隔离并通过流式细胞仪分析胰腺间充质细胞

该程序的总体目标是分离胰腺间充质细胞，用于其基因和表面标志物表达分析。这种方法可以帮助回答胰腺发育领域的关键问题，例如间充质细胞表达哪些线索以及它们如何影响上皮发育。这种技术的主要优点是它相对简单和快速，并且它允许良好的分选细胞产量。

首先将内脏器官存放在含有 HBSS 的培养皿中，并将培养皿置于立体显微镜下。使用细镊子从胃、十二指肠和脾脏中取出胰腺，分离肝脏和肾脏以露出胰腺。收集每个胰腺后，将组织转移到含有新鲜制备的消化缓冲液的锥形管中，并将管子放在冰上。

收获所有胰腺后，将组织转移到 37 摄氏度的加热块中 30 分钟，以 700 RPM 的转速搅拌，15 分钟后手动倒置试管 3 到 4 次。如果在消化的前半部分后仍然存在大块胰腺，请在最后 15 分钟内每 5 分钟倒置一次试管，并根据需要再孵育组织 5 到 10 分钟。消化结束时，将试管放在冰上，并向每个样品中加入 10 毫升冷 HBSS。

通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升新鲜 PBS 中。接下来，通过 35 微米过滤器将细胞过滤到 5 毫升圆底聚苯乙烯收集管中，并用 2 毫升新鲜 PBS 洗涤消化管，将洗涤液过滤到相应的收集管中。然后再次离心细胞并小心吸出上清液，而不会干扰沉淀。

根据动物的年龄，将细胞重悬于分选缓冲液中，并通过新的 35 微米细胞过滤器过滤到新的 5 毫升收集管中。将 50 至 100 微升体积的细胞分装到新的 FACS 管中，用于染色对照，包括用于每个荧光团的试管、活力染料、荧光蛋白和未染色的对照。用最多 4 mL 的分选缓冲液洗涤每个试管，然后离心。

接下来，根据动物的年龄将颗粒重悬于新鲜的分选缓冲液中。然后用活力染料对细胞进行染色。对于 RNA 提取前的细胞分选，在分选开始之前，在无菌的 1.5 mL 收集管中涂上 1 mL 含有 RNAse 抑制剂的分选缓冲液。

5 分钟后，涡旋收集管并取出液体。涡旋第一个染色对照并将试管装入流式细胞仪中以开始确定分选参数。设置完所有分选参数后，加载样品并将细胞分选到 1.5 mL 收集管中。

然后通过离心收集分选的细胞。吸出上清液至沉淀物，并根据标准 RNA 提取方案提取 RNA。在这里，显示了胚胎第 15.5 天胚胎和出生后第 4 天幼仔的孤立整个胃肠道，包括胃、脾、肠和胰腺。

如刚才所示，对来自胚胎、新生儿和成人胰腺组织的单细胞进行流式细胞术分析，表明来自所有分析年龄的转基因胰腺组织都包含不同的 YFP 标记的细胞群。分选后，可以培养这些间充质细胞以建立至少五代的细胞系。注意间充质细胞典型的培养细胞的纤维化形态。

分选的细胞表达泛充质标志物 vementin，在 RNA 提取和 cDNA 合成后通过 qPCR 分析。此外，分离的胰腺细胞表面标志物表达表明，转基因 YFP 胰腺中的所有荧光标记细胞都表达 CD9，CD9 是一种据报道由成纤维细胞表达的细胞表面糖蛋白。在此程序之后，可以执行其他方法（如 RNA 测序）来回答有关间充质细胞基因表达的其他问题。