微量离心管中加入 3 µl 消化的质粒、5 µl 消化的 DNA 片段、2 µl 10× 连接酶缓冲液、1 µl 连接酶和 9 µl dH2O。于 12 °C 过夜孵育。</li>
	<li>向步骤 2.14 的离心管中加入 0.1 体积 pH 5.5 的 3 M 醋酸钠和 2 体积乙醇（若连接反应体系体积为 20 µl，则加入 2 µl 3 M 醋酸钠 + 44 µl 乙醇）。充分混匀，于 -20 °C 孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 14,000 × g 条件下离心 15 分钟。用移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>向步骤 2.10 所得沉淀中加入 100 µl 70% 乙醇。在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟。移除并弃去上清液。向 DNA 沉淀中加入 10 µl 无核酸酶水。</li>
</ol>
3. 蛋白质表达使用 体外 人类无细胞表达系统
<ol>
	<li>通过量取2 µl重组pT7CFE1-CHis质粒DNA、4 µl 5x转录缓冲液、4 µl NTP混合物、2 µl T7 RNA聚合酶和8 µl无核酸酶水，配制20 µl转录反应混合物，用于两步法人类蛋白表达系统 体外 使用DNA模板进行蛋白表达。在微量离心管中混合组分，于30 °C水浴中孵育75分钟。</li>
	<li>取 2 µl 转录混合物，加入含有 12.5 µl HeLa 细胞裂解液、2.5 µl 辅助蛋白、1 µl 盐溶液 A、0.5 µl 缺甲硫氨酸的氨基酸混合物、0.5 µl 缺亮氨酸的氨基酸混合物、1 µl RNase 抑制剂、1.25 µl 能量混合物以及 3.75 µl 无核酸酶水的 23 µl 翻译混合物中。</li>
	<li>将第3.2步的翻译反应混合物在30 °C孵育90分钟。将翻译产物储存于-20 °C。</li>
	<li>通过添加3 µl重组pT7CFE1-CHis质粒DNA、2 µl无核酸酶水、5 µl反应混合液、12.5 µl HeLa裂解物和2.5 µl辅助蛋白，配制25 µl转录与翻译混合液，用于DNA模板的一步法人源偶联体外转录翻译蛋白表达。</li>
	<li>将第3.4步的反应混合物在30 °C下孵育90分钟至6小时。将翻译产物在-20 °C下保存。 °C</li>
</ol>
4. 表达重组蛋白的纯化
<ol>
	<li>向25 µl翻译产物中加入75 µl 1x纯化缓冲液，配制成100 µl的纯化混合液。</li>
	<li>向100 µl纯化混合液中加入100 µl镍螯合树脂。用300 µl dH2O和300 µl结合缓冲液洗涤Ni-树脂两次。重悬树脂后，在14,000 × g离心1分钟，以去除多余的乙醇。</li>
	<li>将步骤4.2中得到的100 µl纯化混合液加入100 µl镍螯合树脂中，在室温下孵育60分钟。</li>
	<li>将混合液在14,000 × g离心1分钟，收集上清液至新标记为“穿流”的离心管中。</li>
	<li>用100 µl 1x洗涤缓冲液（20 mM咪唑，250 mM NaH2PO4，pH 8，2.5 M NaCl和dH2O）洗涤树脂。在14,000 × g离心1分钟，将上清液收集至新标记为“洗涤”的离心管中。重复步骤4.5两次。</li>
	<li>向树脂中加入100 µl 1x洗脱缓冲液（100 mM咪唑，250 mM Na2PO4，pH 8.0，2.5 M NaCl和dH2O），孵育15分钟。在14,000 × g离心1分钟。重复洗脱步骤两次，每次将上清液分别收集至新的微量离心管中，并标记为“洗脱液”。</li>
