Name: 隔离并通过流式细胞仪分析胰腺间充质细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: 学习利用流式细胞仪从小鼠胚胎、新生及成年胰腺组织中分离间充质细胞，分析其基因表达与表面标记，揭示胰腺发育与肿瘤发生中的细胞外信号调控机制。

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作者感谢Adi Sasson提供的技术协助以及Helen Guez对稿件的审阅。本工作由欧洲研究委员会启动资助项目（编号336204）资助。

实验按照特拉维夫大学动物研究委员会批准的方案进行。
1. 小鼠胰腺组织的分离
<ol>
	<li>对于成年小鼠：
	<ol>
		<li>配制消化缓冲液：将 0.4 mg/mL 胶原酶 P 和 0.1 ng/mL DNase I 溶解于汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。每只小鼠在 15 mL 圆锥形离心管中新鲜配制 5 mL 缓冲液，并在使用前置于冰上保存。</li>
		<li>根据机构指南实施小鼠安乐死。</li>
		<li>解剖每只小鼠以取出胰腺（操作说明请参见参考文献 18）；将其置于含有 HBSS 的培养皿中。此步骤可在体视显微镜下进行，为提高消化效率，可将组织切成 2–4 块。</li>
		<li>将胰腺组织放入含有消化缓冲液（步骤 1.1.1 中配制）的离心管中。在所有小鼠完成解剖并收集胰腺组织前，将离心管保持在冰上。</li>
		<li>对剩余小鼠重复步骤 1.1.2–1.1.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于胚胎及新生小鼠：
	<ol>
		<li>配制消化缓冲液：将 0.4 mg/mL 胶原酶 P 和 0.1 ng/mL DNase I 溶解于 HBSS 中。对于胚胎及出生后第 7 天（p7）或更小的幼鼠，每只小鼠在 15 mL 圆锥形离心管中新鲜配制 1.5–2 mL 缓冲液；对于 p7 及以上的幼鼠，每只小鼠配制 3–4 mL 缓冲液。使用前置于冰上保存。</li>
		<li>根据机构指南实施小鼠安乐死。对于胚胎，从母体子宫中取出所有胚胎，并置于含有 PBS 的 10 mm 培养皿中。每次解剖一个胚胎。</li>
		<li>将小鼠仰卧放置，头部朝向远离操作者的方向。使用精细镊子提起腹部皮肤，并沿中线剪开至横膈膜处，暴露腹腔18。</li>
		<li>使用精细镊子将肝脏从背部腹壁分离。连续向小鼠尾部方向移动，取出内脏器官（包括肝脏、胃、脾脏、肠道、肾脏和胰腺），并将其置于含有 HBSS 的培养皿中。</li>
		<li>在体视显微镜下，移除肝脏和肾脏以暴露胰腺（图 1）。使用精细镊子将胰腺从胃、十二指肠，最后从脾脏上分离。</li>
		<li>将胰腺组织放入含有消化缓冲液（步骤 1.2.1 中配制）的离心管中。对于 p14 及以上幼鼠，为提高消化效率，将组织切成 2 块。在所有小鼠完成解剖并收集胰腺组织前，将离心管保持在冰上。</li>
		<li>对剩余小鼠重复步骤 1.2.2–1.2.6。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胰腺消化
<ol>
	<li>将含有胰腺组织（置于消化缓冲液中）的离心管放入37 °C的加热金属块中孵育30分钟，同时以700 rpm振荡。孵育15分钟后，手动倒置离心管3–4次，然后放回加热金属块中。 
	注意：若使用的加热金属块不具备振荡功能，请每隔5–10分钟手动倒置离心管一次。确保组织充分消化；若消化不完全，可在孵育前将组织切成更小的片段，或提高振荡速度。</li>
	<li>为终止组织消化，将离心管置于冰上，并向每管中加入10 mL预冷的HBSS。在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，随后吸除上清液。</li>
	<li>重悬：
	<ol>
		<li>对于成年小鼠以及出生后第14天（p14）或更年长的幼鼠，用6 mL PBS重悬沉淀物，并通过置于新的15 mL锥形聚丙烯收集管上方的70 µm细胞滤网过滤。为确保最大程度回收细胞，用额外6 mL PBS冲洗原离心管，并将冲洗液同样通过细胞滤网滤入收集管中。</li>
