Name: 一种简单的分级提取方法，用于从单个样品中综合分析代谢物，脂质和蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学习使用甲基叔丁基醚分级提取法从单一生物样品中同时分离脂质、代谢物和蛋白质。该方法以拟南芥叶片为模型，支持多组学分析，为系统生物学研究提供可靠的实验基础。

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M.S. 获得了 GERLS-DAAD 项目提供的全额博士奖学金。我们衷心感谢 Andrew Wiszniewski 博士对本文稿的校对与修改建议。我们非常感谢德国戈尔姆马克斯·普朗克分子植物生理研究所 Giavalisco 实验室所有成员提供的帮助。

注意: 甲醇（MeOH）和甲基 叔叔丁基醚（MTBE）在提取过程中易燃，长期暴露和/或接触可能引起呼吸道、眼睛或皮肤刺激。请仅在通风橱中谨慎操作，并在提取过程中采取适当的安全措施（实验服、护目镜、手套）。 等等。）。液氮和干冰在本实验方案的多个步骤中使用，长时间接触皮肤可导致严重冻伤。操作时请佩戴防护手套和护目镜，并谨慎处理。用户可使用不同的化学物质、试剂或内标物进行样品分析，其中部分物质可能具有毒性。请查阅所用材料的相关化学品安全技术说明书。
1. 生物样本的采集与收获
<ol>
	<li>准备带有标签的收集管。 
	注意：此处将生物样品收集到已标记的、2 mL、圆底、带安全锁的微量离心管中，管内含有两个直径为5 mm的金属球，用于组织匀浆器处理。</li>
	<li>准备好装满液氮的杜瓦瓶。</li>
	<li>采集生物样品，并在液氮中迅速冷冻组织。此步骤应在数秒内尽快完成，以避免因机械损伤引发的代谢变化。 
	注意：为演示目的，可使用在长日照条件下、土壤中生长的30天龄野生型Arabidopsis thaliana（Col-0）的莲座叶。</li>
	<li>采集后的样品可暂时保存在干冰上，或长期储存于-80 °C环境中。</li>
</ol>
2. 研磨与组织破碎
<ol>
	<li>将组织匀浆机的管架置于液氮中预冷至少10分钟。若无组织匀浆机，可使用洁净且预冷的研钵和研杵。</li>
	<li>从液氮、干冰或-80 °C冰箱中取出样品，并将其放入预冷的管架中。</li>
	<li>迅速将管架放入组织匀浆机中。</li>
	<li>将生物材料研磨成细而均一的粉末。叶片建议使用20 Hz频率研磨1分钟。 
	注意：匀浆时间和速度可根据不同组织类型进行调整，需确保样品被充分研磨成细粉，并且在整个匀浆过程中始终保持冷冻状态。</li>
	<li>从管架中取出生物样品，并保持其冷冻状态，直至进行后续提取步骤。</li>
</ol>
3. 组织称重
<ol>
	<li>使用具有足够精度的分析天平称量所需样品量。</li>
	<li>准备一个已标记的 2 mL 圆底安全锁扣微型离心管。</li>
	<li>将离心管和刮勺预冷至液氮中。</li>
	<li>将所需量的组织粉末分装至 2 mL 安全锁扣微型离心管中。 
	注意：称量过程应尽量迅速，避免植物材料解冻。</li>
	<li>称量后立即将分装好的样品放回液氮中。</li>
	<li>记录每个样品的精确重量。大多数植物组织建议使用 10–50 mg ± 10% 的样品量。</li>
	<li>将分装好的样品储存于 -80 °C，直至后续提取使用。</li>
</ol>
4. 试剂配制
<ol>
	<li>使用甲基提取混合液 叔丁基甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇（MeOH）
	<ol>
		<li>配制100 mL提取溶剂时，将75 mL MTBE加入25 mL MeOH中，制成MTBE:MeOH（3:1，体积比）的混合溶液。</li>
		<li>根据分析需求，加入内标物以用于分析后归一化。通常，加入 50 µL 的 1,2-二十七烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（1 mg/mL，溶于氯仿）作为基于UPLC-MS的脂质分析内标物，同时加入50 µL的 13C山梨醇（1 mg/mL水溶液）作为基于GC-MS的初级代谢物分析的内标。基于UPLC-MS的代谢物分析所用内标为50 µL皮质酮（1 mg/mL甲醇溶液）和25 µL氨苄青霉素（1 mg/mL甲醇溶液）。</li>
		<li>将溶剂转移至已用MTBE:MeOH混合液冲洗过的洁净玻璃瓶中。</li>
		<li>将提取混合物在 4 °C 下保存最多 1 周。 
		注意：为了保持结果的可重复性，不要长期储存提取混合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为诱导相分离，使用水（H₂O）2O)/甲醇（MeOH）。
	<ol>
		<li>配制100 mL H2O：甲醇，加入75 mL水2加入甲醇至 25 mL 以制备 H2O：甲醇（3:1，体积/体积）。</li>
		<li>将溶剂转移至已用 H 冲洗过的洁净玻璃瓶中2O:MeOH 混合溶剂。该溶剂可在室温下保存数周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 样品提取
<ol>
	<li>使用液体制冷系统或 -20 °C 冰箱将提取液（MTBE:MeOH，3:1，体积比）预冷至 -20 °C。</li>
	<li>逐个取出分装的样品，并向每个样品管中加入 1 mL 预冷的提取液。注意：由于 MTBE 黏度较低，此步骤应迅速操作。</li>
	<li>立即在涡旋振荡器上充分混匀，直至组织在提取液中完全均质化。 
	注意：此步骤非常关键，因其可使蛋白质沉淀并使其酶活性失活。</li>
	<li>将所有样品置于4°C条件下，在转速为100 rpm的轨道摇床上孵育45分钟。</li>
	<li>将样品置于冰浴冷却的超声仪中，超声处理15分钟。</li>
</ol>
6. 相分离法组分分离
<ol>
	<li>向每个样品管中加入 650 µL 的 H2O:MeOH（3:1，体积比）溶液。</li>
