两种算法的高通量和多参数定量果蝇神经肌肉接头形态

该程序的总体目标是使用形态测量软件宏自动量化果蝇神经肌肉接头的形态学特征。这种方法可以帮助确定突触发育的调节因子，这是神经生物学中的一个关键问题。该技术的主要优点是自动定量多个 NMJ 特征。

这允许客观分析高到推杆的 NMJ 形态。我们决定开发这种方法，以便能够研究大量疾病模型中的 NMJ 形态。我们想到了如何防止他们个人差异的方法，以及如何显著加快量化过程。

这种方法的可视化演示非常有帮助。适当的宏设置至关重要，某些步骤对于新用户来说可能很困难，尤其是在不熟悉 VT 软件时。对于该协议，生成 NMJ 的图像堆栈并将它们保存为单独的 TIFF 文件，其中通道 1 显示 DLG1 染色或类似标记，通道 2 显示 BRP 染色。

首先，创建 NMJ 图像文件的 C 投影和超级堆栈。打开插件选项并选择 Drosophila NMJ Morphometrics。现在，确定显微镜在将图像系列存储为 TIFF 时分配给图像系列的唯一文件字符串。

这将位于映像名称的末尾。将给定给最低平面和通道编号的字符串复制并粘贴到唯一的文件字符串设置窗口中。然后，选择子宏 convert to stack 并选择图像所在的目录或文件夹。

对于每个图像文件，将使用默认名称 stack 和 flat stack 创建两个新文件，后跟原始图像名称。然后可以删除原始文件以节省存储空间。接下来，从 Drosophila NMJ Morphometrics 界面中选择 define ROI 子宏，然后选择图像文件目录。

打开第一个投影时，选择手绘选区工具。然后使用鼠标定义一个包含感兴趣的完整 NMJ 末端的区域。选择后，在 define terminal 窗口中单击 OK。

继续执行此作，直到在所有投影中定义 NMJ 终端。宏会自动推进该过程。对于每个图像文件，将创建一个新文件，其默认名称为 ROI，后跟原始图像名称。

要量化 NMJ 特征，首先转到 Drosophila NMJ 形态计量学界面并设置比例。例如，如果图像中的一个像素对应于 0.72 微米，则将缩放像素设置为 1，将缩放距离设置为 0.072。然后选择子宏 analyze，如果有两个通道图像，还要切换权重。

按 OK 并在出现提示时选择图像文件目录。每个突触的处理时间可能为几分钟。分析后，每个分析的突触的新图像文件都存储在父文件夹中，定量测量就是结果。

txt 文件。检查所有图像并排除具有分割错误的图片。例如，突触末端的某些部分可能不包含在黄色轮廓中。

部分背景可能包含在突触末梢。蓝色骨架线可能延伸到突触末梢之外。活动区域可能过多，或者某些活动区域可能仍未被检测到。

如果超过 5% 的图像存在分割错误，请探索不同的分析算法来改进图像处理。接下来的视频部分将介绍如何定义其中的许多宏分析设置。要调整宏的滚动球半径值，请选择代表图像数据集的三个 NMJ Z 投影。

删除之前由 sub 宏 analyze 创建的结果 res image name 和两个活动区域堆栈 image name。打开每个选定图像的堆栈图像名称文件，然后从工具栏中选择"拆分通道"，以制作通道 1 的图像和通道 2 的图像，并保存这些文件。打开属于通道 1 的图像，在本例中对应于 DLG 1 Immuno 标记。

现在，运行滤镜 subtract background（位于"process"（进程）选项卡下）。将 rolling ball radius（滚动球半径）设置为增加突触和背景之间对比度的值。创建一个 Z 投影，投影类型为 max intensity 并保存图像。

然后，在所有 Z 投影上运行具有新滚动球半径的减去背景算法并保存结果。要确定宏的最佳 auto 阈值，请打开保存的 C 投影，然后使用 try all 选项运行 auto threshold。从生成的图像中，找到最适合图像的算法，并在为更多图像运行宏时继续使用该阈值设置。

定义不同的 auto 阈值，这对于宏正确分割图像至关重要。因此，要正确量化标牌参数中的 8 个，因此熟悉软件提供的 16 个自动阈值选项非常重要。按加号按钮可放大自动阈值的结果图像。

算法名称位于每个结果图像的下方。在此示例中，设置 NMJ 轮廓阈值的最佳自动阈值算法是 Huang。对于 skeleton threshold（骨架阈值），最佳设置为 Li，Active zone threshold（活动区域阈值）的最佳设置为 Huang。

要定义宏的精细最大噪声容差值，请返回到原始的代表性 NMJ 图像。打开 BRP 频道。转到弹出菜单中的插件选项卡，然后选择 maximum 3D。

片刻之后，将出现一张新图像，然后关闭原始图像。接下来，使用最小 3D 命令。然后关闭 C2 堆栈突触 1 图像的最大值，并选择新创建的图像 C2 堆栈突触 1 的最小值。

现在使用 find maxima 命令。在新窗口中，选择预览点选择，并将杂色容差设置为 50。然后用小十字表示最大点，它应该只覆盖突触活性区。

如果叉穿过多，请增加 noise tolerance 值。如果某些活动区域未被注释，请减小 noise tolerance 值。将派生的阈值用于宏的 find maxima noise tolerance 字段。

选择最大噪声容限值时，正确量化活动区域的数量非常重要。有时需要尝试不同的值来定义正确的值。现在，在宏界面中调整阈值算法中的所有派生值，并对最初用于定义宏设置的代表性图像运行子宏 analyze。

将创建一个新文件，其中活动区域由白点表示。通过将该文件拖放到工具栏中，然后选择 Z 项目（投影类型为一些切片）来打开此文件。因此，生成了一个投影文件。

下一步是调整阈值。在新的阈值窗口中，滑动上方的栏以选择一个阈值，在该阈值中读取所有所需的焦点。这些是 BRP 的积极点。

将此值用作 BRP puncta 下限阈值。现在，使用先前定义的值、算法和新的 BRP puncta 下限阈值对原始代表性 NMJ 图像重新运行分析。生成的图像应符合批判性分析的标准。

现在使用定义设置在相同条件下获得的所有 NMJ 图像上运行宏。果蝇 NMJ 形态计量学宏用于验证三种突变基因型中不同的已知突触缺陷。已知锚蛋白两种突变体具有融合的钮扣和较小的 NMJ。

使用宏观测量 panuronil 和 quirin 的面积和周长，两种 RNAI 敲低 NMJs，发现明显小于对照组。GTP 酶 Rab3 是 bruckpila 正确分布所必需的。当中断时，活动区域会减少。

使用宏观 panuronil Rab 3 击倒果蝇每个 NMJ 末端平均有 138 个活动区，而对照组中检测到 290 个。高线是 NMJ 生长的重要调节因子，当突变的 NMJ 在其末端扩展分支时。使用宏泛糖苷高丝 RNAI 敲除线显示其 NMJ 处的几个骨架衍生参数显着增加，包括总长度、最长分支长度、分支数和分支点数。

看完这个视频，你应该对如何作和调整果蝇 NMJ 形态计量学宏的设置有一个很好的了解。一旦掌握，可以在 1 小时内完成 50 个突触的分析。这为每个突触节省了大约 15 分钟的定量时间。

获取 NMJ 的高质量图像很重要。图像越好，宏的性能就越好。这项技术将帮助神经生物学领域的研究人员有效地量化果蝇 NMJ 的形态参数。