		<li>对于胚胎及出生后小于p14的幼鼠，用2 mL PBS重悬沉淀物，并通过置于5 mL圆底聚苯乙烯收集管（FACS管）上方的35 µm细胞滤网过滤。为确保最大程度回收细胞，用额外2 mL PBS冲洗原离心管，并将冲洗液同样通过细胞滤网滤入收集管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，吸除上清液。吸取液体时需小心操作，因细胞与聚苯乙烯管壁的结合较为疏松。</li>
</ol>
3. 准备标记的单细胞
<ol>
	<li>缓冲液配制：采用FACS进行细胞分离时，通过混合不含氯化钙和氯化镁的PBS、5%胎牛血清（FBS）以及5 mM EDTA来配制分选缓冲液。用于流式细胞术分析时，将分选缓冲液中添加0.05%叠氮化钠以配制分析缓冲液。两种缓冲液均可在4–8 °C保存最多2个月。</li>
	<li>将细胞重悬于分选或分析缓冲液中。将每只胚胎及出生后7天（p7）以内的幼鼠胰腺组织用1 mL缓冲液重悬，出生后8天（p8）至1月龄幼鼠胰腺组织用1.5 mL缓冲液重悬，1月龄以上小鼠胰腺组织用3 mL缓冲液重悬。将细胞悬液通过置于圆底聚苯乙烯管（FACS管）上方的35 µm细胞筛网过滤。</li>
	<li>作为染色对照，从上一步制备的样品中取出50–100 µL等分试样（不超过总样品体积的5%），分装至新的FACS管中；每种使用的荧光染料均需设置一管，包括DAPI和荧光蛋白，同时设置未染色对照管。 
	注意：当使用表达荧光蛋白的转基因小鼠细胞或细胞数量有限时，应包括非转基因组织作为染色对照。若使用表达荧光蛋白的细胞且无需进一步染色，则直接进入步骤 3.8。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞，并吸除上清液。</li>
	<li>封闭时，用封闭液（100 µL 分选或分析缓冲液中加入 1 µL 小鼠IgG）重悬细胞，冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>为了染色细胞表面标志物，配制含有所有目标荧光素偶联抗体的混合液，每样本体积为 100 µL。用分选或分析缓冲液配制抗体的 2 倍稀释液（即， 将抗体稀释至所需浓度的两倍；若需要的最终稀释比例为1:200，则将抗体按1:100稀释。无需洗涤封闭液，直接向样本细胞中加入100 µL抗体混合液，使最终染色体积达到200 µL。冰上避光孵育30–60分钟。</li>
	<li>为设置分析或分选参数（见步骤 4.3 和 5.2），需额外准备仅含一种所用抗体的试管（单染对照）。在分选或分析缓冲液中（如步骤 3.6 所述）配制 2 倍浓度的抗体稀释液。确保为每种使用的荧光染料均设置相应的单染对照稀释液，并设置未染色对照。无需洗涤封闭液，直接向细胞（步骤 3.3 所制备）中加入 100 µL 抗体混合液，使最终染色体积为 200 µL。冰上避光孵育 30–60 分钟。</li>
	<li>用分析缓冲液或分选缓冲液将每管补至最大体积4 mL进行洗涤。可选步骤：将细胞再次通过35 µm细胞滤网过滤（如步骤3.2所述）。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟，小心移除上清液。</li>
	<li>将样本重悬于分析或分选缓冲液中。从胚胎中分离的细胞重悬于500 µL缓冲液中，从不足一个月的幼鼠中分离的细胞重悬于1 mL缓冲液中，从1–3个月龄小鼠中分离的细胞重悬于2 mL缓冲液中，从超过3个月龄的小鼠中分离的细胞重悬于3 mL缓冲液中。染色对照可重悬于300 µL缓冲液中。</li>
	<li>向重悬的细胞中加入200 ng/mL的DAPI以标记死细胞。需设置一个不含DAPI的未染色细胞管，用于流式细胞仪参数调节。随后进行细胞分选（步骤4）或分析（步骤5）。</li>
</ol>
4. 细胞分选
<ol>
	<li>准备工作：
	<ol>
		<li>在RNA提取前进行细胞分选时，分选前应立即用RNase抑制剂包被1.5 mL收集管。具体操作如下：将含有0.01 U/mL RNase抑制剂的1 mL分选缓冲液加入无菌的1.5 mL收集管中。孵育5分钟后，振荡混匀，弃去液体。</li>
		<li>细胞培养前进行细胞分选时，向无菌的15 mL收集管中加入3 mL无菌培养基（含20% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM））。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将样品管上机至流式细胞分选仪前，需短暂涡旋振荡以重悬细胞。其余样品管应保持在冰上。</li>