	<li>涡旋振荡 1 分钟，充分混匀。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 的离心速度离心 5 分钟。 
	注意：此步骤后，管中将出现两个互不相溶的液相，并在管底形成固体沉淀。 
	警告：操作时需小心处理样品管，避免两相液体混合，并防止扰动已沉淀的颗粒。</li>
</ol>
7. 极性与疏水性组分的分装
<ol>
	<li>将上层含脂质相中的500 µL溶剂转移至已标记的1.5 mL微量离心管中。 
	注意：分装的脂质样品可直接浓缩后用于立即进行的UPLC-MS分析（步骤8.1），或在-80 °C下保存数周。</li>
	<li>从样品中移除500 µL后，使用200 µL移液器去除剩余的脂质相。</li>
	<li>将下层相（极性和中等极性代谢物）中的400 µL溶剂转移至已标记的1.5 mL微量离心管中。分装的极性样品可直接浓缩后用于立即进行的UPLC-MS分析（步骤8.2），或在-80 °C下保存数周。</li>
	<li>额外取200 µL分装样品以进行其他分析，例如如先前所述的基于气相色谱的代谢物分析16。</li>
	<li>通过移液去除多余的体积，以除去剩余的水相。</li>
	<li>用500 µL甲醇对获得的蛋白质、淀粉和细胞壁沉淀物进行洗涤，并充分涡旋震荡1分钟。</li>
	<li>在4°C下以10,000 × g 的速度离心样品5分钟。</li>
	<li>进行蛋白质提取与消化（步骤11），或如先前所述进行淀粉/细胞壁分析16。 
	注意：若不立即使用，这些沉淀物可在-80 °C下保存数周。</li>
</ol>
8. 组分的浓缩与储存
<ol>
	<li>将脂质样品（来自步骤 7.1）中的溶剂在无加热的真空浓缩仪中蒸发（1–2 小时），或优选使用氮气吹干仪，以避免脂质发生氧化修饰。 
	注意：干燥的样品应立即进行分析。如需储存，应将样品保留在甲基叔丁基醚（MTBE）溶液中，最好置于玻璃小瓶中（步骤7.1）。</li>
	<li>在真空浓缩仪中将水相样品（来自步骤7.3或7.4）避热过夜蒸发溶剂。注意：干燥后的样品可在-80 °C保存数周后再进行分析。</li>
</ol>
9. 使用超高效液相色谱-质谱法分析脂质24
<ol>
	<li>将步骤 8.1 中获得的干燥脂质组分重新悬浮于 400 µL 乙腈:2-丙醇（7:3，体积比）中。</li>
	<li>转移足够量的液体至玻璃小瓶中，并盖紧瓶盖。</li>
	<li>将玻璃小瓶置于冷却的自动进样器（4 °C）中。</li>
	<li>每样品进样 2 µL，使用超高效液相色谱系统在流速为 400 µL/min 的条件下，于 60 °C 的反相 C8 柱上分离脂质。</li>
	<li>采用 表 1 中所述的流动相进行色谱分离。</li>
	<li>使用合适的质谱仪，在正离子和负离子化模式下采集质谱数据，质荷比（m/z）范围覆盖 150 至 1,500。</li>
</ol>
10. 使用超高效液相色谱-质谱法分析极性和中等极性代谢物25。
<ol>
	<li>将极性相（来自步骤 8.2）重新悬浮于 200 µL 超高效液相色谱级甲醇：水（1:1，体积/体积）中。</li>
	<li>转移足够量的液体至玻璃小瓶中，并 tightly 密封。</li>
	<li>将玻璃小瓶置于冷却的自动进样器（4 °C）中。</li>
	<li>从每个样品中进样 2 µL，使用超高效液相色谱系统在流速为 400 µL/min 的条件下，于 40 °C 下在反相 C18 柱上分离代谢物。</li>
	<li>使用 表 2 中给出的参数，采用相应的流动相对代谢物进行色谱分离。</li>
	<li>使用合适的质谱仪，在正离子和负离子化模式下采集质量范围为 50 至 1,500 m/z 的全扫描质谱数据。</li>
</ol>
11. 蛋白质提取、消化与分析16
<ol>
	<li>将洗涤后的蛋白质/淀粉/细胞壁沉淀物（来自步骤 7.8）重新悬浮于 200 µL 所选的蛋白质提取缓冲液中。注意：我们使用尿素/硫脲缓冲液（5 M 尿素，2 mM 硫脲，15 mM DTT，2% CHAPS 以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂）27。</li>
	<li>将样品置于冰浴冷却的超声波清洗仪中，超声处理 10 分钟。</li>
	<li>在室温下，将样品置于摇床（100 rpm）中孵育 30 分钟。</li>
	<li>将溶解的蛋白质在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>将蛋白质上清液收集至新离心管中。</li>
	<li>测定所收集上清液中的蛋白质浓度28。</li>
	<li>选择合适的方案，在溶液中消化 50 µg 蛋白质。通常按照说明书使用胰蛋白酶/Lys-C 混合酶进行消化。</li>
	<li>消化完成后，在进行质谱分析前，使用 C18 固相萃取小柱对肽段进行脱盐，并洗脱消化后的肽段29。</li>
	<li>在真空浓缩仪中将样品浓缩至接近干燥，过程中不加热。</li>
	<li>将样品重新悬浮于适当的上样缓冲液（例如 5% 乙腈，0.5% 甲酸）中，并使用连接纳米液相色谱系统的高分辨质谱仪对肽段混合物进行 LC-MS/MS 分析。 
	注意：在本实验方案提供的示例蛋白质组学数据集中，我们采用了如表 3所述的梯度程序。</li>
	<li>设置质谱仪参数，采用 top 15 扫描策略，即一次全扫描（FS）后最多进行 15 次数据依赖性 MS/MS 扫描。全扫描在 m/z 200–2,000 质量范围内进行，分辨率为 70,000，目标离子数为 3×106。通过高能碰撞解离（HCD）获取数据依赖性 MS/MS 扫描，MS/MS 的目标离子数设为 1×105，最大离子填充时间为 50 ms，隔离窗口为 4.0 m/z，归一化碰撞能量（NCE）为 30%，欠填充比为 1%。MS/MS 离子的检测分辨率设为 17,500，动态排斥时间设为 60 秒。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

