胰岛嵌段石蜡切片

这种方法可以帮助科学家最大限度地有效利用胰岛，以评估其天然组织结构中每个样本的多种结果。这种新包埋方法的主要优点是胰岛均匀分布在一个明确定义的区域上，将许多胰岛放置在切片平面上，从而优化了这种低丰度材料的实验产量。演示该程序的是我实验室的助理研究员 Yahui Kong 医生。

要开始此过程，请使用低结合力 p200 移液器吸头和立体显微镜下的校准网格，以手工挑选 250 个胰岛当量。将它们转移到每个 1.5 mL 低结合微量离心管中。让胰岛沉降到微量离心管的底部。

然后，使用带有新鲜 p200 吸头的移液器小心去除大部分上清液。确保不要删除任何胰岛。加入 1 毫升 PBS 并在摆桶离心机中离心，直到速度达到重力的 200 倍，然后停止旋转。

去除上清液。重复整个 PBS 洗涤过程，总共两个洗涤周期。接下来，加入 500 微升 10% 福尔马林溶液或 4% 新鲜制备的多聚甲醛。

让样品在室温下固定 30 分钟。在此之后，使用带有 p200 吸头的移液器去除固定剂。加入 1 毫升 PBS 并离心至速度达到 200 倍重力，然后停止旋转。

去除上清液，然后再次重复整个 PBS 洗涤过程，总共两个洗涤周期。按照文本方案中的概述，在 1.5 mL 微量离心管中制备所需的凝胶。接下来，将这些微量离心管放入 70 摄氏度的加热块中以加热凝胶。

使用切割的微量移液器吸头将每个样品的 10 微升琼脂糖蓝珠转移到干净的 1.5 mL 微量离心管中。向珠子中加入 1 毫升 PBS，然后以 800 倍重力离心 1 分钟。取出 PBS 并再次重复此洗涤。

第二次洗涤后，将微珠重新悬浮在适量的 PBS 中。离心含有胰岛的试管，直到速度达到重力的 200 倍，然后停止旋转。去除大部分上清液。

用一把剪刀为每个样品剪下一个 10 微升微量移液器吸头的末端。使用干净的切割尖端向每个胰岛管中加入 10 微升珠子，每个样品。然后离心至速度达到重力的 200 倍。

在此之后，使用未切割的 200 微升，然后使用 10 微升吸头以去除尽可能多的 PBS。标记显微镜载玻片以进行样品识别，并将它们放在加热块附近的工作台上，并带有加热的凝胶。使用一把剪刀，剪下每个样品中几个低结合微量移液器吸头的末端。

使用配备有切割尖端的微量移液器，将温热的凝胶添加到含有胰岛和珠子的试管中。立即混合，同时避免产生任何气泡。将此混合物涂抹在玻片边缘附近形成圆盘的玻片上，同时为外部凝胶环留出空间。

然后，轻轻敲击载玻片几次以沉淀胰岛和珠子。向样品管中加入 20 μL 温凝胶，并将新凝胶与任何剩余的胰岛和珠子混合。将此混合物涂抹在原始椎间盘周围的同一张载玻片上。

根据需要，使用新鲜的预切尖端重复每次应用，直到圆盘达到所需的大小和厚度。确保在每侧放置多个圆盘时单独准备每个圆盘，并跟踪样品顺序。接下来，将载玻片放在湿冰的平坦表面上并盖上。

让玻片静置 10 分钟或直到凝胶凝固。然后，取下载玻片，确保每张载玻片的背面干燥。为每个样本标记活检处理和包埋组织盒。

使用剃须刀片的钝边从每个方向轻轻推动椎间盘，将其从玻璃中释放出来。当它容易滑动时，慢慢地将圆盘从载玻片上推出，然后将圆盘平整的一面直接放在纸张上。在将不同的椎间盘从载玻片滑到纸张上时，可能很难保持不同的椎间盘完整。

如果椎间盘出现皱纹，请使其恢复到原来的位置，添加更多凝胶并重新凝胶化载玻片。将纸张折叠在圆盘周围以防止移动。将其转移到暗盒中，然后合上暗盒。

将盒浸入装满 PBS 的烧杯中。在本研究中，使用基于凝胶盘的改良包埋方法有效地产生每个切片的高产量胰岛。在胰岛培养基中分离后恢复后，啮齿动物胰岛的形态明显更加完整，表现出光滑的圆形表面和紧凑的球形。

人类胰岛形态相似的事实，无论是在到达当天还是在装运后一夜之间恢复后嵌入，都可能是由于胰岛在装运前从隔离应激中恢复过来。相比之下，通过旧的微管技术获得的石蜡切片具有较小的组织横截面积，每个切片的胰岛较少，胰岛和珠子密集堆积。如此处所示，该技术能够产生高质量的胰岛切片，用于组织学和免疫荧光染色。

胰岛素和胰高血糖素染色显示胰岛结构的多样性和异质性，表明人、小鼠和大鼠胰岛之间已知的结构差异。这些图像还表示同一胰岛的连续切片。证明该技术能够从同一胰岛获得多个切片。

一旦掌握，这种技术比微量离心机技术更节省时间。在平面上而不是在管中形成圆盘，可以更轻松地将圆盘物理转移到暗盒中进行处理。虽然这种方法可以提供对胰岛生物学的见解，但它也可以应用于其他难以切片的细胞块或易碎组织。

在尝试此程序时，重要的是要记住使用小体积凝胶将组织集中在小区域并在平坦的表面上形成圆盘。使用低结合力微量离心管和移液器吸头来提高组织产量也很重要。这项技术为胰岛生物学领域的研究人员在其天然结构中探索整个培养胰岛的细胞类型组成和异质性、细胞间相互作用和基因调控铺平了道路。

从单个实验条件生成 10 个或更多包含许多胰岛的切片的能力允许对同一材料上的多个结果进行量化，从而提高实验效率。将这种技术应用于丰度有限的组织样品也可能为其他领域带来好处。可能需要修改此过程的元素以满足用户需求。

应优化固定强度和分割。使用这种技术可以生成更厚或更大的椎间盘。嵌入的简单处理步骤可能需要嵌套，并且应该对其进行优化。

看完这个视频，你应该对如何为整个培养的胰岛的石蜡切片生成高质量的琼脂糖细胞块有一个很好的了解。