	<li>首先分析染色对照，以确定分选参数（例如， 电压和补偿）以及分选门（例如， 总细胞群体、活的DAPI阴性细胞以及待分选的细胞群体。</li>
	<li>设置好分选参数和门控后，加载样本并启动细胞分选，将细胞分选至收集管中。 
	注意：分选条件高度依赖于仪器。我们使用100 µm的喷嘴直径、23.1 psi的压力和最大分选速度5。</li>
	<li>继续进行RNA提取或分选细胞的培养。 
	注意：进行RNA提取时，以2,000 × g离心5分钟，去除上清液后，再按照标准提取流程操作。若需培养细胞，当细胞在非无菌条件下分选时，应使用培养基将细胞悬液冲洗两次，每次加满离心管后以300 × g离心7分钟，以尽量减少污染，然后再进行培养。</li>
</ol>
5. 流式细胞术进行细胞分析
<ol>
	<li>在将每支试管上机前，短暂涡旋振荡以重悬细胞。其余试管保持在冰上。</li>
	<li>首先分析未染色和单染色样本，以确定分析参数（例如， 电压和补偿</li>
	<li>设置好分析参数后，依次加载每个样本（包括染色对照），并记录结果。使用流式细胞术分析软件对获得的结果进行分析。</li>
</ol>

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<li>Özdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种分离和分析胰腺微环境中细胞的方法。该方法可用于从胚胎期和成年期的胰腺组织中分离间充质细胞。此外，我们已成功利用该方案从成年及新生胰腺中分离内皮细胞5,17。然而，该方法可能不适用于获得可重复的胰腺上皮细胞单细胞悬液（其他替代方案见参考文献18、23和24）。利用本方法，可通过荧光标记（包括表达荧光蛋白或经表面标志物免疫染色）的细胞，使用流式细胞分选（FACS）进行纯化，或通过流式细胞术进行分析。可从纯化后的细胞中提取RNA，以分析其基因表达谱。此外，纯化后的细胞也可进行培养，建立细胞系，用于后续的蛋白质组学分析。该方法将有助于鉴定胰腺微环境所表达的、调控其器官发生、生理功能及病理生理过程的相关因子。
胰腺间充质通过促进前体细胞和分化细胞的增殖，支持组织器官的发生5,9。研究表明，这些细胞能够支持由人胚胎干细胞（hESC）衍生的胰腺前体细胞的扩增17,25,26。因此，明确胚胎间充质因子的身份将有助于当前利用hESC和诱导性多能干细胞（iPSC）生成胰岛素分泌型β细胞的努力，从而为糖尿病提供潜在的治愈方案。小鼠遗传学研究已鉴定出由间充质产生、在胰腺发育早期促进胰腺上皮扩张的生长因子，例如Fgf103,9。为了鉴定在胚胎间充质中表达的其他因子，我们采用激光捕获显微切割技术分离这些细胞，提取其RNA并进行基因表达分析26。然而，该方法不仅劳动密集，而且依赖于基于细胞形态特征进行识别，因此仅适用于上皮向周围间充质分支之前的发育阶段（i.e., e12.5）。为了在更晚的发育阶段对间充质细胞进行表征，我们采用了本文所述的方法5,17。
我们采用该方法分析新生儿胰腺间充质细胞表面标志物的表达5此外，从胚胎期和新生期的胰腺组织中分离出了间充质细胞 Nkx3.2-Cre;R26-EYFP 小鼠，根据该小鼠品系中的荧光标记进行筛选，并进行培养以建立细胞系17这些细胞的蛋白质组学分析有助于鉴定由胰腺间充质分泌、能够促进人胚胎干细胞来源的胰腺前体细胞发育的因子17我们进一步采用该细胞分离方法，从成年胰腺组织中纯化间充质细胞，用于RNA提取和基因表达分析17因此，该方法可用于鉴定胰腺间充质中表达的基因和蛋白质，这些基因和蛋白质具有支持胰腺细胞发育的能力。
进一步研究表明，胰腺间充质细胞在胰腺肿瘤发生中发挥一定作用。胰腺导管腺癌（PDAC）的特征是形成富含成纤维细胞的纤维化间质，该间质由成纤维细胞、免疫细胞和细胞外基质（ECM）27组成。尽管间质曾被认为可促进多种癌症的发展，但研究发现其实际上可抑制PDAC的进展15,16,28。这表明胰腺间质的某些组分可能分泌抑制肿瘤发生的因子。此外，间质细胞组成及其细胞表型的变化可能影响其对上皮细胞的作用15,16,28。因此，本文所述方法有助于鉴定PDAC间质与健康胰腺组织间在细胞类型组成上的差异。该方法还可用于分离纯化不同的间质细胞类型，以分析其在PDAC进展过程中基因表达谱的潜在变化。然而，由于肿瘤发生过程中胰腺ECM成分发生变化27，可能需要对组织消化参数进行调整，例如增加其他类型的胶原酶或延长孵育时间。

