一种简单的分级提取方法，用于从单个样品中综合分析代谢物，脂质和蛋白质

该方法的总体目标是使用简单的分馏甲基-三丁基醚萃取法，从单个样品中回收和分析所有主要分子实体，包括极性和半极性代谢物、脂质和蛋白质。通常，科学家发现很难从单个样品中分析多种化合物类别。使用我们在此处介绍的 MTBE 萃取，您可以从单个样品中提取和分析多种化合物类别，如脂质、代谢物和蛋白质。

该技术的主要优点是它可以从少量的单个样品等分试样中稳健地提取所有分子化合物类别。该方法有助于回答系统生物学中的基本问题，因为它为多组学分析提供了实验基础，提供了可用于蛋白质组学、脂质组学和代谢组学分析的馏分。使用拟南芥叶组织演示了以下方案。

拟南芥是十字花科的小型开花植物，与卷心菜有关。首先，将组织匀浆管架在液氮中预冷至少 10 分钟。从液氮中取出样品并将其放入试管架中。

然后从液氮中取出管架。快速将管架放入组织匀浆器中，设置匀浆器，将生物材料研磨成细小均匀的粉末。对于叶子，使用 20 赫兹一分钟。

均质化时间和速度可能因组织而异。确保均质化，直到得到的样品是非常细的粉末。并且样品应在均质化的每一步保持冷冻。

对样品进行均质化，然后从试管架中取出生物样品。如果它们不会立即使用，请将它们放入零下 80 摄氏度的冰箱中，直到进一步提取。在四个 2 ml 圆底安全锁微量离心管上贴上样品编号。

将试管和一些刮刀浸入液氮中，对其进行预冷。试管和刮刀冷却后，将其中一根试管放在分析天平上，用刮刀将 25 毫克组织粉末分装到微量离心管中。记录每个样品的准确重量，然后立即将等分试样放入液氮中。

快速执行此步骤以避免解冻植物材料。将等分试样储存在零下 80 摄氏度，直至进一步提取。为了准备提取，在零下 20 摄氏度的冰箱中预冷甲基叔丁基醚或 MTBE 甲醇萃取混合物，如随附文件所述制备。

取出等分试样，向每个样品管中加入 1 毫升预冷的提取混合物。快速执行此步骤。MTBE 粘度低，可从移液器吸头滴出。

立即在涡旋混合器上混合每个样品，直到组织在提取混合物中充分匀浆。将试管放在工作台上的架子上，直到提取完所有样品。此步骤至关重要。

在这里，我们沉淀蛋白质并灭活它们的酶活性。将所有样品在轨道摇床上以 100 RPM 的速度在 4 摄氏度下孵育 45 分钟。然后在冰冷的超声处理槽中对样品进行超声处理 15 分钟。

接下来，通过相分离进行分级分离，向每个样品管中加入 650 μL 水和甲醇的三比一溶液。然后涡旋混合 1 分钟。将样品在 4 摄氏度下以 20， 000 x g 的速度离心 5 分钟。

完成此步骤后，请小心处理试管，以避免两种液相混合并避免破坏沉淀的沉淀。在这个阶段，有两个允许的液相，管底部有一个固体颗粒。非极性上层相包含脂质。

下层水相包含极性和半极性代谢物。该颗粒包含蛋白质、淀粉和细胞壁。将 500 μL 溶剂从含上层脂质相转移到标记的 1.5 ml 微量离心管中。

然后，使用 200 微升移液器小心去除剩余的脂质相并丢弃。接下来，将 400 μL 溶剂从下相转移到标记的 1.5 mL微量离心管中。将额外的 200 μL 等分试样转移到微量离心管中，以进行进一步分析，例如基于气相色谱的代谢物分析。

吸出多余的体积，去除并丢弃剩余的水相。然后，要洗涤获得的蛋白质-淀粉-细胞壁沉淀，加入 500 μL 甲醇，然后涡旋 1 分钟。在 4 摄氏度下以 10， 000 次 g 的速度离心样品 5 分钟。

使用氮气流蒸发器从脂质样品中蒸发溶剂，以避免脂质的氧化修饰。应立即分析所得的干燥样品。在真空浓缩器中蒸发水性样品中的溶剂过夜，无需加热。

干燥的水样可以在零下 80 摄氏度下储存数周，然后再进行分析。将干燥的脂质馏分重悬于 400 微升 7 比 3 乙腈与 2-丙醇的溶液中。将足够的液体转移到玻璃样品瓶中并盖紧盖子。

然后，将玻璃样品瓶放入 4 摄氏度的冷却自动进样器中。每个样品进样 2 μL，并使用流速为 400 μL/min 的 UPLC 系统，在 60 °C 的反相 C8 色谱柱上分离脂质。使用随附文件表 1 中描述的流动相进行色谱分离。

使用合适的 MS 仪器在正负电离模式下采集质谱，质量范围为 150 至 1500 电荷质量比。将极性相重悬于 200 μL 一对一 UPLC 级甲醇与水的溶液中。将足够的液体转移到玻璃样品瓶中并盖紧盖子。

然后，将玻璃瓶放入冷却的自动进样器中，温度为 4 摄氏度。从每个样品中进样 2 μL，并使用 UPLC 系统以 400 μL/min 的流速运行，在 40°C 的 RP C-18 色谱柱上分离代谢物。使用流动相进行色谱分离，其参数如随附文件表 2 所示。

使用合适的质谱仪在正负电离模式下采集全扫描质谱，质量范围在 50 到 1500 质荷比之间。最后，执行蛋白质提取、消化和分析，如随附文档所述。收获 25 毫克拟南芥叶组织，研磨和提取，然后将其置于三个分析型 UPLC-MS 平台中。

通过反相 C-18 UPLC-MS 从极性分析极性和半极性初级和次级代谢物。脂质的基峰色谱图（上图所示）和半极性代谢物（下图所示）在正电离模式下进行分析。每张色谱图右上角的饼图显示了分配给不同化学类别的已鉴定脂质和代谢物的数量。

例如，将 58 种不同的脂质分配给甘油三酯组，在上图中表示为 TAG。该馏分中更多的亲水性代谢物，如糖和极性氨基酸，在反相材料上没有显示出良好的保留性，可以通过其他分析方法进行分析，如 GCMS 或亲水相互作用液相色谱法。从提取中回收的蛋白质在溶液中消化，并使用鸟枪法 LCMS 进行分析。

右上角显示的饼图表示分配给不同生物过程的已识别蛋白质的数量。例如，268 种蛋白质被分配到定位类别。总之，可以从本例中使用的样品中常规鉴定 200 多种脂质种类、50 种注释的半极性代谢物和数千种蛋白质。

此外，该方法在使用不同的组织、器官和细胞培养材料时显示出广泛的适用性。观看此视频后，您应该对如何从单个样品中提取和分析大多数必需的化合物有很好的了解。在尝试此程序时，请务必保持所有样品的冷冻状态，正确研磨材料，并使用分析级溶剂和化学品。

按照此程序，可以采用所有分析方法来确定提取样品的分子组成。