本文描述并图示了一种简单且高度适用的提取方案，可从单个50 mg的叶片样品中进行全面的脂质组学、代谢组学和蛋白质组学分析。该方法已在多项研究中应用，并发表于多篇文献17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,31,32,33,34,35,36,37，除流程简便、适用性高外，还被证实具有良好的稳健性和可重复性。
本文提供的应用展示了对复杂生物样本进行初步筛选的一些常规方法。这些图示的大规模代谢组学和脂质组学数据集可提供有关被分析生物系统代谢中广泛或特异性变化的全面信息，而蛋白质分析所得数据则有助于深入了解调控细胞功能和细胞机制的酶、结构蛋白或转录因子（TFs）在定量（丰度）和定性（修饰）方面的变化。因此，整合组学数据有望通过阐明与特定代谢通路或细胞过程相关的多种分子的分子水平变化，揭示由遗传、生物或/和非生物扰动所引起的生物系统潜在变化的初步信息。
当然，从长远来看，为了成功进行系统生物学分析，最大限度地增加已分析和注释的分子实体数量至关重要，这使得对细胞功能和活动的监测尽可能全面。为此，可将获得的组分进一步应用于多种分析方法，以检测更多的化合物或其他化合物类别（图4）。
需要指出的是，对所获得数据的全局分析策略可分为两种不同方法：一方面，我们一直强调通过已知化合物的定量来阐明细胞功能；另一方面，许多检测到的代谢物和脂质尚未被识别或注释。这些尚未注释的化合物检测结果也包含大量有意义的信息，可通过统计学方法用于不同组别或处理之间的分类或区分20,21,22。
然而，这些未知化合物——特别是与分类群划分或作为生物标志物相关的化合物——仍需被鉴定。遗憾的是，这一鉴定过程相当繁琐，若无额外的分析测定或策略则无法完成38。从图4可以看出，未注释的化合物数量相当高（实际上是绝大多数）。尽管如此，如上所述，这些色谱峰可在数据分析过程中进行处理，从而阐明受显著影响的物质，并进一步开展鉴定研究。
总之，我们可以得出结论：本文介绍的方案在实验系统生物学以及经典统计学应用中均具有多项优势。
首先，由于所有组分均提取自同一样本，不同实验数据集（脂质、代谢物、蛋白质）之间的变异显著降低，因为每个数据集均来源于同一样本等分试样。这显然提高了所得结果的可比性。
其次，该方法易于扩展，因此非常适合从小量到大量样本的处理。我们常规使用10-100 mg的组织样本，但已有研究成功利用低至20粒拟南芥种子进行脂质组学分析31。尤其由于该方法适用于小量样本，因此在生物组织或样本量有限的情况下仍可应用。即使样本材料充足，本文所述方法仍具有优势，即可将样本用于更多数量的实验重复，而非用于不同的提取流程。这有助于实现更完善和精细的统计数据分析。
第三，由于该方法基于极性与非极性分子的液-液分配，与简单的单相提取方法（例如甲醇提取）相比，它在流程中提供了一个显著的去复杂化步骤。这种高效的样品去复杂化过程通过将相互产生化学干扰的分子彼此分离，实现了各组分的初步纯化。因此，化学分配过程不仅为将提取样品系统性地分取至不同化学类别提供了实际优势，还改善了各个分析测定结果，因为它去除了各组分中的干扰化合物。显然，我们可以观察到，脂质主要分配至有机相，通常会对极性化合物的色谱分析产生负面影响，而在极性组分中这些脂质几乎完全不存在。对于疏水性脂质的分析同样如此，其极性化合物含量也显著降低。除了实现极性与非极性化合物之间的相互纯化外，我们还从样品中去除并收集了蛋白质及其他大分子物质，这不仅提供了一个独立的组分，可用于蛋白质、淀粉和细胞壁分析16，同时也使各个组分的样品更加洁净。这一点尤为重要，因为已知大分子物质的存在会导致分析柱受损，或至少缩短其使用寿命。
最后但同样重要的是，本研究组的多项研究已证实，所描述的MTBE萃取方法依赖于一种危害较小且更理想的氯仿替代溶剂15，该方法已证明可广泛适用于多种生物样品，包括植物16、藻类17,18、果蝇19，以及多种哺乳动物的组织、器官或细胞20,21,22。