哺乳动物的能量稳态和食物消化依赖于胰腺的正常功能。成年胰腺主要由两个细胞区室组成：外分泌部和内分泌部。外分泌细胞包括产生和分泌消化酶的腺泡细胞，以及将这些酶转运至肠道的导管细胞，占胰腺总质量的80%以上1。内分泌细胞包括产生胰岛素的β细胞和产生胰高血糖素的α细胞，它们聚集形成朗格汉斯胰岛，散布于外分泌组织中，通过分泌激素调节血糖水平2。
胰腺细胞通过一个高度调控的多步骤过程获得其分化命运3。研究表明，神经细胞、内皮细胞和间充质细胞提供的外在信号在胚胎中引导胰腺细胞的分化与增殖3,4,5。其中一个例子是主动脉对早期胰腺前体细胞特化的必要性6。在发育后期，内皮细胞被证明在胰腺内分泌和外分泌细胞的发育中起核心作用，并能促进β细胞的分化4,6,7。间充质细胞被证明可通过分泌生长因子Fgf10主要支持共同胰腺前体细胞的存活与扩增8,9。我们进一步证明，这些细胞支持胚胎胰腺中内分泌和外分泌前体细胞以及分化细胞（包括腺泡细胞和β细胞）的增殖5。最近，间充质细胞还被证明可调控内分泌细胞的分化10。
在成体中，β细胞的功能和数量依赖于其微环境中的细胞，包括神经细胞、免疫细胞、内皮细胞以及周细胞11,12,13。在损伤过程中，内皮细胞被证实可募集免疫细胞至胰腺，以促进β细胞的复制13。此外，内皮细胞还被证明可产生细胞外基质（ECM）成分，以支持胰岛素表达和β细胞功能14。我们最近证实了胰岛周细胞对β细胞功能的必要性11。最后，胰腺间质细胞被证明可调控胰腺导管腺癌（PDAC）的进展15,16。然而，指导胰腺发育、功能及肿瘤发生的外在信号分子在很大程度上仍不清楚。
确定胰腺微环境中细胞所提供的信号线索，需要对这些细胞所表达的基因和蛋白质进行表征。这依赖于从胰腺中分离出这些细胞，以开展基因表达和蛋白质组学分析，和/或建立细胞系。本文提出一种利用组织酶解结合荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于分离胰腺微环境中的间充质细胞，该方法适用于经免疫荧光标记的细胞或表达荧光蛋白的细胞。该方案已成功用于分离和分析胚胎期、新生期及成年期胰腺中表达黄色荧光蛋白（YFP）的间充质细胞5,17。

<table><tbody><tr><td>胶原酶 P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>有效单位应至少为 2,000 单位/毫升蛋白</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>山羊 IgG 血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>不含氯化钙和氯化镁</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>圆底聚苯乙烯 5 mL 管</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>FACS 管。请确保所用试管与将使用的流式细胞仪兼容，因为不同品牌对试管的要求略有差异</td></tr><tr><td>带 35 &amp;mu;m 细胞筛网 snap cap 的 5 mL 管</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>FACS 管</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛网&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>带振荡功能的加热块&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术分离和分析胰腺间充质细胞

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