	<li>洗脱完成后，按步骤4.5所述方法洗涤树脂两次。将穿流液、洗涤液和洗脱液样品储存于-20 °C或更低温度。树脂必须在4 °C保存。每种样品取30 µl用于SDS-PAGE和免疫印迹分析。</li>
</ol>
5. 考马斯亮蓝（Bradford）蛋白质定量分析 34
<ol>
	<li>配制浓度为 20 µg/ml 的标准牛血清白蛋白（BSA）溶液（将 10 µl BSA（2 mg/ml）与 90 µl dH₂O 混合）2O)，40 µg/ml（将20 µl BSA（2 mg/ml）与80 µl dH₂O混合）2O），60 µg/ml（将 30 µl BSA（2 mg/ml）与 70 µl dH₂O 混合）2O)，80 µg/ml（将 40 µl BSA（2 mg/ml）与 60 µl dH2O)，100 µg/ml（将 50 µl BSA（2 mg/ml）与 50 µl dH2O)，160 µg/ml（将80 µl BSA（2 mg/ml）与20 µl dH混合）2O）和 200 µg/ml（100 µl BSA（2 mg/ml））。</li>
	<li>从步骤4.7中分别量取5 µl的流穿液、洗涤液和洗脱液样品，加入95 µl的dH₂O。2O.</li>
	<li>向步骤5.1和5.2中的混合物加入5 ml考马斯亮蓝试剂。用封口膜覆盖管口，涡旋振荡10秒，然后在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>使用分光光度计，在650 nm波长下测定第5.3步中蛋白管的光密度（OD）。绘制浓度 与 通过OD读数测定蛋白质浓度34.</li>
</ol>
6. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>加入5 µl 裂殖子提取物 P. falciparum，2 µl 的 大肠杆菌 表达的重组Rhop-3蛋白31，5 µl 通过两步法和一步法表达的重组蛋白 体外 人源表达系统及采用亲和法纯化的10 µl蛋白产物，分装至不同离心管中。</li>
	<li>向每管中加入含巯基乙醇的电泳上样缓冲液，至终体积为 20 µl，以制备可溶性蛋白样品。将各管煮沸 2 分钟。</li>
	<li>将溶解的蛋白质样品上样至10% SDS-PAGE凝胶中以分离蛋白质。</li>
	<li>将SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质通过电转移法转移到硝酸纤维素膜（NCP）上，在半干式Western印迹装置中每块凝胶以35 mA电流电泳2小时。</li>
	<li>用2%脱脂牛奶封闭转印后的NCPs。</li>
	<li>将封闭后的NCPs与以下多克隆抗体在2%脱脂奶粉中按1:100稀释后孵育，用于进行蛋白质印迹检测；兔抗体#67621 特异于 P. falciparum 裂殖子棒状体，小鼠抗体20 特异于 P. yoelii 和 P. berghei 裂殖子棒状体，抗血清#685 特异性针对 P. falciparum 寄生泡蛋白，SERA（富含丝氨酸抗原）22 以及针对 Maurer 小体蛋白 PfMC-2TM 的特异性抗体28.</li>
	<li>将NCPs同时与1:100稀释的正常小鼠和兔血清，以及SP2骨髓瘤细胞的培养上清（SCS）一同孵育，作为阴性对照。</li>
	<li>在 4 ºC 条件下将 NCPs 与抗体及对照物共同孵育过夜。</li>
	<li>用印迹缓冲液洗涤NCPs 4次，然后将NCPs与辣根过氧化物酶（HRP）标记的种属特异性二抗在2%脱脂奶粉中按1:1000稀释后孵育。</li>
	<li>用印迹缓冲液洗涤NCPs 4次。将洗涤后的NCPs与显色液A+B（溶液A：加入50 ml 1×印迹缓冲液和30 µl H2O2；溶液B：加入10 ml甲醇和30 mg 3-氯萘酚，避光孵育30分钟。通过比色法分析Western印迹结果。</li>
</ol>