系统生物学兴起于上个世纪中叶1，并随着基因组学和转录组学数据集的大规模分析而得到发展2,3，现已演变为分析复杂生物系统的全新且不可或缺的方法4,5。系统生物学的主要目标是解析生物系统中各组分之间的相互作用与依赖关系，并建立基因型、其表达过程、分子转化与最终表型之间的联系。因此，整合由基因组学、转录组学、代谢组学、脂质组学和蛋白质组学等各种大规模分析技术所产生的全面数据集，并对其进行计算分析，已成为描述和理解复杂生物系统的必要前提。
基于任何生命系统中生物组分的巨大化学多样性和复杂性，生成大规模且全面的组学数据集在很大程度上依赖于所采用提取方法的质量9。除了提取方法的质量外，方法的经济性也十分重要；这意味着理想情况下应尽可能从最少的样品输入量中获得最多的分子信息。样品量常常受限，因此非常希望采用一种提取方法，能够从同一样品的单次提取中获取尽可能多的分子类别。这意味着不再对同一样品的不同等分试样分别使用多种专用提取方法来分离不同类型的化合物，而是采用一种连续提取方法，将单个等分试样中的分子组分分级分离为不同的分子组分馏分。
这些分步提取方法所采用的常用技术基于Folch的两相脂质提取法 等 1957年开发10该方法基于氯仿：甲醇/水体系对极性与疏水性代谢物进行分配，旨在对样品进行净化和去复杂化处理，以实现高质量的脂质分析。随着多组学系统生物学的发展，Folch 方法被逐步改进，进一步用于蛋白质、极性代谢物和脂质的样品分配，适用于基于气相色谱和液相色谱的极性与疏水性化合物代谢组学和脂质组学分析，以及基于液相色谱的蛋白质组学分析。11,12,13,14不幸的是，所有这些方法都依赖于基于氯仿的提取法，这不仅会导致蛋白质沉淀在极性相与脂质相之间的界面处形成不期望的中间相，而且从绿色化学的角度来看，氯仿也是一种不理想的溶剂。15,16。然而，溶剂甲基 叔叔丁基醚（MTBE）可克服上述两个问题，是氯仿的合适替代物。基于这些要求，我们决定建立一种以MTBE:甲醇:水为基础的提取方法，该方法满足上述所有条件，因而可作为全面多组学分析的理想起点16.
本方案逐步指导用户完成样品制备的简单、快速且可重复的操作流程，包括常见问题的故障排除。此外，我们将简要介绍基于超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）的脂质组学、代谢组学和蛋白质组学在植物组织样品分析中的典型数据示例。尽管所给示例来源于50 mg的Arabidopsis thaliana叶片组织样品，但该方案已成功应用于多种其他生物样品和组织，包括藻类17,18、昆虫19以及哺乳动物细胞、器官和组织20,21,22。本提取方案的目的是对提取前的样品处理及提取过程本身提供清晰而详细的说明。尽管我们提供了三个分析应用的简要示例，有关分析前和分析后数据处理的详细信息可参考我们此前发表的文献16,23,24,25,26。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂与标准品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td>代谢物内标</td></tr><tr><td>Corticosterone&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27840-500MG</td><td>代谢物内标，HPLC级</td></tr><tr><td>13C Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605514</td><td>代谢物内标，ISOTEC&amp;reg;&amp;nbsp;稳定同位素</td></tr><tr><td>1,2-二十七烷酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱 (17:0 PC)&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850360P</td><td>脂质内标</td></tr><tr><td>甲醇 (MeOH)&amp;nbsp;</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13684102</td><td>ULC-MS级</td></tr><tr><td>水</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>23214102</td><td>ULC-MS级</td></tr><tr><td>甲基叔丁基醚 (MTBE)&amp;nbsp;</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13890602</td><td>HPLC级</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/Lys-C混合酶&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5072</td><td>蛋白质酶解</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>天平&amp;nbsp;</td><td>Sartorius Corporation&amp;nbsp;</td><td>14 557 572</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨混合仪&amp;nbsp;</td><td>Retsch, Mixer Mill MM 300</td><td>20.746.0001</td><td></td></tr><tr><td>研钵与研杵&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z247464-1EA</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器&amp;nbsp;</td><td>Vortex-Genie 2, Model G560</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators</td><td>7.008.500.002</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 安全锁微型离心管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td>用于样品提取</td></tr><tr><td>1.5 mL 安全锁微型离心管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>用于分馏</td></tr><tr><td>摇床</td><td>Eppendorf Thermomixer 5436</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪&amp;nbsp;</td><td>USC 300&amp;nbsp;TH</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>制冷型微型离心机</td><td>Eppendorf, model 5427R</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>UPLC系统&amp;nbsp;</td><td>Waters Acquity UPLC系统 (Waters, Machester, UK)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;质谱系统&amp;nbsp;</td><td>Exactive, Orbitrap型质谱仪 (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反相（RP）桥联乙基杂化（BEH）C8色谱柱（100 mm &amp;times; 2.1 mm，填料粒径1.7 &amp;mu;m）</td><td>Waters, Machester, UK</td><td>186002878</td><td>脂质分析</td></tr><tr><td>反相高强硅胶（HSS）T3色谱柱（100 mm &amp;times; 2.1 mm，填料粒径1.8 &amp;mu;m）&amp;nbsp;</td><td>Waters, Machester, UK</td><td>186003539</td><td>代谢物分析</td></tr><tr><td>Q ExactivePlus高分辨质谱仪连接EASY-nLC 1000系统&amp;nbsp;</td><td>Thermo-Fisher, Bremen, Germany</td><td></td><td>肽段分析</td></tr></tbody></table>

