胰岛组织石蜡切片包埋

该方法可帮助科学家充分利用胰岛组织，在保持其天然组织结构的基础上，对每个样本进行多种指标的评估。这种新型包埋方法的主要优势在于，胰岛能够在定义明确的区域内均匀分布，使大量胰岛位于切片平面内，从而最大限度地提高这种稀有材料的实验产出率。本次实验操作将由我实验室的研究助理孔亚辉博士进行示范。

开始此操作时，使用低吸附性 p200 移液枪头，在体视显微镜下借助校准网格手动挑选 250 个胰岛当量，并将其转移至每个 1.5 毫升低吸附性微量离心管中。让胰岛沉降到微量离心管底部。

然后，使用带有新的 p200 吸头的移液器小心地吸除大部分上清液，注意不要吸走任何胰岛。加入 1 毫升 PBS，并在摆桶式离心机中离心，直至转速达到 200 ×g，然后停止离心。

弃去上清液。重复整个PBS洗涤过程，共进行两次洗涤循环。接着，加入500 µL的10%福尔马林溶液或4%新鲜配制的多聚甲醛。

室温下固定样品30分钟。随后，使用带有p200吸头的移液器去除固定液。加入1毫升PBS，离心至转速达到200 × g后停止离心。

弃去上清液，然后重复整个PBS洗涤过程一次，共进行两次洗涤循环。按照文本方案中的说明，在1.5毫升微量离心管中制备所需凝胶。接着，将这些微量离心管放入70摄氏度的加热块中，以预热凝胶。

使用剪切过的移液器吸头将每份样品 10 微升琼脂糖蓝色珠粒转移至洁净的 1.5 毫升微量离心管中。向珠粒中加入 1 毫升 PBS，然后在 800 × g 离心 1 分钟。移除 PBS，并重复洗涤一次。

第二次洗涤后，将磁珠重悬于适量的 PBS 中。对含有胰岛的离心管进行离心，直至转速达到 200 × g 后停止离心。吸除大部分上清液。

使用剪刀为每个样本剪掉一个 10 微升移液器吸头的末端。使用每个样本专用的干净剪切吸头，向每个胰岛管中加入 10 微升磁珠。然后离心，直至转速达到 200 × g。

此后，使用未切割的 200 微升枪头，再使用 10 微升枪头，尽可能吸除 PBS。标记载玻片以进行样本识别，并将其放置在靠近加热块的实验台上，旁边放好预热的凝胶。使用剪刀，为每个样本剪去几个低吸附微量移液器枪头的尖端。

使用带有剪切尖端的微量移液器，将温热的凝胶加入含有胰岛和微珠的离心管中。立即混匀，同时避免产生气泡。将此混合物滴加到载玻片上，在载玻片边缘附近形成一个圆盘状结构，并预留出外层凝胶环的空间。

然后，轻轻敲击载玻片数次，使胰岛和磁珠沉降。向样品管中加入 20 µL 温热的凝胶，将新凝胶与剩余的胰岛和磁珠混匀。将此混合物加至同一载玻片上，围绕原始凝胶圆盘的周围区域。

根据需要，每次使用新的预切割吸头重复操作，直至圆片达到所需的尺寸和厚度。确保每个圆片单独制备，并在每侧放置多个圆片时注意记录样品顺序。接下来，将载玻片置于湿冰的平坦表面上，并覆盖保存。

将载玻片静置10分钟，或直至凝胶完全凝固。然后取出载玻片，并确保将每张载玻片背面彻底干燥。为每个样本标记一个活检处理与包埋组织盒。

使用剃刀刀片的钝边，从各个方向轻轻推动圆盘，使其脱离玻璃。当圆盘能够顺畅滑动时，缓慢将其从载玻片上推下，并将圆盘的平面朝下直接放置在纸上。在将圆盘从玻璃载玻片转移至纸张的过程中，可能难以保持各个圆盘的完整性。

如果圆盘出现褶皱，请使其恢复至原始位置，添加更多凝胶并重新封片。将纸张折叠包住圆盘以防止移动。将此样本转移至盒中，然后盖上盒盖。

将盒式夹具浸入盛有PBS的烧杯中。本研究采用一种改良的基于凝胶圆盘的包埋方法，以高效地每切片获得大量胰岛。啮齿类动物胰岛在胰岛培养基中经过分离后恢复培养后形态明显更加完整，表现出光滑的圆形表面和致密的球形结构。

人胰岛的形态相似，无论是在到达当天立即包埋，还是在运输后过夜恢复再包埋，这可能是因为胰岛在运输前已从分离过程中的应激状态中恢复。相比之下，通过旧的微量离心管技术获得的石蜡切片显示组织横截面积较小，每张切片中的胰岛数量较少，且胰岛与微珠排列紧密。如本图所示，该技术能够制备出高质量的胰岛切片，适用于组织学和免疫荧光染色。

胰岛素和胰高血糖素染色显示了胰岛结构的多样性和异质性，展示了人、小鼠和大鼠胰岛之间已知的结构差异。这些图像还代表了同一胰岛的连续切片，表明该技术能够从同一胰岛获取多个切片。

掌握后，该技术比微型离心法更节省时间。在平面上制备组织块而非在离心管中，可更方便地将组织块直接转移至包埋盒中进行后续处理。尽管该方法可用于研究胰岛生物学，也可应用于其他难以切片的细胞团块或易碎组织。

进行该操作时，需注意使用小体积凝胶将组织浓缩在较小区域，并在平坦表面上形成凝胶盘。同时，必须使用低吸附的微量离心管和移液器吸头，以提高组织得率。该技术为胰岛生物学领域的研究人员探索在保持天然结构的完整培养胰岛中细胞类型组成与异质性、细胞间相互作用以及基因调控机制提供了重要途径。

从单一实验条件下制备出10个或更多含有大量胰岛的切片，使得能够在相同材料上定量分析多种结果，从而提高实验效率。将该技术应用于稀有组织样本，可能对其他领域也有益处。该实验方案的部分步骤可能需要根据用户需求进行修改。

固定强度和分割步骤需要优化。利用该技术可制备更厚或更大的圆盘。包埋的简单处理步骤可能需要嵌套进行，且应予以优化。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备高质量的琼脂糖细胞包埋块，用于全培养胰岛的石蜡切片。