基于 HeLa 细胞的无细胞表达系统用于表达Plasmodium 肾形体蛋白

以下实验的总体目标是利用基于HeLa细胞的无细胞表达系统翻译疟原虫蛋白，并从小体积的翻译产物中纯化这些蛋白。该目标通过克隆疟原虫基因，构建用于两步法和一步法体外翻译的重组质粒，实现疟疾重组RT树蛋白的无细胞表达来达成。为翻译重组蛋白，将制备好的质粒与转录混合物共同孵育。

使用两步表达系统时，该系统首先转录 mRNA，然后将生成的 mRNA 加入翻译反应体系中进行蛋白质翻译。而在使用一步表达系统时，将重组质粒与 Hela 细胞裂解液共同孵育，以实现重组蛋白的转录与翻译。随后从微量体积的翻译产物中纯化重组蛋白。

结果表明，基于蛋白质印迹分析，实现了目的蛋白的成功表达与纯化。与小麦胚芽表达系统和兔网织红细胞裂解物系统等其他方法相比，该技术的主要优势在于可在三小时内完成蛋白表达，且无需进行编码优化。

它价格低廉且易于使用。通过微阵列可同时筛选多种抗原，从而实现治疗和诊断相关的抗原检测。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法属于无细胞表达系统，其在微小体积中表达蛋白质，使得蛋白质纯化极为困难。

我们最初想到使用该系统，是因为无法利用大肠杆菌（E. coli）表达蛋白质，且发现其他表达系统成本过高且耗时较长。因此，我们决定探索基于HeLa细胞的无细胞表达系统作为替代方案。按照文本中所述的两步法人源体外蛋白质表达方案，配制含有重组质粒载体DNA的20微升转录反应混合物。

使用DNA模板。在微量离心管中混合各组分，于30摄氏度水浴中孵育75分钟。然后取2微升转录混合物，加入含有HeLa细胞裂解物的23微升翻译混合物中。

将所得混合物在30摄氏度下孵育90分钟。将翻译产物储存于-20摄氏度。接下来，按照一步法人源偶联体外翻译蛋白表达DNA模板的文本方案所述，准备25微升含有重组质粒载体、DNA和细胞裂解液的转录与翻译混合物。

将该反应混合物在30摄氏度下孵育90分钟至6小时，并将翻译产物储存于-20摄氏度。为纯化表达的重组蛋白，向25微升翻译产物中加入75微升1×纯化缓冲液，配制成100微升的纯化混合液。通过加入300微升蒸馏水和300微升结合缓冲液，洗涤镍树脂两次。

重悬树脂，并在14,000 G下离心1分钟，以去除过量乙醇。接着，将100微升已配制的纯化溶液加入100微升镍螯合树脂中，混合后于室温下在旋转摇床中孵育60分钟。

将混合物在14,000 G下离心1分钟，收集上清液至标记为“穿流”的新离心管中。用100微升1×洗涤缓冲液洗涤树脂，然后在14,000 G下离心1分钟，将上清液收集至标记为“洗涤”的新离心管中。洗涤步骤完成后重复此操作两次。

加入100 µL的1×洗脱缓冲液至树脂中，在翻转振荡器上孵育15分钟。然后在14,000 ×g下离心1分钟。每步Ellucian步骤重复两次。

将上清液收集到新的微量离心管中，并标记为洗脱液。按前述方法洗涤树脂两次，然后将其保存于4°C。将穿流液、洗涤液和洗脱液样品保存于-20°C或更低温度下，用于后续进行蛋白质印迹分析。

首先，分别制备来自恶性疟原虫和大肠杆菌的 schon 提取物、表达的重组 R 三个蛋白质、制备的重组蛋白质以及通过亲和方法纯化的蛋白质产物。接着，向每个试管中加入含有巯基乙醇的电泳上样缓冲液，使最终体积为 20 µL。为获得可溶性蛋白质样品，将试管煮沸两分钟。

将溶解的蛋白质样品加入10% SDS-PAGE凝胶中，电泳后分离蛋白质。在半干式蛋白质印迹装置中，每块凝胶以35毫安电流进行电泳转膜2小时，将SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜。转膜完成后，用2%脱脂牛奶封闭硝酸纤维素膜。随后，根据文本方案中列出的多克隆抗体，将硝酸纤维素膜与用于阴性对照的抗体共同孵育。

同时将硝酸纤维素膜分别置于1:100稀释的正常小鼠血清、正常兔血清以及SB2骨髓瘤细胞的培养上清中孵育。将硝酸纤维素膜在4°C下孵育过夜后，用印迹缓冲液洗涤四次，再与辣根过氧化物酶标记的种属特异性二抗在2%脱脂牛奶中按1:1000稀释后进行孵育。随后再次用印迹缓冲液将硝酸纤维素膜洗涤四次。

最后，将洗涤后的硝酸纤维素膜在避光条件下与显色液A和B共同孵育30分钟。通过RT-树特异性兔抗血清检测，证实了利用体外人源无细胞表达系统成功表达了疟原虫蛋白；如前所示，所表达的重组蛋白未被针对p FALs parem和P Yoi Lee的寄生虫病相关蛋白的抗血清识别，表明兔抗血清6 76对所表达蛋白具有特异性。正常兔血清不与重组蛋白发生反应。实验采用两步法体外人源无细胞表达系统及一步法偶联体外翻译系统进行翻译。

此处展示了从 25 微升翻译蛋白产物中成功纯化翻译蛋白的结果。具体而言，展示了马氏裂隙跨膜蛋白的成功纯化。同时也展示了从疟原虫 RT 树蛋白编码基因中获得的假设蛋白的成功纯化。

最后，展示了成功纯化含有犰狳重复序列的疟原虫RT树蛋白的结果。蛋白纯化后的产量为每25微升3.5微克。该技术为寄生虫学领域的研究人员开展寄生虫蛋白表征、蛋白-蛋白相互作用、抗体抑制研究以及疫苗开发奠定了基础。

观看本视频后，您应了解如何利用HeLa细胞无细胞表达系统在三小时内表达疟原虫蛋白，同时掌握如何从小体积翻译产物中纯化这些蛋白的方法。