一种用于从单个样品中全面分析代谢物、脂质和蛋白质的简单分级提取方法

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

理解复杂的生物系统需要对活细胞中的多种化合物类别进行测量、分析和整合，这些通常通过转录组学、蛋白质组学、代谢组学和脂质组学测定来完成。在本方案中，我们介绍一种简单的方法，可利用每个样品的单份等分试样，实现从生物组织中可重复地提取代谢物、脂质和蛋白质。该提取方法基于甲基 叔丁基叔丁基醚：甲醇：水体系用于疏水性和极性代谢物的液-液分配，使其进入两个不相混溶的相中，同时使蛋白质及其他大分子沉淀形成固体沉淀物。因此，该方法可获得三种具有特定分子组成的组分，且完全适用于常见的高通量组学技术，如与质谱联用的液相色谱（LC）或气相色谱（GC）。尽管该方法最初是为分析不同植物组织样品而开发，但已证明其同样适用于从藻类、昆虫以及哺乳动物组织和细胞培养等多种生物体系中提取和分析生物样品。

全面的多组学数据集对于理解复杂的生物系统具有重要价值。成功的生物学实验策略通常始于有意义的实验设计、实验的建立与实施，随后进行样品采集、提取、分析数据获取、原始数据处理、统计分析、相关代谢物的鉴定以及生物学数据的解释，包括通路映射与可视化（图1）。
本文介绍的提取方案重点关注样品采集、处理和提取步骤，详细工作流程见图2。为演示目的，选取了50 mg的拟南芥叶片组织。该材料经采集、研磨和提取后，分别用于三种典型的UPLC-MS分析平台，所得数据可用于靶向和非靶向的脂质组学、代谢组学和蛋白质组学分析。图2和图6还展示了在标准条件下提取溶剂应呈现的代表性图像。此外，还展示了含有过量沉淀大分子（蛋白质和淀粉）的样品以及样品均质化不充分的示例（图3）。针对这两个常见问题的解决方案在图3中简要说明，并在我们先前的出版物中进行了更详细的讨论16。
图4 和 图5 展示了来自脂质、极性/半极性代谢物和蛋白质分析的三种典型分析色谱图示例。脂质样品取自上层甲基叔丁基醚（MTBE）相（图2），采用反相（RP）C8 超高效液相色谱联用高分辨质谱进行分析。脂质可在正离子和负离子模式下通过质谱电离检测（图4，上图）16,24。
极性和中等极性的初级与次级代谢物通过反相C18超高效液相色谱-质谱法（RP UPLC-MS25）对极性相（水/甲醇相）进行分析（图2）。该方法采用反相色谱技术，特别适用于分析中等极性代谢物（即植物次生代谢产生的代谢物），此类物质可通过质谱的正离子和负离子化模式进行检测（图4，下图）16。该组分中更具亲水性的代谢物（如糖类、极性氨基酸等）在反相填料上保留效果较差，可采用其他分析方法进行检测，例如气相色谱-质谱法（GC-MS）16或亲水相互作用液相色谱法30。
从提取管底部的固体沉淀中回收的蛋白质（图2）经溶液内消化后，采用 shotgun LC-MS 进行分析（图5），而淀粉和细胞壁材料的提取方案可参见我们先前发表的实验方案16。
综上所述，从本示例所用类型的样品中可常规鉴定出200多种脂质分子、50种注释的中等极性代谢物以及数千种蛋白质。此外，该方法在使用不同组织、器官和细胞培养材料时表现出广泛的适用性（图6）。
<img alt="代谢组学工作流程图：样品采集、提取、数据获取、分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：大规模非靶向组学分析的一般工作流程。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="代谢物提取流程图；显示样品制备、涡旋振荡和离心步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：从一份生物样品中同时分析脂质、代谢物和蛋白质的样品制备与提取流程。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="颗粒提取过程；研磨、再提取、离心法；实验示意图，样品制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：使用两相分配提取方案时常见问题的图示示例。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱分析；色谱图，饼图；脂质谱型，相对丰度，化合物鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片提取物中脂质和中等极性代谢物的代表性色谱图。在正离子化模式下分析得到的脂质（上图）和中等极性代谢物（下图）的基峰色谱图16。每张色谱图右上角的饼图显示了归属于不同化学类别的已鉴定脂质和代谢物的数量。Chl，叶绿素；DAG，二酰基甘油；DGDG，二半乳糖基二酰基甘油；FA，脂肪酸；LysoPC，溶血磷脂酰胆碱；MGDG，单半乳糖基二酰基甘油；PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；SP，鞘脂；SQDG，磺基醌糖基二酰基甘油；TAG，三酰基甘油。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱数据图表和饼图；质谱峰；相对丰度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片提取物中肽段的代表性基峰色谱图。 
右上角的饼图显示了分配到不同生物学过程的已鉴定蛋白质的数量16。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植物组织提取过程；示意图；叶片、花朵、角果、种子；色素分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：野生型Arabidopsis thaliana不同组织类型的代表性提取示例。 
所有样品均使用50 mg新鲜组织重量进行提取。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间（分钟）</td>
			<td>缓冲液A到缓冲液B的百分比</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 至 1 分钟</td>