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</ol>

本研究不存在任何相互竞争的财务利益。

使用两步体外人源无细胞表达系统成功表达蛋白质并进行纯化的关键步骤包括：1）将基因成功扩增并克隆至pT7CFE-CHis质粒载体中；2）在30oC下进行RNA转录；3）在存在RNase抑制剂的条件下于30 °C进行蛋白质翻译；4）利用镍包被的树脂珠开发基于亲和力的纯化方案；5）使用多克隆和单克隆抗体通过蛋白质印迹（western blot）分析结果。使用一步IVT偶联蛋白质翻译系统成功表达蛋白质的关键步骤包括：1）将基因成功扩增并克隆至pT7CFE-CHis质粒载体中；2）在30 °C下同时进行转录与翻译；3）利用镍包被的树脂珠开发基于亲和力的纯化方案；4）使用多克隆和单克隆抗体通过蛋白质印迹（western blot）分析结果。
目前，无细胞表达系统被用于表达重组疟原虫蛋白。利用无细胞表达系统表达疟原虫蛋白的关键特征包括：能够解码富含A-T的基因、无长时间的翻译暂停、成功表达重复氨基酸序列、缺乏糖基化机制，以及质粒能够控制基因截短的能力。在本研究中，我们展示了使用两步法体外人源无细胞表达系统32以及一步法IVT偶联翻译系...

在疟疾研究中，利用原核或真核细胞表达系统表达免疫原性蛋白仍然是一项挑战。疟原虫基因组的A-T丰富性 疟原虫 基因组和未知的翻译后调控机制14,7，给获取正确折叠且具有免疫原性的蛋白质以用于抗体生产和疫苗研究带来了困难。原核表达系统，如大肠杆菌 大肠杆菌 已用于重组蛋白表达。原核表达系统成本低、效率高，能产生大量重组蛋白 并具有多个克隆载体。宿主 E. coli 细胞易于转化且生长迅速。然而，原核表达系统存在诸多局限性，例如缺乏氨基酸修饰、无法进行翻译后修饰、存在污染风险、产物不均一，以及重组蛋白易在包涵体中积累。24.
在Mehlin的一项研究中 等 （2006年），表达了1000个开放阅读框（ORF）。其中约7%的表达蛋白具有可溶性14. 观察到的不溶性是由于基因的偏性以及密码子使用频率过高，这些密码子恰好是目标宿主中理想使用的密码子 疟原虫 A-T 丰富基因组14一种克服该问题的替代策略是使用含有能识别稀有密码子或匹配密码子频率的tRNA的质粒或宿主细胞3即使在完成这些优化之后，仍只有极小部分蛋白质能够以可溶性、有活性且具有免疫原性的形式表达14无细胞表达系统包含转录和翻译所需的所有组分，如核糖体、起始因子、延伸因子（翻译因子）、tRNA 和氨酰-tRNA 合成酶。转录和翻译反应在一步法中偶联进行。11,29转录反应在一支试管中进行，然后将适量的mRNA在另一支试管中与翻译系统共同孵育。11,29尽管这些方法在 疟原虫属 蛋白表达，一个主要缺点是蛋白表达所需时间较长，约为22小时29此外，将耗材纳入方案所需的高昂成本29，细胞裂解物制备过程劳动强度大，且组分制备存在不一致性，导致这些系统难以实现。研究人员在开发无细胞表达系统时主要关注的因素包括快速的遗传修饰、高效浓度的快速产物获得，以及简便的裂解物制备流程1.
已用于重组蛋白表达的真核系统包括酵母、哺乳动物细胞系、杆状病毒介导的表达系统、Tetrahymena thermophila、Dictyostelium discoideum，以及利什曼原虫（Leishmania）等寄生虫表达系统7。真核系统具有亲缘关系，因此也共享一些特性，例如糖基化、酰基化、二硫键形成、分子伴侣相互作用、蛋白水解以及亚细胞区室化。真核生物中的蛋白质分泌过程可防止蛋白积累，降低表达系统的毒性13。其中，酵母系统更受青睐，因其适用于大规模蛋白表达并可获得较高产量4。已有研究利用酵母系统成功表达两种恶性疟原虫蛋白PfCP-29和Pvs254。然而，大多数蛋白在合成过程中存在主要缺陷，包括N-和O-糖基化模式异常、蛋白折叠错误以及与天然形式相比出现截短现象4。
使用哺乳动物细胞合成重组蛋白费时费力，且维持稳定的重组细胞系成本高昂4因此，哺乳动物细胞在蛋白质信号传导、蛋白质相互作用以及寄生虫-宿主相互作用的研究中受到限制，同时也限制了其在DNA疫苗测试中的应用4人类DNA与mRNA 体外 基于HeLa细胞的无细胞蛋白表达系统是一种哺乳动物来源的表达系统，可在3小时内表达蛋白质。使用pT7CFE1-cHis表达载体表达的蛋白质具有C端标签，便于鉴定与纯化。该HeLa来源的系统添加了翻译起始因子和翻译调控因子，从而提高了翻译系统的效率。蛋白质可被快速翻译、筛选、验证，并可用于多种免疫学和结构学研究应用。15.
目前，诸如小麦胚芽和兔网织红细胞等真核细胞无细胞表达系统已被用于表达多种真核蛋白，包括Plasmodium蛋白11,29。此外，基于E. coli的无细胞系统也用于真核蛋白的表达11。表1通过比较不同无细胞表达系统的特性及其在蛋白表达中的使用便捷性，对各类系统进行了总结。与其他系统相比，人源无细胞系统能够进行翻译后及共翻译修饰，且成本较低。该系统支持密码子优化，所有反应可在3小时内完成。HeLa系统是实验室环境中蛋白质合成的理想翻译系统。
相较于其他无细胞表达系统，人源无细胞表达系统的一个主要优势在于可获得来源于不同器官和组织的多种不同细胞系。根据所用细胞系的不同，可设计出多种类型的无细胞系统。来源于哺乳动物细胞的提取物在合成大分子蛋白质方面的效率高于其他任何无细胞表达系统。这些无细胞表达系统还可应用于诊断及蛋白质表征，例如微阵列30。其中，HeLa细胞系被最广泛地用于蛋白质表达33。HeLa细胞系中的内质网发育不完全，导致缺乏翻译后糖基化修饰活性33。然而，该系统被认为在Plasmodium蛋白质合成中具有优势，因为Plasmodium本身也缺乏翻译后糖基化修饰能力29。HeLa无细胞转录-翻译方案操作简便、成本低廉，可在90分钟内完成蛋白质表达，产物可直接用于纯化及后续下游应用。