胰腺由上皮细胞构成，这些细胞在食物消化和血糖调节中起必需作用。研究表明，胰腺微环境中的细胞（包括内皮细胞、神经元细胞和间充质细胞）可调控胚胎胰腺中的细胞分化与增殖。在成体中，胰岛素生成细胞的功能和数量依赖于其微环境中的细胞，包括周细胞、免疫细胞、内皮细胞和神经元细胞。最后，胰腺微环境的改变被证明可调控胰腺肿瘤的发生。然而，介导这些过程的具体信号尚不完全明确。因此，鉴定构成胰腺微环境的不同细胞类型，并分析其基因表达谱，对于阐明正常及疾病状态下胰腺组织的发育与功能至关重要。本文介绍了一种从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺中分离间充质细胞的方法。该方法利用酶消化小鼠胰腺组织，随后对标记的细胞进行荧光激活细胞分选（FACS）或流式细胞术分析。细胞可通过表面标志物的免疫染色或荧光蛋白的表达进行标记。细胞分离有助于鉴定胰腺间充质细胞中表达的基因和蛋白质。本方案已成功用于从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺中分离并培养高纯度的间充质细胞群体。

胰腺间充质在发育过程及成体阶段均是必需的。本文所述方法可用于从胚胎期、新生期和成年期胰腺中分离间充质细胞。在Nkx3.2-Cre;R26R-YFP小鼠的胰腺中，仅有间充质细胞表达黄色荧光蛋白（YFP），其他细胞类型均不表达5,11,17,19。在发育过程中，Nkx3.2（亦称为BapX1）在胚胎期胰腺、胃和肠道间充质中表达，也在部分骨骼体节中表达19,20,21。该基因在胰腺间充质中从胚胎第9.5天（e9.5）持续表达至第11.5天（e11.5），因此可利用Nkx3.2-Cre在e9.5起驱动基因表达5,19,20。基于此标记，可通过流式细胞术从大量胰腺组织中纯化出相应细胞。图2展示了按照本文所述方法分离得到的胚胎期、新生期和成年期胰腺组织单细胞的流式细胞术分析结果。非转基因胰腺组织中未检测到荧光细胞，而所有检测年龄段的Nkx3.2-Cre;R26R-YFP胰腺组织均含有明显可辨的YFP标记细胞群（图2；以门控标记）。
按照此处描述的方法，可对表达荧光蛋白的细胞进行流式细胞术分析或分选纯化，也可在额外进行免疫染色的基础上开展。例如，根据荧光标记进行分选后，可对间充质细胞进行培养以建立细胞系（至少传代五次），如图3A所示。注意培养细胞呈现典型的成纤维细胞样形态，符合间充质细胞的特征。此外，该系统还可用于分析分选后细胞的基因表达。为此，从分选得到的间充质细胞中提取RNA并合成cDNA，通过qPCR分析基因表达水平。此类分析显示，分选后的细胞表达泛间充质标志物波形蛋白（vimentin）（图3B）。最后，可通过流式细胞术分析胰腺细胞的表面标志物表达情况。例如，我们采用此处所述方法从成年Nkx3.2-Cre;R26R-YFP小鼠的胰腺组织中分离细胞，并使用细胞表面糖蛋白CD9进行染色，已有文献报道成纤维细胞表达CD922。如图3C所示，Nkx3.2-Cre;R26R-YFP小鼠胰腺中所有荧光标记的细胞均表达CD9。
<img alt="e15.5 和 p4 胚胎发育阶段，显微镜图像显示结构差异。" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：胚胎期和新生期的胰腺组织。 分离的完整胃肠道组织，包括 e15.5 胚胎 (A) 和 p4 幼鼠 (B) 的胃、脾、肠和胰腺。胰腺组织以蓝色线条标出。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术散点图；胚胎期、新生期、成年期；黄色荧光与侧向散射数据。" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 胰腺组织中的间充质细胞被荧光标记。 对来自非转基因小鼠（左图）和 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 转基因小鼠（右图）在不同年龄阶段分离的胰腺细胞进行流式细胞术分析：胚胎期 (A)、新生期 (B) 和成年期 (C)。细胞按侧向散射（y轴）和黄色荧光（x轴）进行分析。门控区域（以“D”标记）显示在转基因小鼠中存在 YFP+ 细胞群，而在非转基因对照小鼠中则无此细胞群。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，波形蛋白表达，流式细胞术散点图，基因分析。" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：分离的胰腺细胞的分析。（A） 从小鼠胰腺组织中分选的 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 新生小鼠细胞（如 图 2B 所述）经培养建立细胞系。