			<td>45% A </td>
			<td>缓冲液A：UPLC-MS级水中含1% 1M NH4-乙酸盐和0.1%乙酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 至 4 分钟 </td>
			<td>从45% A线性梯度变化至25% A</td>
			<td>缓冲液B：乙腈/异丙醇（7:3, v:v）中含1% 1M NH4-乙酸盐和0.1%乙酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 至 12 分钟 </td>
			<td>从25% A线性梯度变化至11% A</td>
			<td>流速 400 µL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 至 15 分钟 </td>
			<td>从11% A线性梯度变化至0% A</td>
			<td>进样体积 2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 至 19.5 分钟</td>
			<td>用0% A冲洗色谱柱4.5分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.50 至 19.51 分钟</td>
			<td>恢复至45% A </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.51 至 24 分钟</td>
			<td>用45% A平衡色谱柱 </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：脂质RP-UPLC分离的梯度参数。 RP，反相；UPLC，超高效液相色谱。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间（分钟）</td>
			<td>缓冲液A到缓冲液B的百分比</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 到 1 分钟</td>
			<td>99% A</td>
			<td>缓冲液A：含0.1%甲酸的UPLC级水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 到 11 分钟</td>
			<td>从99% A线性梯度变化至60% A</td>
			<td>缓冲液B：含0.1%甲酸的UPLC级乙腈</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 到 13 分钟</td>
			<td>从60% A线性梯度变化至30% A</td>
			<td>流速 400 µL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 到 15 分钟</td>
			<td>从30% A线性梯度变化至1% A</td>
			<td>进样体积 2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 到 16 分钟</td>
			<td>用1% A冲洗色谱柱1分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 到 17 分钟</td>
			<td>从1% A线性梯度变化至99% A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17 到 20 分钟</td>
			<td>在99% A条件下平衡3分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用于极性和中等极性代谢物RP-UPLC分离的梯度参数。 RP，反相。UPLC，超高效液相色谱。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间（分钟）</td>
			<td>缓冲液B相对于缓冲液A的百分比</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 至 5 分钟</td>
			<td>从 0% 线性梯度升至 10%</td>
			<td>缓冲液A：含0.1%甲酸的UPLC级水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 至 80 分钟</td>
			<td>从 10% 线性梯度升至 40%</td>
			<td>缓冲液B：含0.1%甲酸的60% UPLC级乙腈</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 至 85 分钟</td>
			<td>从 40% 线性梯度升至 60%</td>
			<td>流速 300 nL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85 至 86 分钟</td>
			<td>从 60% 线性梯度升至 95%</td>
			<td>进样体积 5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>86 至 91 分钟</td>
			<td>用 95% 缓冲液B冲洗色谱柱 5 分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>91 至 92 分钟</td>
			<td>从 95% 线性梯度降至 0%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>93 至 110 分钟</td>
			<td>在 0% 条件下平衡色谱柱 17 分钟</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：肽段纳米液相色谱分离的梯度参数。LC，液相色谱。

