通过流式细胞术分离和分析胰腺间充质细胞

本实验的总体目标是分离胰腺间充质细胞，以分析其基因和表面标志物的表达情况。该方法有助于解答胰腺发育领域中的关键问题，例如间充质细胞表达哪些信号分子，以及这些信号如何影响上皮发育。该技术的主要优点在于操作相对简便快速，并且能够获得较高得率的分选细胞。

首先将内脏器官放入含有HBSS的培养皿中，并将培养皿置于体视显微镜下。使用精细镊子分离肝脏和肾脏，暴露胰腺，并进一步将胰腺从胃、十二指肠和脾脏上剥离下来。每获取一个胰腺后，立即将组织转移至含有新鲜配制消化缓冲液的锥形管中，并将管子置于冰上。

当所有胰腺组织采集完毕后，将组织转移至37摄氏度的加热金属浴中，以700 RPM振荡消化30分钟，并在15分钟后手动倒置离心管三至四次。若在消化过程的前半段结束后仍存在较大的胰腺组织块，则在最后15分钟内每5分钟倒置一次离心管，并根据需要将组织额外孵育5至10分钟。消化结束后，将离心管置于冰上，并向每个样品中加入10毫升冷的HBSS溶液。

通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升新鲜 PBS 中。接着，将细胞通过 35 微米滤网过滤至 5 毫升圆底聚苯乙烯收集管中，并用 2 毫升新鲜 PBS 冲洗消化管，将冲洗液过滤至相应的收集管中。然后再次离心细胞，并小心吸除上清液，避免扰动沉淀。

根据动物的年龄，用分选缓冲液重悬细胞，并通过新的35微米细胞筛网过滤至新的5毫升收集管中。将细胞分装到新的FACS管中，每管50至100微升，用于染色对照，包括每种荧光染料、活力染料、荧光蛋白以及未染色对照各一管。每管加入最多4毫升分选缓冲液洗涤，然后离心。

接下来，根据动物的年龄，用新鲜的分选缓冲液重悬沉淀。然后用活细胞染料对细胞进行染色。在进行RNA提取前的细胞分选时，分选开始前立即用含有RNA酶抑制剂的1毫升分选缓冲液预润湿无菌的1.5毫升收集管。

五分钟后，涡旋混匀收集管并移除上清液。涡旋第一个染色对照管，然后将该管放入流式细胞仪中，开始确定分选参数。当所有分选参数设置完成后，加载样品并将细胞分选至1.5毫升收集管中。

然后通过离心收集分选后的细胞。吸除上清液至沉淀处，按照标准RNA提取方案提取RNA。此处显示的是胚胎第15.5天胚胎和出生后第4天幼鼠的分离完整胃肠道，包括胃、脾脏、肠和胰腺。

对如上所述分离的胚胎期、新生期和成年胰腺组织中的单细胞进行流式细胞术分析显示，所有被分析年龄段的转基因胰腺组织均含有 distinct 的YFP标记细胞群体。分选后，这些间充质细胞可进行培养，并建立细胞系，至少可传代五次。注意培养细胞呈现典型的间充质细胞纤维化形态。

通过RNA提取和cDNA合成后的qPCR分析表明，分选的细胞表达泛间充质标记物波形蛋白（vimentin）。此外，分离的胰腺细胞表面标记物表达分析显示，转基因YFP胰腺中所有荧光标记的细胞均表达CD9，这是一种成纤维细胞报道表达的细胞表面糖蛋白。在此步骤之后，可进一步采用其他方法（如RNA测序）来探究间充质细胞基因表达的更多问题。