<table><tbody><tr><td>2步 &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; 人源无细胞表达系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>88856</td><td>已停产。始终保存于 -80 &amp;deg;C。禁止在温水中解冻</td></tr><tr><td>1步 &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; 偶联翻译系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>88860</td><td>始终保存于 -80 &amp;deg;C。禁止在温水中解冻</td></tr><tr><td>ProBond 纯化系统</td><td>Invitrogen</td><td>K850-01</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Probond 镍螯合树脂</td><td>Invitrogen</td><td>R801-01</td><td>4&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 保存</td></tr><tr><td>A+ 型人血</td><td>Interstate Blood Bank</td><td></td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr></tbody></table>

基于 hela 细胞的无细胞表达系统用于表达plasmodium 肾形体蛋白

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

疟疾在全球范围内导致严重的发病率和死亡率。目前尚无常规疫苗可用。缺乏有效疫苗的主要原因之一在于难以鉴定合适的疫苗候选抗原。利用原核和真核细胞表达系统表达的疟原虫蛋白通常糖基化程度低、溶解性差，并发生错误折叠，从而导致免疫原性降低。小麦胚芽、兔网织红细胞裂解液和 大肠杆菌 裂解细胞无细胞表达系统目前已被用于疟疾蛋白的表达。然而，蛋白表达时间较长以及糖基化修饰不当等问题仍然存在。我们展示了表达 疟原虫 蛋白质 体外 使用基于HeLa细胞的无细胞表达系统，称为“体外 人源无细胞表达系统。两种基于HeLa细胞的无细胞表达系统可在75分钟内完成mRNA转录，3 µl转录出的mRNA足以在90分钟内完成蛋白质翻译。一步法表达系统为转录与翻译偶联的表达系统，可在3小时内同步完成转录与共翻译过程；通过补充额外能量，该过程可延长至6小时。在两步法表达系统中，首先进行mRNA转录，随后将转录产物加入翻译反应体系以实现蛋白表达。本文描述了利用基于HeLa细胞的无细胞表达系统表达疟原虫蛋白的方法，包括疏水性蛋白PF3D7_0114100 Maurer's Cleft-2跨膜蛋白（PfMC-2TM）、亲水性蛋白PF3D7_0925900以及含犰狳重复结构域的蛋白PF3D7_1361800。这些蛋白采用两步法和一步法表达策略在微体积条件下进行表达。同时介绍了一种亲和纯化方法，用于纯化利用25 µl表达体系产生的蛋白。 体外 还描述了人源无细胞表达系统。蛋白质产量通过Bradford法测定，表达并纯化的蛋白质可通过Western印迹分析进行验证。表达的重组蛋白质可用于免疫接种、免疫检测以及蛋白质测序。