介绍了一种利用单个样品对生物组织中的脂质、代谢物和蛋白质进行综合提取的实验方案。

理解复杂的生物系统需要对活细胞中多种化合物类别进行测量、分析和整合，通常……

本方法的总体目标是通过简单的分步甲基-叔丁基醚提取，从单个样品中回收并分析所有主要的分子实体，包括极性与中等极性代谢物、脂质以及蛋白质。通常情况下，科学家难以从单一样品中同时分析多种化合物类别。通过本研究所介绍的MTBE提取法，您可从单个样品中提取并分析多种化合物类别，例如脂质、代谢物和蛋白质。该技术的主要优势在于，能够从少量单一样品等分试样中稳定地提取所有类型的分子化合物。该方法有助于回答系统生物学中的基本问题，因为它为多组学分析提供了实验基础，所获得的组分可用于蛋白质组学、脂质组学和代谢组学分析。以下方案以拟南芥叶片组织为例进行演示。拟南芥是十字花科的小型开花植物，与卷心菜有亲缘关系。开始本操作前，先将组织匀浆器管架在液氮中预冷至少10分钟。从液氮中取出样品，放入管架中。然后从液氮中取出试管架，迅速将试管架放入组织匀浆机中，设置匀浆机将生物材料研磨成细而均匀的粉末。对于叶片，使用20赫兹频率研磨1分钟。匀浆时间和速度可根据组织类型进行调整。务必充分匀浆，直至样品成为极细的粉末状。在匀浆的每一步骤中，样品均应保持冷冻状态。将样品匀浆后，从试管架上取出生物样品。若不立即使用，应将其置于-80°C超低温冰箱中保存，待后续提取。用样品编号标记四个2毫升圆底安全锁微离心管。将离心管和部分刮勺浸入液氮中进行预冷。待离心管和刮勺冷却后，将其中一根离心管置于分析天平上，用刮勺取25毫克组织粉末分装至微量离心管中。记录每个样品的精确重量，然后立即将分装好的样品放入液氮中。此步骤需快速操作，以避免植物材料解冻。将分装好的样品于-80摄氏度保存，直至后续提取。为准备提取，将按照随附文件所述配制的甲基叔丁基醚（MTBE）-甲醇提取混合液置于-20摄氏度冰箱中预冷。取出分装的样品，向每个样品管中加入一毫升预冷的提取混合液。此步骤需快速操作。MTBE 粘度较低，易从移液器吸头滴落。每份样品立即在涡旋振荡器上充分混匀，直至组织在提取液中完全匀浆。将离心管置于实验台上的管架中，等待所有样品完成提取。此步骤至关重要。在此步骤中，我们使蛋白质沉淀并使其酶活性失活。将所有样品置于4°C条件下，以100 RPM的转速在旋转摇床上孵育45分钟。随后将样品置于冰浴超声仪中，超声处理15分钟。接下来，通过相分离进行分相，向每个样品管中加入650微升水与甲醇按3:1配制的溶液。然后涡旋混匀1分钟。在4摄氏度条件下，以20,000 ×g离心5分钟。完成此步骤后，应小心操作离心管，避免两种液相混合或扰动已沉淀的沉淀物。此时，离心管底部存在固体沉淀物，上方为两层可接受的液相，上层非极性相含有脂质。下层水相含有极性和中等极性代谢物。沉淀物中含有蛋白质、淀粉和细胞壁。将上层含脂相中的500微升溶剂转移至已标记的1.5毫升微量离心管中。然后，使用 200 微升移液器小心移除剩余的脂相并弃去。接着，将下相中的 400 微升溶剂转移至已标记的 1.5 毫升微量离心管中。另取 200 微升等分试样转移至微量离心管，用于进一步分析，例如基于气相色谱的代谢物分析。用移液器吸除并弃去多余的水相部分。随后，为洗涤获得的蛋白质-淀粉-细胞壁沉淀，加入500微升甲醇，涡旋混匀1分钟。在4摄氏度条件下，以10,000 × g离心5分钟。使用氮气流蒸发仪去除脂质样品中的溶剂，以避免脂质发生氧化修饰。所得干燥样品应立即进行分析。将水相样品在真空浓缩仪中避光过夜蒸发溶剂，过程中不加热。干燥的水相样品可在负80摄氏度下保存数周后再进行分析。将干燥的脂质组分重新悬浮于400微升体积比为7:3的乙腈与2-丙醇混合溶液中。转移足够量的液体至玻璃小瓶中，并 tightly 封盖。然后，将玻璃小瓶置于4 °C的冷却自动进样器中。每份样品进样2 μL，使用流速为400 μL/min的UPLC系统，在60 °C下通过反相C8色谱柱分离脂质。色谱分离所用的流动相详见随附文件中的表1。使用合适的质谱仪，在正离子和负离子化模式下采集质荷比范围为150至1500的质量谱图。将极性相重新悬浮于200微升超高效液相色谱级甲醇与水按1:1配制的溶液中。转移足量液体至玻璃小瓶中，并 tightly 封盖。然后，将玻璃小瓶置于4°C的冷却自动进样器中。从每个样品中注入2 µL，在40°C下使用UPLC系统在RP C-18色谱柱上分离代谢物，流速为400 µL/min。采用随附文件中表2所列参数的流动相进行色谱分离。使用合适的质谱仪，在正离子和负离子电离模式下采集质荷比范围为50至1500的全扫描质谱数据。最后，按照随附文件所述进行蛋白质提取、消化和分析。采集25毫克拟南芥叶片组织，研磨后提取，并用于三种分析型UPLC-MS平台检测。采用反相C-18超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）对极性和中等极性的初级与次级代谢物进行分析。上图显示的是脂质的基峰色谱图，下图显示的是中等极性代谢物的基峰色谱图，均在正离子化模式下进行分析。每张色谱图右上角的饼状图展示了归属于不同化学类别的已鉴定脂质和代谢物的数量。例如，上图中以 TAG 表示的三酰甘油类别中鉴定出 58 种不同的脂质。该组分中极性较强的代谢物，如糖类和极性氨基酸，因在反相材料上保留效果不佳，可通过其他分析方法进行检测，例如气相色谱-质谱联用（GCMS）或亲水相互作用液相色谱。提取获得的蛋白质经溶液中消化后，采用鸟枪法液相色谱-质谱联用（LCMS）进行分析。右上角显示的饼状图表示被分配到不同生物学过程的已鉴定蛋白质数量。例如，有268种蛋白质被归类到定位类别中。综上所述，通常可从本示例所用的此类样本中鉴定出200多种脂质种类、50种注释的中等极性代谢物以及数千种蛋白质。此外，该方法在使用不同组织、器官和细胞培养材料时表现出广泛的适用性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从单一样本中提取和分析绝大多数必需化合物。在进行该操作时，重要的是保持所有样本处于冷冻状态，充分研磨材料，并使用分析纯级别的溶剂和化学试剂。采用此方法后，可运用所有分析方法来确定提取样品的分子组成。