培养后的细胞进行荧光成像（绿色；左、右图）和相差成像（灰色；右图）。（B） 柱状图显示来自 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 成年小鼠胰腺组织的 YFP+ 分选细胞（如 图 1C 所述；绿色）与未分选胰腺组织（黑色）中 Vimentin1（Vim1）的表达水平。提取 RNA 并通过 qPCR 分析基因表达；表达水平以 Cyclophilin 为内参进行标准化。N = 4。***P &lt; 0.001。数据表示为均值 ± 标准差。（C） 来自 Nkx3.2-Cre;R26R-YFP 成年小鼠的胰腺细胞经分散后，使用藻蓝蛋白（APC）标记的抗 CD9 抗体进行免疫染色，并通过流式细胞术分析 APC 信号（y 轴）和黄色荧光信号（x 轴）。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺组织中分离胰腺微环境中细胞的方法，重点在于间充质细胞的分离。该方法可用于分析细胞的基因表达和蛋白质分泌，从而阐明调控胰腺发育、功能及肿瘤发生过程中的外在信号。

胰腺由上皮细胞组成，这些细胞在食物消化和血糖调节中起必需作用。胰腺微环境中的细胞，……

本实验的总体目标是分离胰腺间充质细胞，以分析其基因和表面标志物的表达。该方法有助于回答胰腺发育领域中的一些关键问题，例如间充质细胞表达哪些信号分子，以及这些信号如何影响上皮发育。该技术的主要优点在于操作相对简便、快速，并能获得较高得率的分选细胞。首先将内脏器官放入含有HBSS的培养皿中，并将培养皿置于体视显微镜下。使用精细镊子分离肝脏和肾脏，暴露胰腺，并进一步将胰腺从胃、十二指肠和脾脏上剥离下来。每收集一个胰腺后，立即将组织转移至含有新鲜配制消化缓冲液的锥形管中，并将管子置于冰上。当所有胰腺组织采集完毕后，将组织转移至37摄氏度的加热金属浴中，以700 RPM振荡孵育30分钟，并在15分钟后手动倒置离心管三至四次。若在消化的前半阶段结束后仍存在较大的胰腺组织块，则在最后15分钟内每5分钟倒置一次离心管，并根据需要将组织额外孵育5至10分钟。消化结束后，将离心管置于冰上，并向每个样品中加入10毫升冷的HBSS。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升新鲜 PBS 中。接着，将细胞通过 35 微米滤器过滤至 5 毫升圆底聚苯乙烯收集管中，并用 2 毫升新鲜 PBS 冲洗消化管，将冲洗液过滤至对应的收集管中。然后再次离心细胞，并小心吸除上清液，避免扰动沉淀。根据动物的年龄，用分选缓冲液重悬细胞，并通过新的35微米细胞筛网过滤至新的5毫升收集管中。将细胞分装到新的FACS管中，每管50至100微升，用于染色对照，包括每种荧光染料、活力染料、荧光蛋白以及未染色对照各一管。每管加入最多4毫升分选缓冲液洗涤，然后离心。接下来，根据动物的年龄，用新鲜的分选缓冲液重悬沉淀。然后用活细胞染料对细胞进行染色。在进行RNA提取前的细胞分选时，分选开始前立即用含有RNase抑制剂的1毫升分选缓冲液预润湿无菌的1.5毫升收集管。五分钟后，涡旋混匀收集管并移除上清液。涡旋第一个染色对照管，然后将该管放入流式细胞仪中，开始确定分选参数。当所有分选参数设置完毕后，加载样品并将细胞分选至1.5毫升收集管中。然后通过离心收集分选后的细胞。吸除上清液至沉淀处，按照标准RNA提取方案提取RNA。此处展示了胚胎发育第15.5天胚胎及出生后第4天幼鼠的分离完整胃肠道组织，包括胃、脾脏、肠和胰腺。对如上所述分离的胚胎期、新生期和成年胰腺组织中的单细胞进行流式细胞术分析显示，所有被分析年龄段的转基因胰腺组织均含有 distinct 的YFP标记细胞群体。分选后，这些间充质细胞可进行培养，并建立细胞系，至少可传代五次。注意培养细胞呈现典型的间充质细胞纤维化形态。通过RNA提取和cDNA合成后的qPCR分析表明，分选的细胞表达泛间充质标记物波形蛋白（vimentin）。此外，分离的胰腺细胞表面标记物表达分析显示，转基因YFP胰腺中所有荧光标记的细胞均表达CD9，这是一种成纤维细胞报道表达的细胞表面糖蛋白。在此步骤之后，可进行RNA测序等其他方法，以进一步探究间充质细胞基因表达的相关问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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