通过与特异性抗体的反应性来验证表达的重组蛋白，是确认所表达蛋白正确折叠的重要第一步。采用一步法和两步法体外人源无细胞表达系统表达重组疟原虫蛋白。重组蛋白通过镍螯合亲和方法进行纯化。随后，我们使用针对完整裂殖子棒状体的抗血清，对经SDS-PAGE分离的重组蛋白进行蛋白质印迹（Western blotting）分析。
图1显示了PY17X_1139200、PY17X_1402200、PY17X_1366000、PY17X_0830000和PF3D7_1436300基因片段在1%琼脂糖凝胶中的PCR扩增结果。将目标DNA条带切下，并通过在DNA提取离心柱中冷冻的方式进行DNA纯化。
疟疾基因成功扩增（如图所示） 表 2) 从基因组DNA克隆至pT7CFE-CHis表达载体中。通过对重组质粒中的基因进行再次扩增，证实了目的基因片段已成功插入载体。所采用的蛋白翻译表达系统的流程图如下所示 图2. 图2A和图2B</str...

在基于细胞的系统中表达疟疾蛋白仍然具有挑战性。我们展示了两种无细胞表达系统——两步法和一步法体外翻译（in vitro translation, IVT），用于从HeLa细胞中表达疟疾重组棒状体蛋白。我们采用镍树脂亲和纯化系统对棒状体蛋白进行纯化。