a-simple-fractionated-extraction-method-for-comprehensive-analysis

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科研

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Biochemistry

生物化学

一种简单的分级提取方法，用于从单个样品中综合分析代谢物，脂质和蛋白质

我们介绍一种新的定量脂质组学方法，利用全扫描电喷雾电离质谱法（ESI/MS）鉴定酵母中的多种脂质种类。该方法在分辨各类脂质分子形式的能力、灵敏度和检测速度方面均优于目前可用的脂质鉴定与定量方法。...

利用电喷雾电离质谱法对酵母脂质组进行定量分析

本方案将演示从细胞中提取和分析游离及酯化生物活性脂肪酸的方法。采用稳定同位素稀释法、手性液相色谱-电子捕获大气压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-ECAPCI-MRM/MS）对脂肪酸进行准确定量。...

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

代谢组学实验结果的可靠性取决于样品制备的有效性和可重复性。本文描述了一种严格且深入的方法，能够从生物液体中提取代谢物，并可选择性地对多达数千种化合物或仅特定感兴趣的化合物类别进行后续分析。...

多步制备技术以回收多种代谢物化合物类别用于深入且信息丰富的代谢组学分析

本文介绍了一种方法，该方法在提高通量的同时，平衡了操作难度与准确性，可用于从微生物细胞膜中提取脂质，进而对大量样本研究中的总脂质以及指示性脂质的相对丰度进行表征，以确定土壤微生物群落结构。...

一种适用于大量样本实验中表征土壤微生物的脂质提取与分析方法

本文介绍了一种从单个土壤样品中同时提取代谢物、蛋白质和脂质的实验方案，可缩短样品前处理时间，并实现对样品量有限的样本进行多组学质谱分析。...

用于土壤样本多组学分析的 MPLEx 方案

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。...

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

本文的目的是描述一种从培养的贴壁细胞中提取水溶性代谢物以进行代谢组学分析（特别是毛细管电泳-质谱分析）的实验方案。...

从培养的贴壁细胞中提取水溶性代谢物用于毛细管电泳-质谱法进行代谢组学分析

我们介绍一种采用液相色谱串联质谱法鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞脂质组进行定量分析

啮齿类动物组织的 shotgun 脂质组学

学习使用甲基叔丁基醚分级提取法从单一生物样品中同时分离脂质、代谢物和蛋白质。该方法以拟南芥叶片为模型，支持多组学分析，为系统生物学研究提供可靠的实验基础。

一种用于从单个样品中全面分析代谢物、脂质和蛋白质的简单分级提取方法

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