基于 HeLa 细胞的无细胞表达系统用于表达Plasmodium 肾形体蛋白

疟疾在全球范围内导致严重的发病率和死亡率。目前尚无常规疫苗可用。缺乏疫苗的主要原因之一是……

以下实验的总体目标是利用基于HeLa细胞的无细胞表达系统翻译疟原虫蛋白，并从微量翻译产物中纯化这些蛋白。该目标通过克隆疟原虫基因，构建用于两步法和一步法体外翻译的重组质粒，实现疟疾重组RT树蛋白的无细胞表达来达成。为翻译重组蛋白，将制备好的质粒与转录混合物共同孵育。使用两步表达系统时，首先转录生成mRNA，然后将所得mRNA加入翻译反应体系中进行蛋白质翻译。而在使用一步表达系统时，将重组质粒与HeLa细胞裂解液共同孵育，以实现重组蛋白的转录与翻译。随后从微量翻译产物中纯化重组蛋白。结果表明，基于蛋白质印迹分析，目标蛋白得到了成功表达和纯化。与小麦胚芽表达系统和兔网织红细胞裂解物系统等其他方法相比，该技术的主要优势在于可在三小时内实现蛋白表达，且无需进行编码优化。它价格低廉且易于使用。通过微阵列可同时筛选多种抗原，从而实现治疗和诊断相关的抗原检测。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法采用无细胞表达系统，在微小体积中表达蛋白质，使得蛋白质纯化极为困难。我们最初想到使用该系统，是因为无法利用大肠杆菌（E. coli）表达蛋白质，且发现其他表达系统过于昂贵且耗时。因此，我们决定探索基于HeLa细胞的无细胞表达系统作为替代方案。按照文本中所述的两步法人源体外蛋白质表达方案，配制含有重组质粒载体DNA的20微升转录反应混合物。使用DNA模板。在微量离心管中混合各组分，于30摄氏度水浴中孵育75分钟。然后取2微升转录混合物，加入含有HeLa细胞裂解物的23微升翻译混合物中。将所得混合物在 30 摄氏度下孵育 90 分钟。将翻译产物储存于 -20 摄氏度。接下来，按照文本方案中所述，为 DNA 模板制备 25 微升转录和翻译混合物，其中包含重组质粒载体、DNA 和兔网织红细胞裂解物，用于一步法人源偶联体外翻译蛋白质表达。将该反应混合物在30摄氏度下孵育90分钟至6小时，并将翻译产物储存于零下20摄氏度。为纯化表达的重组蛋白，向25微升翻译产物中加入75微升1×纯化缓冲液，配制成100微升的纯化混合液。通过加入300微升蒸馏水和300微升结合缓冲液，洗涤镍树脂两次。重悬树脂，并在14,000 G下离心1分钟以去除过量乙醇。接下来，将100微升制备好的纯化溶液加入100微升镍螯合树脂中，在室温下于旋转摇床中孵育60分钟。将混合物在14,000 G下离心1分钟，收集上清液至标记为“流穿”的新离心管中。用100微升1×洗涤缓冲液洗涤树脂，然后在14,000 G下离心1分钟，将上清液收集至标记为“洗涤”的新离心管中。洗涤步骤完成后，重复此操作两次。加入100 µL的1倍洗脱缓冲液至树脂中，在翻转摇床上孵育15分钟。然后在14,000 ×g下离心1分钟。每步Ellucian步骤重复两次。将上清液收集到新的微量离心管中，并标记为洗脱液。按前述方法洗涤树脂两次，然后于4°C保存。将穿流液、洗涤液和洗脱液样品保存在-20°C或更低温度下，用于后续进行蛋白质印迹分析。首先，分别制备来自恶性疟原虫（P. falsy parum）大肠杆菌（e. coli）表达的重组R三蛋白、已制备的重组蛋白以及通过亲和方法纯化的蛋白产物的裂解提取液。接着，向每个试管中加入含有巯基乙醇的电泳上样缓冲液，使最终体积为20 µL。为获得可溶性蛋白样品，将试管煮沸2分钟。将溶解的蛋白质样品加入10% SDS-PAGE凝胶中，电泳后分离蛋白质。在半干式蛋白质印迹装置中，每块凝胶以35毫安电流进行电泳转膜2小时，将SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜。转膜完成后，用2%脱脂牛奶封闭硝酸纤维素膜。随后，根据文本方案中列出的多克隆抗体，将硝酸纤维素膜与用于阴性对照的抗体共同孵育。同时将硝酸纤维素膜分别置于1:100稀释的正常小鼠血清、正常兔血清以及SB2骨髓瘤细胞的培养上清中孵育。将硝酸纤维素膜在4°C过夜孵育后，用印迹缓冲液洗涤四次，再与辣根过氧化物酶标记的种属特异性二抗在2%脱脂牛奶中按1:1000稀释后进行孵育。随后再次用印迹缓冲液将硝酸纤维素膜洗涤四次。最后，将洗涤后的硝酸纤维素膜在避光条件下与显色液A和B共同孵育30分钟。通过RT-树特异性兔抗血清检测，证实了利用体外人源无细胞表达系统成功表达了疟原虫蛋白；如前所示，已表达的重组蛋白未被针对p FALs parem和P Yoi Lee的寄生虫vaa蛋白的抗血清所识别，表明兔抗血清6 76对所表达蛋白具有特异性。正常兔血清不与重组蛋白发生反应。蛋白表达分别采用两步法体外人源无细胞表达系统和一步法偶联体外翻译系统完成。此处展示了从25微升翻译蛋白产物中成功纯化翻译蛋白的结果。具体而言，展示了马氏裂隙跨膜蛋白的成功纯化。同时也展示了从疟原虫RT树蛋白编码基因中获得的假设蛋白的成功纯化。最后，展示了成功纯化含有犰狳重复序列的疟原虫RT树蛋白的结果。蛋白纯化后的产量为每25微升3.5微克。该技术为寄生虫学领域的研究人员开展寄生虫蛋白表征、蛋白-蛋白相互作用、抗体抑制研究以及疫苗开发奠定了基础。观看本视频后，您应了解如何利用Healer无细胞表达系统在三小时内表达疟原虫蛋白，同时掌握从微量翻译产物中纯化这些蛋白的方法。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于海拉细胞自由表达系统中的表达<em&gt;疟原虫</em&gt;棒状体蛋白

本文描述了一种用于脑型疟疾寄生虫滞留的体外模型1。恶性疟原虫感染的红细胞被筛选以结合永生化的人脑微血管内皮细胞。筛选获得的寄生虫表现出独特的表型。该筛选方法可应用于多种P.

Plasmodium falciparum 寄生虫与人脑微血管内皮细胞黏附的筛选方法

在后人类基因组时代，天然构象重组蛋白的可获得性对于结构、功能及治疗相关的研究与开发至关重要。本文介绍了一种在人胚胎肾293T细胞中进行小规模及大规模蛋白表达的系统，可用于生产多种重组蛋白。...

一种用于从人类细胞生产分泌蛋白的便捷通用表达平台

利用哺乳动物系统表达重组蛋白正成为生产用于结构生物学研究的蛋白复合物的一种颇具吸引力的方法。本文介绍了一种简单且高效的表达系统，该系统利用悬浮培养的哺乳动物细胞来纯化用于结构研究的蛋白复合物。...

用于结构生物学研究的重组蛋白表达：在HEK 293F悬浮细胞中的一种新颖且易于实现的方法

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

本文介绍了一种使用HEK293T细胞的低成本颗粒酶表达系统，该系统可产生高产量、高纯度、完全糖基化且具有酶活性的蛋白酶。...

一种高效且低成本的人类颗粒酶在哺乳动物细胞中的表达系统

利用适当的翻译后修饰在实验室规模生产真核蛋白仍面临重大障碍。本文提供了一种基于哺乳动物表达系统的蛋白质表达方案，具有建立迅速、周期短的优点。该系统支持氨基酸选择性标记、蛋白质选择性标记以及糖链组成的小分子调节剂。...

悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

非裂解型昆虫细胞表达系统在蛋白质生产、细胞内运输/定位以及重组蛋白功能分析方面尚未得到充分利用。本文介绍了在商业可得的鳞翅目细胞系中构建表达载体并进行瞬时蛋白表达的方法。同时展示了烟粉虱（Bemisia...

培养昆虫细胞中重组蛋白的瞬时表达与细胞定位

本文介绍了利用昆虫细胞与杆状病毒蛋白表达系统大量生产植物分泌蛋白以用于蛋白结晶的实验方案。已使用GP67或昆虫血淋巴素（hemolin）信号肽对杆状病毒表达载体进行改造，以实现植物蛋白在昆虫细胞中的分泌表达。...

改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

利什曼原虫翻译提取物（LTE）是一种源自单细胞寄生虫Leishmania...

LTE的制备与优化 Leishmania tarentolae 衍生的无细胞蛋白表达系统用于重组蛋白生产

化学遗传学涉及在靶位点处将看门残基替换为含有不同侧链的氨基酸。在此，我们构建了一种含有cdpk1功能低下等位基因的突变寄生虫，并鉴定了该突变背景下寄生虫所采用的补偿性通路。...

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

学习利用海拉细胞无细胞表达系统表达疟原虫棒状体蛋白的方法，通过一步法和两步法体外翻译技术实现高效蛋白合成，并结合镍树脂亲和层析法从微量翻译产物中纯化目标蛋白，为疟疾疫苗开发和蛋白质功能研究提供可靠技术平台。

基于 HeLa 细胞的无细胞表达系统用于表达Plasmodium 肾形体蛋白

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